ImageQuant TL（ver.8.1）操作手順（PDF）

ImageQuant TL (ver.8.1)
操作手順
71-3563-33
ImageQuant TL 操作手順書
ImageQuant TL の各モジュールの使い方を、実際の解析の流れに沿ってご紹介します。
目次
1. ソフトウェアの起動
1 ページ
2. 解析の準備（画像の切り出しと回転・コントラスト調整・拡大/縮小）
４ページ
3. バンドボリューム解析 - Analysis Toolbox
11 ページ
4. 1D ゲル解析 - 1D gel analysis
①
オートマチック解析（レーン作成・バックグラウンド削除・バンド検出）
19 ページ
②
ステップワイズ解析（レーン作成）
2２ページ
③
ステップワイズ解析（バックグラウンド削除）
2６ページ
④
ステップワイズ解析（分子量測定）
3０ページ
⑤ ステップワイズ解析（バンド定量・標準化）
３２ページ
5. コロニーカウンティング - Colony Counting
３６ページ
6. アレイ解析 - Array analysis
４０ページ
7. イメージの重ね合わせ
① ImageQuant TL ver. 8.0
４６ページ
② ImageQuant TL ver. 7.0 以前
5０ページ
ImageQuant TL は以下 4 モジュールで構成されています。
モジュール
1D gel analysis
用途
1 次元電気泳動の画像に対し、自動でバンドやレーンの認識・バックグラウンドの削除を
行い、分子量計算やノーマライズを行うことができます。
Analysis Toolbox
バンドの認識、バックグランドの削除により、バンド間の比較解析ができます。
Colony Counting
大腸菌のコロニーや二次元電気泳動サンプルのスポット数を検出・定量ができます。
Array analysis
タイタープレートやスロットブロットなど、規則的なパターンのサンプルの定量ができます。
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1. ソフトウェアの起動
1) ソフトウェアを起動します。デスクトップの ImageQuant TL アイコンをダブルクリックします。
2) コントロールセンターが表示されます。解析に使用するモジュールを選択します。
例として”1D gel analysis”を選択します。
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3) デモデータ、もしくは前回開いていた画像が表示されます。解析する画像を開くには‘Open'ボタ
ンをクリックして画像ファイルを選択します。ここでは、1D_norm.tif を例に選択します。
デモ画像は、C:/Documents and Settings /All Users/Application Data/GE
Healthcare/ImageQunat TL/Images (Windows XP)もしくは C:\ProgramData\GE
Healthcare\ImageQuant TL\Images (Windows 7) にあります。
4) インターフェースは以下の 4 つのパートに分かれています。
4 つのパートが表示されない場合は、Windows メニューより、’Arrange all windows’を選択しま
す。
1 - ナビゲーター: 実行画面とパラメーター調節およびインストラクションの表示
2 - Image Window
3 – Lane Profile Window
4 - Measurements Window（Area Window）: 計算結果の表示
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4
3
×ボタンでウィンドウを閉じた場合には、左下のアイコンで再び開くことができます。
ウィンドウのサイズを元に戻すには、Windows メニューより、’Arrange all windows’を選択しま
す。
2. 解析の準備（画像の切り出しと回転・コントラスト調整・拡大/縮小）
1) ‘Edit Image’ボタンをクリックすると、画像の編集が可能になります。イメージエディターに画像が
表示され、切り出しや回転を行うことができます。
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2) 必要に応じて画像を切り出します。1D ゲル解析を行う場合、ゲルの端やその他ノイズとなるよう
なエリアが含まれると、正しく認識されません。アイコンを矢印にして、切り出したい範囲を指定し
ます。
3) Image メニューから’Crop to area’を選ぶと、切り出した画像が表示されます。
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4) 電気泳動パターンが斜めになっている場合は、’Freeform Rotate’ボタンを押して画像を回転さ
せる事が可能です。
5) 格子が表示されます。レーンの向きにあわせて、格子をドラッグし回転させます。
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6) 格子と連動して画像も回転します。
7) Image メニューから 90 度回転や、反転させることも可能です。画像の編集が終わったら’Save as’
