Ausarbeitung des Seminars: Metabolic Engineering mittels

Ausarbeitung des Seminars:
Metabolic Engineering mittels synthetischer kleiner RNA
Na, D., Yoo, S.M., Chung H., Park H., Park J.H. & Lee S.Y.
Metabolic engineering of Escherichia coli using synthetic
small regulatory RNAs. Nature biotechnology 31, 170-174
(2013).
Einleitung
Small regulatory RNAs (sRNAs) sind nicht-kodierende RNA-Moleküle, die von Bakterien produziert
werden. Es handelt sich bei ihnen um relativ kurze Transkripte der Länge 50-300 Nukleotide, von
denen einige an mRNA binden können, um deren Translation zu verhindern [2]. Die Produktion von
sRNA stellt damit eine Möglichkeit der Regulation der Translation in Bakterien dar [2, 3]. Damit dieser
Mechanismus funktioniert wird in einigen Gram-negativen Bakterien, wie zum Beispiel in E. coli ein
bestimmtes Protein, das RNA-bindende Protein Hfg, benötigt [2, 3]. Hfq hat dabei die Funktion, die
Bindung von sRNA und mRNA zu vereinfachen [3].
In dieser Veröffentlichung wurde versucht sich diesen Mechanismus der Regulation der
Genexpression durch sRNA zu Nutze zu machen, indem synthetische sRNA hergestellt wurde.
Anschließend wurde dieses System gezielt für das metabolische Engineering eingesetzt.
Design der sRNA
Für die Erstellung der synthetischen sRNA wurden zwei verschiedene Teile benötigt. Der erste Teil
war eine Scaffold-Sequenz, welche allgemein benötigt wird, damit das Hfq Protein binden kann. Der
zweite Teil war eine target-binding Sequenz, die dafür sorgt, dass die sRNA eine spezifische mRNA
erkennt und diese bindet.
Um herauszufinden, welche Scaffold-Sequenz für die sRNA verwendet werden sollte, wurden
zunächst alle 101 in E. coli bekannten sRNAs anhand von verschiedenen Kriterien überprüft (Folie 7).
Als erste Bedingung musste bei der sRNA die target-binding Sequenz identifiziert sein. Außerdem
musste die Hfq Bindungssequenz ebenfalls identifiziert sein und die sRNA durfte nur eine einzige
mRNA als Ziel haben. Diese Bedingungen wurden von drei potentiellen Kandidaten sRNAs erfüllt.
Dabei handelte es sich um MicC, MicF und SgrS.
Um aus diesen drei Kandidaten sRNAs den besten Kandidaten auszuwählen, wurde anschließend von
jeder dieser drei sRNAs das Potential für die Inaktivierung des Gens DsRed2 untersucht. Nur wenn
dieses Gen aktiv ist, kann eine Fluoreszenz gemessen werden, wodurch wiederum auf die Aktivität
des Gens geschlossen werden kann. Obwohl alle drei Scaffolds relativ gute Ergebnisse erzielten,
wurde letztendlich MicC als Scaffold ausgewählt, da das Ergebnis in diesem Fall besser war als bei
den beiden anderen Kandidaten- sRNAs (Folie 8).
Design der Zielbindungssequenz
Für das Design der target-binding Sequenz musste zunächst überlegt werden, an welche Region der
mRNA die sRNA binden sollte. Um dies herauszufinden, wurden unterschiedliche Anti-DsRed2
synthetische sRNAs entwickelt, die alle an unterschiedlichen Positionen der mRNA binden Dabei
wurde entweder komplett oder teilweise an die sogenannte Translationsinitiationsregion (TIR) oder
an komplett andere Regionen gebunden. Anhand der Ergebnisse konnte gezeigt, werden, dass
allgemein bei denjenigen Varianten die effektivste Repression auftrat, welche an die TIR gebunden
haben (Folie 10), weshalb dieses Konzept für das weitere Design der target-binding Sequenz
verwendet wurde.
Quantitativer
Zusammenhang
zwischen
Bindungsenergie
und
Repression
Als nächstes wurde untersucht, ob es durch das Systems der Genregulation mit Hilfe von sRNAs
allgemein möglich war verschiedene Stärken an Repression zu erreichen. Zu diesem Zweck wurde die
Zielbindungssequenz der anti-DsRed2 sRNA randomisiert, also zufällig mutiert, um unterschiedliche
Varianten mit verschiedenen Bindungsenergien zu erhalten. Für jede dieser Varianten wurde
anschließend erneut die Fluoreszenz und damit die Stärke der Repression gemessen. Dabei konnte
festgestellt werden, dass ein linearer Zusammenhang zwischen der Bindungsenergie und der
Repression vorliegt (Folie 11), weshalb eine Feineinstellung der Repression durch eine Änderung der
Bindungsenergie möglich war.
