定期的運動による動脈硬化症予防の新規分子メカニズムの解明

（81）
第 30 回若手研究者のための健康科学研究助成成果報告書
2013 年度 pp.81∼86（2015.4）
定期的運動による動脈硬化症予防の新規分子メカニズムの解明
奥津光晴＊
MOLECULAR MECHANISMS IN EXERCISE TRAININGINDUCED ATHEROPROTECTION
Mitsuharu Okutsu
Key words: exercise training, atherosclerosis, autophagy.
緒　言
ことで予防が期待できる。近年注目されている蛋
白質分解システムであるオートファジーは、不要
我が国の死因の第 1 位は悪性新生物、第 2 位は
な蛋白質を素早く分解することで生体の恒常性を
心疾患、第 3 位は肺炎、第 4 位は脳血管疾患であ
維持しており5）、オートファジー不全は代謝性疾
る4）。しかし、動脈硬化性疾患を基盤とする心疾
患や骨格筋萎縮などのさまざまな疾患に関連する
患と脳血管疾患の死因の合計は、悪性新生物の死
ことが報告されている3,7）。しかしながら、運動に
因に匹敵することから、動脈硬化症の発症機序の
よる動脈硬化症予防の分子メカニズムについて、
解明と予防方法の確立は急務である。定期的運動
大動脈のオートファジーに着目した報告はない。
は、動脈硬化症などの循環器系疾患の予防に効果
そこで本研究では、運動トレーニングによる動脈
があることが近年の運動介入研究や疫学調査によ
硬化症の抑制と大動脈のオートファジーとの関連
り報告されている
について検討した。
。動脈硬化症の予防を目的と
1,9）
した運動プログラムの開発は、健康寿命の延伸や
研究方法
医療費削減の観点からも重要な課題であるが、運
動が動脈硬化症を予防する分子メカニズムを解明
Ａ．実験動物
し効果的な運動プログラムの開発を試みた報告は
8 週齢の雄性アポリポプロテイン E 欠損マウ
少ない。
スを日本エスエルシーより購入し実験に使用し
動脈硬化症は、血管内皮細胞や血管平滑筋が酸
た8）。本研究で遂行した動物実験は、名古屋市立
化ストレスや炎症性サイトカインにより損傷を受
大学動物実験倫理委員会の承認の下で実施された
け、単球やマクロファージなどの免疫細胞が大動
脈の損傷部位から産生される細胞誘導因子により
（承認番号：H26M-32）。
Ｂ．飼育条件
損傷部位に集積し、血管内皮細胞下へ浸潤後、酸
購入したマウスは、 1 週間の予備飼育後、体重
化 LDL など取り込み泡沫化することで発症する。
が均等になるよう運動トレーニング（Ex）群と
したがって、動脈硬化症は損傷した血管内皮細胞
安静（Sed）群の 2 群に分けた。Ex 群は自発走行
や平滑筋を素早く排除し、正常な血管を構築する
運動装置（MED 社）を設置した飼育ケージにて
＊名古屋市立大学大学院システム自然科学研究科 Graduate School of Natural Sciences, Nagoya City University, Nagoya, Japan.