を選択して保存します。オリジナル画像とは別名で保存してください。
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8) 編集後の画像を、’Open’ボタンを押して、開きます。
9) 画像のコントラストを調節します。ツールバーの’Contrast’ボタンを押すと、ピクセルのシグナル強
度（濃さ）のヒストグラムが表示されます。横軸は色の濃淡を、縦軸は各濃度のピクセル分布を示
しています。二つのスライダーの両端に小さな三角形があります。
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10) 画像を濃く表示する場合は、右側の三角形もしくはスライダーを左へドラッグさせます。スライダ
ーの間でグレースケールが決められています。
11) 薄いバンドを見たいときは、右のスライダーを左に寄せます。同様に、左のスライダーを右に寄せる
と、画像は白く（明るく）なり、バックグラウンドを低く表示できます。
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12) 元のイメージに戻したい場合は、右にある’Defaults’ボタンをクリックします。コントラストを変えて
も、数値情報（バンドボリューム）が変わることはありません。コントラストの調整は解析中にいつ、
何度行っても問題ありません。
13) イメージを拡大するには、Image Window の左上にある虫眼鏡ボタンをクリックして、拡大したいと
ころをクリック&ドラッグします。
画像を元のサイズにもどすには、”Zoom 1 To 1”もしくは、”Zoom To Fit“のボタンを押します。
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3. バンドボリューム解析 - Analysis Toolbox 1) コントロールセンターの Analysis Toolbox を選択します。
2) P3 の(3)と同様、‘Open’ボタンをクリックして画像を開きます。
ここでは例として、“1d_Basic.tif”を選択しています。
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3)
‘Shape Definition’ボタンをクリックします。次のスライドの画面に切り替わります。
画像の拡大、縮小、コントラスト調整は、p5 の解析の準備を参照して下さい。
4) ナビゲーターの左上の’Rectangle’ボタンをクリックし、選択します。
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5) 画像上でバンドをドラッグで囲みます。マウスを放すと、Area Window でその枠に含まれる数値
が数値化されます。
6) 検出枠のコピーは、カーソルを“Selector”（矢印）にして、対象となる検出枠を選択し右クリックで’
Copy’、’Paste’を行います。検出枠を選択後、ドラッグさせる事で枠を移動させる事も可能です。
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7) 検出枠の名前は、Area Window の Name 列に直接入力して書き換えることができます。
8) 特定の検出枠を削除するには、Selector で枠を選択し、右クリックから Delete を選びます。
検出枠全てを削除を削除する際には、’Clear’アイコンをクリックします。
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9) 検出枠を設定後、必要に応じてバックグラウンドを削除します。ナビゲーターの’Next’ボタンをク
リックして、バックグラウンドの設定画面を表示します。
10) ナビゲーターの左上の’Rectangle’（四角）ボタンをクリックし、図中の枠“１０”（赤点線）のよ
うにバックグラウンド領域を指定します。
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11) カーソルを’Selector’（矢印）にして、バンドの枠を囲んで全て選択します。ナビゲーターの’
Parameter タブ’からバックグラウンドの引き方を設定します。バックグラウンド領域を指定した場
合は’Image rectangle/Ellipse’のボタンを選択し、プルダウンから’10’（指定領域）を選択し、
Subtract をクリックします。Volume 列にバックグランドが差し引かれた数値が表示されます。
バックグランドは、指定した領域のシグナル強度の平均値 x バンドの面積です。
12) 右から 2 番目のバンドのようにバックグラウンドが濃い場合、バックグランドを再設定が可能です。
ナビゲーターの’Rectangle’ボタンを押して、濃いレーンで図の枠’11’のようにバックグラウンド
を再指定します。
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13) カーソルを’Selector’（矢印）にして、計算しなおすバンド枠’8’を選択します。ナビゲーターの’
Parameter’で’Image rectangle/Ellipse’のボタンを押し、’11’を選択します。このようにバンド
個々に異なるバックグラウンドを指定する事が可能です。