Tyrosin Produktion in E. coli
Das entwickelte sRNA System, wurde anhand mehrerer Anwendungen getestet. Die erste
Anwendung war die Optimierung der Tyrosinproduktion in E. coli. Zu diesem Zweck wurden 14
verschiedene E. coli Stämme untersucht. In diesen Stämmen waren bereits einige Gene
überexprimiert (Folie 12). Zusätzlich wurde nun in jedem dieser Stämme sRNA gegen bestimmte
Gene synthetisiert. Dabei wurde immer sRNA gegen das Gen tyrR in Kombination mit sRNA gegen
eines der Gene pgi, csrA oder ppc verwendet und anschließend der Tyrosintiter ausgewertet (Folie
13). Zusätzlich wurden für die Kombination anti-tyrR und anti-pgi drei verschiedene Varianten von
anti-pgi mit jeweils unterschiedlichen Bindungsenergien verwendet. Diese Unterscheidung wurde
durchgeführt, da bei der Standardvariante anti-tyrR + anti-pgi keine Verbesserung im Vergleich zur
Kontrolle ohne sRNA zu beobachten war (Folie 13), was vermutlich darauf zurückzuführen war, dass
bei einer zu starken Repression von pgi das Wachstum zu stark eingeschränkt wurde, da der Fluss
durch die Glykolyse und den Citratzyklus zu gering wurde. Die zwei Varianten der Kombination antityrR + anti-pgi zeigten zwar eine Verbesserung des Tyrosintiters im Vergleich zur Kontrolle, aber das
beste Ergebnisse erzielte die Kombination anti-tyrR und anti-csrA im Stamm S17-1 (Folie 13). Hier
konnte ein Tyrosintiter von 2 g/L gemessen werden.
Um die produzierte Menge an Tyrosin weiter zu erhöhen, wurde in einem nächsten Schritt die
Bindungsenergie der anti-csrA sRNA optimiert. Dabei konnte gezeigt werden, das bei einer
Bindungsenergie von -39,2 kcal/mol die höchste relative Tyrosinproduktion erreicht werden konnte
(Folie 14).
Cadaverinproduktion in E. coli
Das zweite Anwendungsbeispiel war die Cadaverinproduktion in E. coli. In diesem Fall wurde
zunächst wieder die selbe Prozedur wie bereits bei der Tyrosinproduktion durchgeführt. Das heißt als
erstes wurde erneut sRNA gegen Gene entwickelt, deren Repression vorteilhaft für die
Cadaverinproduktion sein könnte. Dabei wurden acht sRNAs untersucht, wobei anti-murE sRNA das
beste Ergebnis erzielte und den Cadaverintiter auf 2,15 g/L erhöhte (Folie 15). Zusätzlich wurde auch
in diesem Beispiel eine Feineinstellung durch Untersuchung verschiedener Bindungsenergien
durchgeführt,
wobei gezeigt
werden konnte, dass die Cadaverinproduktion bei einer
Bindungsenergie von -40,2 kcal/mol am höchsten war (Folie 15).
Ein neuer Aspekt, der in diesem Beispiel untersucht wurde, war die anschließende Durchführung
einer Identifikation von target Genen in großem Maßstab. Dabei wurden anstatt von nur 5
ausgewählten Genen 122 Gene aus den unterschiedlichsten Stoffwechselwegen ausgewählt, die
nicht unbedingt direkt mit der Cadaverinproduktion in Verbindung gebracht werden konnten. Gegen
diese 122 Genen wurden anschließend 122 sRNAs synthetisiert. Anhand der Ergebnisse konnte
gezeigt werden, dass abgesehen von der bereits bekannten anti-murE sRNA auch der Einsatz von
anti-ackA und anti-pdhR sRNAs zu einer Erhöhung des Cadaverintiters von 40,2 % bzw. 31,4 % führte
(Folie 16, 17). Anhand dieses Ergebnisses zeigt sich damit ein entscheidender Vorteil einer
Untersuchung von target Genen im großen Maßstab. Dadurch, dass sehr viele Gene untersucht
werden, können auch solche gefunden, bei denen man zunächst keinen Einfluss auf die Produktion
eines bestimmten Produktes erwartet hätte. In diesem Fall hättet man beispielsweise nicht
unbedingt vorhergesehen, dass die Repression des Gens ackA, welches nicht direkt im Cadaverin
Produktionsstoffwechselweg liegt, einen Einfluss auf die Produktion von Cadaverin hatte. Ein
weiterer Vorteil der Genregulation mit Hilfe von sRNAs ist außerdem, dass auch essentielle Gene, wie
in Folie 16 gezeigt, untersucht werden können, da die Genexpression in der Regel nur abgeschwächt
und nicht völlig ausgeschaltet wird.
Fazit
Die in dieser Veröffentlichung vorgestellte Strategie der Regulation der Genexpression durch sRNA
konnte für das Metabolic Engineering von Bakterienstämmen und für die Identifikation von target
Genen in großem Maßstab eingesetzt werden. Zusätzlich war es bei dieser Strategie möglich eine
weitere Optimierung der Produktion zu erreichen, indem eine Feineinstellung der Repressionsstärke
über eine Änderung der Bindungsenergie durchgeführt wurde.
Literatur
[1] Na, D., Yoo, S.M., Chung, H., Park, H., Park, J.H. & Lee, S.Y. Metabolic engineering of Escherichia
coli using synthetic small regulatory RNAs. Nature biotechnology 31, 170-174 (2013).
[2] Storz, G., Vogel, J. & Wassarman, K.M. Regulation by Small RNAs in Bacteria: Expanding Frontiers.
Molecular Cell 43, 880-891 (2011).
[3] Gottesman, S. The small RNA regulators of Escherichia coli: Roles and mechanisms. Annu. Rev.
Microbiol. 58, 303–328 (2004).
[4] Pichon, C., du Merle, L., Caliot, M.E., Trieu-Cuot, P. & Le Bouguénec, C. An in silico model for
identification of small RNAs in whole bacterial genomes: characterization of antisense RNAs in
pathogenic Escherichia coli and Streptococcus agalactiae strains. Nucleic Acids Res. 40, 2846–2861
(2012).

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