（82）
16週間飼育した。その間、Sed 群は運動装置を設
tor-activated receptor-γ coactivator 1α（PGC-1α）、
置していない Ex 群と同じサイズの飼育ケージに
manganese superoxide dismutase（MnSOD）、LC3、
て通常飼育した。マウスの運動パターンと走行距
Atg7、Becli-1および p62を使用した。また、内因
離は専用の解析ソフトにて解析した。餌は45％の
性コントロールとして β actin を使用した。一次
脂肪を含有する高脂肪食（Research Diet）を自由
抗体反応終了後、それぞれの一次抗体に対応した
摂取させた。体重と摂餌量は毎週計測した。
horseradish peroxidase 標識された二次抗体にてイ
Ｃ．検体採取
ンキュベーションした後、化学発光検出試薬にて
運動トレーニング期間終了後、マウスをイソフ
発色しルミノイメージアナライザ（LAS3000mini，
ラン麻酔下で採血し頸椎脱臼にて安楽死させた。
GE）で観察した。
Ｅ．動脈硬化層の評価
安楽死後、生理食塩水を環流し体内に残留した血
液をすべて取り除き、胸部大動脈、心臓および足
動脈硬化層の評価は、OCT コンパウンドに包
底筋を採取した。採取した血液は、遠心分離にて
埋した検体の大動脈弁が観察できる部位を薄切後
血清を単離しコレステロールとサイトカインの濃
オイルレッド O にて染色し、光学顕微鏡に接続
度の測定に使用した。胸部大動脈と足底筋は、解
したデジタルカメラ（DS-Fi2，Nikon）を用い撮
剖直後に蛋白解析用の溶液にてホモジネイトし蛋
影後、動脈硬化層を ImageJ にて計測した。
Ｆ．コレステロールの測定
白の発現の評価に使用した。心臓は、 4 ％パラ
フォルムアルデヒドに一晩浸しスクロールにて置
血中コレステロールの測定には高速液体クロマ
換した後、OCT コンパウンドに包埋し動脈硬化
トグラフィーを使用した。
Ｇ．サイトカインの測定
層の評価に使用した。
Ｄ．骨格筋および大動脈の蛋白発現の評価
血中サイトカインの測定には Proteome Profiler
蛋白の発現の評価にはウェスタンブロット法を
Antibody Arrays（R&D）を使用した。
Ｈ．統計解析
使用した。 8 ％と12％のポリアクリルアミドゲル
を作成後、ウェスタンブロットに使用する骨格筋
各項目の測定結果は平均値±標準誤差で表した。
と胸部大動脈の検体をポリアクリルアミドゲルに
各項目の測定結果の群間比較は対応のない t 検定
ロードし十分に分離されるまで泳動した。泳動
を使用し、有意水準 P < 0.05以下を有意とした。
後、PVDF メンブレンに転写し 5 ％スキムミルク
結　果
にてブロッキングした。ブロッキング後、評価す
Ａ．自発運動走行距離、体重および摂餌量
る蛋白の一次抗体にてメンブレンをインキュベー
ションした。使用した一次抗体は、Myosin heavy
自発運動は野生型のマウス同様に暗期に走行し
chain（MHC）IIa、MHCIIb、Peroxisome prolifera-
明期に休息しており（図 1 A）、運動トレーニン
800
600
400
200
0
0
2
Day
4
6
30000
20000
10000
0
D
50
Body weight (g)
1000
C
40000
5
10
wks
15
40
Sed
Ex
40
30
20
***
0
4
8 12 16
wks
Food intake (g/week)
B
: Dark period
: Light period
Running activity (counts/day)
Running activity (counts/5min)
A
***
35
30
25
20
Sed
Ex
図 1 ．自発運動、体重および摂餌量の比較
Fig.1．Voluntary exercise training, body weight and food intake in sedentary
（Sed）and exercise-trained
（Ex）apolipoprotein E deficient mice.
A: Representative running activity recording. B: Voluntary exercise activity. C: Change of body weight during 16 weeks
of intervention. D: Food intake. Results are represented as means ± SE
（n = 8-14/group）
. ***P < 0.001.
（83）
A
B
MHCIIa
***
250kd
10
5
0
PGC-1α
100kd
MnSOD
25kd
β-actin
37kd
Fold change
15
MHCIIb
Sed
***
1.0
0.5
Sed
0.5
Sed
**
1.5
1.0
0.5
0.0
Ex
Ex
MnSOD
2.0
1.5
0.0
***
1.0
0.0
Ex
PGC-1α
2.0
MHCIIb
1.5
Fold change
MHCIIa
Fold change
250kd
Sed Ex
Fold change
20
Sed
Ex
図 2 ．運動による骨格筋蛋白の発現変化
Fig.2． Immunoblot analyses for fiber-type, PGC-1α and MnSOD protein in
plantaris muscles of sedentary（Sed）
and exercise-trained
（Ex）apolipoprotein
E deficient mice.
A: Representative immunoblot images of MHCIIa, MHCIIb, PGC-1α, MnSOD
and β-actin. B: Quantification of MHCIIa, MHCIIb, PGC-1α and MnSOD. Results are represented as means ± SE
（n = 5/group）
. **P < 0.01, ***P < 0.001.