14) Area Window の表示項目を変更する場合は、ツールバーの’Options’をクリックし、ダイアログボ
ックスを表示させます。Table タブの必要な項目を選択し Area Window に表示させます。
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15) Area Window に表示される数値は txt もしくは csv 形式でエクスポートが可能です。Area
Window をアクティブにし、Edit メニューから’Export to File’を選択し、ファイルを保存します。
16) 画像は解析情報と共に bit map image でエクスポートする事が可能です。Edit メニューから’
Export to File’を選択し、任意の DPI 値を指定してファイルを保存します。
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4. 1D ゲル解析 – 1D gel analysis –
①オートマチック解析（レーン作成・バックグラウンド削除・バンド検出）
1) コントロールセンターの’1D gel analysis’を選択します。
2) 画像の拡大、縮小、コントラスト調整は、p5 の“解析の準備”を参照して下さい。下記の表示にな
らない場合は、ナビゲーターの’Restart’ボタンを押して下さい。
はじめに’Automatic 解析‘を行います。
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3) ‘Automatic’を押すと、解析ステップの次の 3 つのアクションが実行されます。
1 - レーン作成
2 - バックグラウンド削除
3 - バンド検出
＊電気泳動の乱れなどにより、’Automatic’解析が機能しない場合は、’Stepwise’解析(p22)を
行います。
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2
3
4) 解析結果は Measurements Window に表示されます。次の 3 つのタブがあります。
1 - Selected Lane: 選択している（緑で表示)レーンのバンド情報
2 - All Lanes: 全てのレーンのバンド情報
3 - Comparisons: 同じ移動度のバンドの全レーンにおける比較情報
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5) Measurements Window の最大化ボタンを押すと、Measurements Window だけが表示されま
す。デフォルトのウィンドウ表示に戻したい場合には、Window メニューの’Arrange windows’を
選択します。
17) Measurements Window の表示項目を変更する場合は、ツールバーの’Options’をクリックし、ダ
イアログボックスを表示させます。Table タブの必要な項目を選択し Measurements Window に
表示させます。
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②ステップワイズ解析（レーン作成）
1) Automatic 解析で行ったレーン作成、バックグラウンド削除、バンド検出の 3 つのステップをマニュ
アルで行います。はじめにレーン作成を行います。’Stepwise’ボタンを押します。
2) ‘Select edit mode’から’Create Lanes’を選択し’Manual’ボタンを押します。‘Parameters’タブ
内にそれぞれ適切な数値を入力します。’Numbr of Tiers“はゲルを分割する際に使用します。こ
こでは、1 とします。’Number of Lanes’にレーン数を入力します。この場合は 11 レーンと入力し
ます。’Lane % width’はレーン幅とレーン間の間隔の割合を足して 100%としたときのパーセンテ
ージです。ここでは 95%と設定します。
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4
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6 7
8
9
10 11
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3) 左端のレーンの左上(泳動開始点)から右端レーンの右下（泳動終点）までの範囲をドラッグで指
定します。’失敗したら、’Clear’ボタンで消して再度行います。
4) レーンがスマイリング（曲がっている）を起こしている場合には、認識エリアをスマイリングに合わせ
て補正することが可能です。’Select edit mode’を’Create Lanes’から’Edit Multiple Lanes’を
選択します。
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5) ‘Bend/Resize Lane Box’を選択し、枠の 4 隅のポイントをドラッグします。枠とレーンをあわせま
す。このイメージの場合、すそ広がりのカタチにあわせます。左クリックで変曲点を作成し、右クリッ
クで削除します。（変曲点は四隅の角では作成できません）
6) スマイリングがひどい場合には、泳動先端のライン上でクリック&ドラッグしてカーブをつけること
ができます。変曲点を削除したい場合には、ポイント上で右クリックしてます。
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7) Edit Single Lane モードにすると、各レーンごとに’Bend/Resize’で幅を変更や、’Move’で移動さ
せることが可能です。
8) 全レーンの設定終了後、‘Next’ボタンを押してバックグラウンド削除に進みます。
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③ステップワイズ解析（バックグランド削除）
1）
レーン上にあるレーンナンバーをクリックすると、そのレーンのプロファイルのデンシトグラムが右の
ウィンドウに表示されます。レーンプロファイルは横軸が移動度、縦軸がシグナル強度として表示
されています。
2）
バックグラウンド削除方法は’Parameters’タブ内の Background method から選択可能です。
推奨される method は’Rolling ball’です。’Radius’で設定した半径のぼーるがレーンプロファイ
ルの下側を転がるときの軌跡をベースラインとします。
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3）
‘Subtract’をクリックすると、紫色のベースラインがすべてのレーンプロファイル下に表示されま
す。’Next’ボタンを押して、’Band Detection’（バンド検出）に進みます。
④ステップワイズ解析（バンド検出）
1）
‘Detect’アイコンをクリックしてバンドを検出します。
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2）
Minimum slope’のバーはバンド検出の感度を決めます。Slope とはプロファイル中のカーブの立
ち上がりの角度を示します。
3）
角度を上げると、バンド検出感度が下がります。濃度の低いバンドが検出されなくなります。適
切な感度でバンド検出の後、マニュアルで編集します。
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4）
バンドを追加するには、レーン上で左クリックします。この操作は画像、レーンプロファイルのどちら
でも設定可能です。
5）
右クリックでバンド認識を消去することが可能です。複数のバンドを消去する際は、右クリックで
ドラッグし、対象バンドを含む領域を指定します。
全てのバンド認識を消去するには、’Clear’ボタンを押します。
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⑤ステップワイズ解析（分子量測定）
1) バンド検出が終了したら’Next’ボタンを押し、分子量の測定を行います。
‘Molecular Size Calibration’ボタンを押して、分子量マーカーのバンド位置を元に、他のレーンの
バンドの分子量を測定します。
GE ヘルスケアから販売しているマーカーの各バンドの分子量情報は既に登録されています。Full
Range Rainbow Marker（RPN800E）の場合には、’ECL Plex Rainbow’を選択します。マーカーを
新たに追加するには、’Edit’ボタンからマーカー情報の登録が可能です。
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2) Image Window からマーカーレーンのレーン番号の青い四角を選択します。青い四角が赤くなり、
分子量を示す黄色い線がイメージ上に表示されます。ゲルの両端に同じマーカーのレーンがあれ
ばそのレーンもクリックします。バンドと分子量値を編集するには、バンド上のポイントをドラッグし
ます。
3) Curve Type（曲線の種類）から’Linear Log Curve’を選択し、’Compute’ボタンを押します。
‘MW Curve’に検量線が作成され、各バンドの分子量が計算されます。
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4) Measurements Window で赤く表示されているのは、分子量測定曲線上で最も高分子/低分子
バンドの外に位置するバンドです。
⑥ステップワイズ解析（バンド定量・標準化）
1) 次にバンドの定量を行います。’Quantity Calibration’アイコンをクリックし、複数のバンドの濃度
情報を元に検量線を描きます。
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2) 検量値を入力するバンドの青い四角を押すと、入力欄が表示され、数値を入力すると検量線が
作成されます。’Curve’を’Linear Log’にして、単位を選択します。
3)
‘Calibrate’ボタンを押すと検量値が Measurements Window の表の Calib Volume（単位）に反
映されます。Measurements Window で赤く表示されているのは、最も高濃度/低分子のバンドよ
りも検量線上で外に位置するバンドになります。