Sed
B
Ex
Mean lesion area（x104µm2）
A
*
50
40
30
20
10
0
Sed
Ex
図 3 ．動脈硬化層の比較
Fig.3． Atherosclerotic plaque lesions in sedentary（Sed）and exercisetrained
（Ex）apolipoprotein E deficient mice.
A: Representative Oil red O stained sections of atherosclerotic lesions. B:
Quantification of atherosclerotic lesion area. Results are represented as
means ± SE（n = 3/group）
. *P < 0.05.
Sed
Ex
20
10
0
Sed
Ex
800
VLDL-C (mg/dl)
500
LDL-C (mg/dl)
1000
0
200
30
HDL-C (mg/dl)
Total (mg/dl)
1500
150
100
50
0
Sed
Ex
600
400
200
0
Sed
Ex
図 4 ．血中コレステロールの比較
Fig.4．Serum cholesterol concentration in sedentary
（Sed）and exercise-trained
（Ex）apolipoprotein E deficient mice.
Results are represented as means ± SE
（n = 5/group）
.
（84）
A
B
*
Sed
Ex
IL-1ra
Reference
Fold change
1.5
1.0
0.5
0.0
Sed
Ex
図 5 ．血中サイトカインの比較
Fig.5． Immunoblot analyses for cytokine in serum of sedentary（Sed）and exercise-trained（Ex）apolipoprotein E deficient mice.
A: Representative immunoblot images of IL-1ra and reference.
B: Quantification of IL-1ra. Results are represented as means
± SE（n = 3/group）. *P < 0.05.
LC3-I
LC3-II
Atg7
β-actin
37kd
0.5
Sed
0.5
0.0
Sed
Ex
1.5
0.5
1.5
1.0
LC3-I
1.0
0.0
Ex
Atg7
1.5
Fold change
Beclin-1
50kd
1.0
0.0
p62
50kd
75kd
1.5
Fold change
15kd
LC3
P = 0.06
Sed
Beclin-1
0.5
0.0
Sed
*
0.5
Sed
Ex
Ex
p62
1.5
P = 0.07
1.0
LC3-II
1.0
0.0
Ex
Fold change
Sed Ex
Fold change
1.5
Fold change
B
Fold change
A
1.0
0.5
0.0
Sed
Ex
図 6 ．大動脈のオートファジー関連蛋白の発現の比較
Fig.6．Immunoblot analyses for autophagy protein in aorta of sedentary（Sed）
and exercise-trained
（Ex）apolipoprotein E deficient mice.
A: Representative immunoblot images of LC3-I, LC3-II, Atg7, Beclin-1, p62 and β-actin. B: Quantification of
LC3-I, LC3-II, Atg7, Beclin-1, p62. Results are represented as means ± SE
（n = 5/group）
. *P < 0.05.
グ期間中の走行距離は低下する傾向を示した（図
よび MnSOD の発現は Sed 群に比べ有意に高く、
1 B）
。体重は、Sed 群、Ex 群ともに増加したが、
MHCIIb の発現は有意に低かった（図 2 A・B）。
増加率は Ex 群のほうが Sed 群よりも有意に低
Ｃ．動脈硬化層の評価
かった（図 1 C）。摂餌量は、Ex 群のほうが Sed
運動トレーニングによる動脈硬化症の抑制を確
群よりも有意に多かった（図 1 D）
。
認するため、大動脈を Oil red O にて染色し Ex 群
Ｂ．運動トレーニングの評価
と Sed 群の動脈硬化層の形成を比較した。その結
本研究で使用した自発走行運動モデルが適切な
果、Ex 群の大動脈硬化層は Sed 群に比べ有意に
トレーニングモデルであることを確認するため、
小さかった（図 3 A・B）。
運動トレーニングにより変動することが知られて
Ｄ．コレステロールの評価
いる骨格筋の蛋白の変動を評価した。その結果、
コレステロールは動脈硬化層の形成を促進する
先行研究と同様
一因であるため、Ex 群と Sed 群の血中コレステ
、Ex 群の MHCIIa、PGC-1α お
6,10）
（85）
ロール濃度を比較した。その結果、Ex 群の total
イトカインが変動したものの、大動脈のオート
cholesterol、LDL および VLDL は Sed 群に比べ低
ファジーは骨格筋とは異なる変化を示したことか
い傾向を示したが有意差はなく、HDL に違いは
ら、サイトカイン以外のオートファジーを調節す
なかった（図 4 ）
。
る因子の存在が考えられる。骨格筋は、運動によ
Ｅ．サイトカインの評価
る伸縮などの物理的刺激を受けるが血管平滑筋の
血中サイトカインは、測定した40項目のうち
物理的刺激は骨格筋に比べ小さいことから、物理
IL-1ra が最も顕著な違いを示し、Ex 群は Sed 群
的刺激に対する細胞内情報伝達経路の活性化が
に比べ48％低かった（図 5 ）
。
オートファジーを調節する因子である可能性があ
Ｆ．オートファジー蛋白の変動
る。今後、運動によるオートファジーの変動を調
大動脈のオートファジーの変動を検討するた
節する細胞内情報伝達経路の解明が必要である。
め、動脈硬化層が形成されやすく解析に十分な組
本研究では、採取した大動脈をホモジネイトし
織量がある胸部大動脈を用い、オートファジー蛋
ウェスタンブロットに使用した。大動脈は主に血
白である LC3、Atg7および Beclin-1とオートファ
管内皮細胞と血管平滑筋から構成されているが、
ジーによる分解の指標となる p62の発現をウェス
本研究で観察されたオートファジーの変化は血管
タンブロットにて測定し Ex 群と Sed 群で比較し
内皮細胞と血管平滑筋のどちらの現象かを解明す
た。その結果、Ex 群の LC3-II は Sed 群に比べ有
ることができなかった。マウスから採取できる血
意に低かった。Atg7と Beclin-1は低い傾向を示す
管内皮細胞は少なくウェスタンブロットは困難な
ものの有意差はなかった。また、オートファジー
ため微量でも評価が可能な mRNA の発現による
蛋白は低下するが p62は変化しなかったことか
検討を計画したが、マウス動脈からの血管内皮細
ら、単なるオートファジー蛋白の増加ではなく
胞の分離は費用がかかることが判明し予算不足か
オートファジーによる分解が抑制されたことを示
ら遂行できなかった。また、免疫組織化学染色に
した（図 6 A・B）
。
よりこれを補うことができると考え実施したが、
考　察
良い染色像を得ることができなかった。今後、新
たな予算獲得や実験手法を工夫するなどにより、
本研究は、定期的運動はオートファジーを促進
運動によるオートファジーの変動がどこで起きた
することで機能低下した大動脈の血管内皮細胞や
かを詳細に検討する必要がある。
平滑筋細胞を排除し、正常な細胞を補充すること
総　括
で大動脈の恒常性を維持し動脈硬化症を予防する
と仮説を立て検証した。その結果、運動トレーニ
運動トレーニングによる動脈硬化症の抑制は、
ングは動脈硬化症を軽減したが、仮説とは異なり
大動脈のオートファジーの抑制が関与する可能性
大動脈のオートファジーは抑制された。先行研究
がある。
では、定期的な運動が骨格筋のオートファジーを
促進し、骨格筋の代謝機能を改善することや持久
的運動能力を向上することが遺伝子改変動物を用
いた研究により立証されている2,6）。本研究では、
謝　辞
本研究の遂行に対し多大な助成を賜りました公益財団
法人明治安田厚生事業団に深く感謝申し上げます。また、
MHCIIa および MHCIIb 抗体を供与いただきました東京大
大動脈の恒常性が改善されたにもかかわらずオー
学大学院医学系研究科附属疾患生命工学センターの秋本
トファジーは抑制されたことから、運動トレーニ
崇之先生とご協力いただきました先生方に心よりお礼を
ングによる大動脈の恒常性維持は、オートファ
ジーを抑制することが一因である可能性を示唆し
ている。
申し上げます。
参考文献
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