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4) 次に標準化（ノーマライゼーション）の手順を示します。先に示した Quantity Calibration ではいく
つかのポイントを使って検量線を作成するのに対し、ノーマライズは 1 本のバンドの値を基準に、
標準化した値を示します。
5) ‘Normalization’ボタンをクリックすると’Normalization’の画面が表示されます。
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6) バンド上の青い四角をクリックし、ナビゲーターの入力欄にそのバンドのタンパク質量の値と単位
を入力します。’Normalize’アイコンをクリック、Measurements Window の Calib vol（単位）に結果
が表示されます。
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5. コロニーカウンティング – Colony Counting –
1) コントロールセンターの’Colony Countin’を選択して、イメージを開きます。
2) ‘Detect’ボタンをクリックします。
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3) マウスを左クリックした状態で、イメージの左上から右下へドラッグして、検出範囲を設定します。
4) マウスを放すと検出枠内のコロニーが検出され、コロニーが青く表示されます。検出感度は、ナビ
ゲーターの ’ Sensitivity ’ ‘ Operator Size ’ などで調節できます。検出されたコロニーは、
Measurements Window で数値化されます。
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5) コロニーを検出できたら、必要に応じてコロニーの編集を行います。ナビゲーターの’Next’ボタン
をクリックします。
6) ナビゲーターのツールで編集します。
Draw or Erase Features : コロニーのマニュアル追加（左クリック）と消去（右クリック）
Delete Features : コロニーの削除
Split Features : コロニーの分割
編集後、ナビゲーターの’Renumb.’をクリックすると、イメージ左上から順に番号が割り当てられ
ます。
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7) 最後に、バックグラウンドを削除します。ナビゲーターの’Next’ボタンをクリックします。
8) ナビゲーターの‘Parameters’タブ内の’Image Rectangle’を選択します。Image Window で、バッ
クグラウンドを設定するエリアを囲みます。バックグラウンドは枠で囲んだ領域のシグナル強度の
平均値をそれぞれのコロニーの面積でかけて計算されます。
ドラッグで枠を囲むたびにバックグランドの再計算を行います。
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6. アレイ解析 - Array analysis 1) コントロールセンターの’Array analysis’を選択して、イメージを開きます。
2) 画像を開いたら、ナビゲーターの’Spot Definition’をクリックします。
画像の拡大、縮小、コントラスト調整は、p5 の“解析の準備”を参照して下さい。
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3) ナビゲーターの ‘Parameters’タブ内の Grid Type で、該当グリッドを選択します。該当グリッドが
一覧にない場合は、Grid 数を設定して作成します。新しく作成したグリッド情報は、’Save As’ボタ
ンから保存できます。保存したグリッド情報は、プルダウンメニューから選択可能です。
4) ‘Detect’をクリックすると、Image Window で検出グリッドが表示され、Measurements Window
に、各ウェルの定量値が表示されます。
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5) 認識したグリッド径を調節する場合は、’Auto-size upon creation’のチェックを外し、’X Radius’
と’Y Radisu’の数値を変更します。。グリッド位置を全体的に微調整するには、四隅のウェルをドラ
ッグします。1 ウェルずつ移動させる場合は、ナビゲーターの’Move&Resize Spots’をクリックし、
ウェルを動かします。
6) ‘Next’をクリックしてネガティブコントロールの設定画面に進みます。
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7) ネガティブコントロールを設定します。
1 – ナビゲーターな’Parameters’タブ内の’Negative Controls’にチェックを入れます。
下記の’Warning’メッセージが表示されることがありますが、’OK’ボタンを押します。
“Warining: the Negative Controls background method is selected, but no spots
have been set as controls.”
２- Image Window で、ネガティブコントロールとなるウェルをクリック（複数選択する場合は、キー
ボードの’Ctrl’キーを押しながらウェルをクリック）します。
３ - ナビゲーターの’Set negative control’ボタンをクリックします。
４ - バックグラウンドとして、ネガティブコントロールウェルのインテンシティの平均値が差引か
れて計算されます。
3
2
1
4
43
8) 次に各ウェルの定量値の標準化を行います。ナビゲーターの’Next’ボタンをクリックします。
9) 標準化（ノーマライゼーション）を行います。
1 - Image Window で濃度既知のウェルをクリックします。
2 - ナビゲーターの入力欄に、選択したウェルの濃度値を入力します。
3 – ‘Normalise’をクリックすると、Measurements Window の値が更新されます。値の大きさご
とに Measurements Window の格子の色が変わります。
1
3
2
44
10) 必要に応じて、閾値設定の上フラッグ表示することができます。ナビゲーターの’Next’ボタンをク
リックします。
11) サンプルの有無の閾値設定を行います。
1 - Image Window で、サンプル量が存在するウェルを選択します。
2 -’Define spots as present’ボタンをクリックします。
3 -’Estimate’ボタンをクリックすると、Measurements Window でサンプルの有無が表示されま
す。
1
3
2
45
7. イメージの重ね合わせ
① ImageQuant TL ver 8.0
1) ここではマーカーと化学発光、多重蛍光などの同じサンプルの画像を重ね合わせて同時に表示
する手順を示します。コントロールセンターの 4 つのモードから使用したいものを選択します。ここ
では 1D gel analysis を選択します。このうち Colony Counting のみは重ね合わせに対応しませ
ん。
2) ‘Open’ボタンから重ね合わせたい画像の 1 枚目を開きます。コントロールセンターより使用した
いモードを開きます。
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3) File メニューより’Create Multiplex Image’を選択します。
4) 重ね合わせに関する情報ファイル(data set, .ds )の名前を付けます。
1 - ファイル名を入力します。
2 – ‘Brouse’をクリックして重ね合せする画像（.gel もしくは.tif）を選択し、Open をクリックしま
す。
3 – ‘Create’をクリックすると.ds ファイルが作成されます。
1
2
3
47
5) 重ね合わせた画像が表示されます。画面の緑色、赤色は疑似カラーです。
6) 疑似カラー設定は’Color ‘アイコンを押して、一覧より変更できます。
48
7) 重ね合せたイメージを開くには、ImageQuant TL の各モジュールで.ds ファイルを開きます。各チ
ャンネルの表示 / 非表示は、ツールバーの Channel ボタンの On/Off で行います。
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② ImageQuant TL ver 7.0 以前
1) コントロールセンターの FluorSep を選択します。FluoreSep では、異なるイメージを最大 4 枚まで
重ね合せることができます。重ね合せるイメージは、同サイズ、同解像度の.gel ファイルである必
要があります。.gel から.tif への変換は、拡張子の変更のみで行うことができます。
2) Dataset Builder を起動します。
1 - メニューバーの File / Buid DataSet を選択すると、
2 - Dataset Builder ダイアログボックスが表示されます。
1
2
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3) 重ね合わせたい画像を登録します。
1 - チャンネル 1（CH1）のブラウズボタンをクリックして、
2 - 重ね合せするイメージ（.gel ファイル）を選択し、Open をクリックします。
3 - 同様に、チャンネル 2,（3, 4）もイメージを Open します。
1
2
3
4) 重ね合わせに関する情報ファイル(data set, .ds )の名前を付けます。
1 - Dataset Builder ダイアログボックスの Build ボタンをクリックします。
2 - イメージのデータセット名と保存先を指定します。
3 - Save ボタンをクリックします。
FluoreSep で重ね合せると、データセットファイル（.ds）ファイルが作成されます。
Save as
Save as
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5) ‘Dataset was built successfully’と表示されたら、OK ボタンをクリックします。
6) データセット名.ds ファイルと、データセット名.DIR フォルダーが作成されます。
7) .DIR フォルダーを開くと、ファイル名が UNSEP に変更された各.gel ファイルと、データセットファイ
ル.ds ファイルが、入っています。
※.DIR フォルダーと、.DIR フォルダー内のファイルは削除したり、ファイル名を変えたりしないで下さ
い。重ね合せたイメージが開かなくなります。
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8) 重ね合せたイメージを開くには、ImageQuant TL の各モジュール（Colony Counting を除く）で.ds
ファイルを開きます。各チャンネルの表示 / 非表示は、ツールバーの Channel ボタンの On/Off で
行います。
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