様式 3 学位論文要旨研究題目（注：欧文の場合は、括弧書きで和文も記入すること） Sphingosine Suppresses Mesothelioma Cell Proliferation by Inhibiting PKC-δ and Inducing Cell Cycle Arrest at the G0/G1 Phase （ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝの PKC-δ阻害と G0/G1 細胞周期停止による中皮腫細胞増殖抑制作用）兵庫医科大学大学院医学研究科医科学専攻生体応答制御系臨床腫瘍薬剤制御学系（指導教授中野孝司）氏名大桒久弥【研究目的】ｽﾌｨﾝｺﾞ脂質の主要部分を形成するものとしてｾﾗﾐﾄﾞ・ｾﾗﾐﾄﾞ-1-ｴｽﾃﾙ・ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ・ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ-1-ｴｽﾃﾙなどがあり、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは重要な代謝産物のひとつである。ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝはｾﾗﾐﾀﾞｰｾﾞによるｾﾗﾐﾄﾞの分解にて産生される。ｽﾌｨﾝｺﾞ脂質が細胞分化・細胞増殖・ｱﾎﾟﾄｰｼｽの調節する役割を持つことはすでに証明されている。今までの研究で、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは海馬ﾆｭｰﾛﾝや神経膠細胞、高分化の MKN-28 ﾋﾄ胃癌細胞においてｱﾎﾟﾄｰｼｽを誘導することが明らかとなっている。これらの事実は、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝが抗癌剤開発の標的となる可能性を示唆している。悪性中皮腫は過去のｱｽﾍﾞｽﾄ曝露から発生する、極めて悪性度の高い腫瘍である。今までも多くの研究がなされているが、未だ有効な治療薬が無いのが現状である。そこで、我々はｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝによる悪性中皮腫の治療応用の可能性について研究を行った。【研究方法】 1. 中皮腫細胞株NCI-H28, NCI-H2052, NCI-H2452 ,MSTO-211H細胞を用いた。 2. MTTアッセイにて細胞増殖を解析した。 3. アポトーシスを判定するためにﾀﾈﾙ染色を行った。 4. フローサイトメトリーにて細胞周期解析を行った。 5. Cell-free systemでPKC-δ活性化を測定した。 6. Western blotting にてｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝからの SDK 産生と PKC-δ発現ﾚﾍﾞﾙを検討した。 7. PLSD test、unpaired t-test、Dunnett’s test を用いて統計学的解析を行った。【研究結果】 ① ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝはここで用いた全ての中皮腫細胞株の増殖を抑制させた。各細胞間においてｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝによる細胞増殖抑制作用の相違は認められなかった。 ② ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ処理後、ここで用いた全ての中皮腫細胞株においてﾀﾈﾙ染色陽性細胞の有意な増加は認められなかった。このことは、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝが中皮腫細胞のｱﾎﾟﾄｰｼｽを誘発するのではなく、増殖を抑制することを示唆している。 ③ ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝはｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝｷﾅｰｾﾞ１によってリン酸化され、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ 1 ﾎｽﾌｧﾀｰｾﾞ（S1P）が産生される。 S1P は中皮種細胞生存率に影響を与えなかった。このことは、中皮腫細胞の増殖抑制作用がｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ自身によるものであることを示唆している。 ④ ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは、ここで用いた全ての中皮腫細胞株においてｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ依存性ﾌﾟﾛﾃｲﾝｷﾅｰｾﾞ(SDK)産生を増加させなかった。このことは、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝの中皮腫細胞増殖抑制作用が SDK によるものでないことを示している。 ⑤ PKC-δ阻害剤であるﾛｯﾄﾚﾘﾝは、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝと同様に中皮腫細胞増殖を抑制した。さらに、PKC-δ をﾉｯｸﾀﾞｳﾝさせることにより中皮腫細胞増殖が抑制された。これらの事実は、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝが PKC-δ 活性化を阻害し、その結果、中皮腫細胞増殖を抑制する可能性を示唆している。 ⑥ Cell-free system における測定で、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは PKC-δ活性化を有意に低下させた。このことは、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝによる PKC-δ阻害作用の直接的証拠を提示している。 ⑦ 中皮腫の細胞周期解析において、PKC-δﾉｯｸﾀﾞｳンにより G0/G1 期の細胞分布は有意に増加し、 G2/M 期の細胞分布は減少した。このことは、PKC-δ阻害による G0/G1 期での中皮種細胞周期停止を意味している。【考察】今回の研究結果は、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝに中皮腫細胞に対する増殖抑制作用があることを明らかに示している。過去の研究で、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは PKC-δから切り出される SDK の産生を増加させ、SDK/14-3-3 蛋白/Bax/ｼﾄｸﾛﾑ C に関連したﾐﾄｺﾝﾄﾞﾘｱ経路を介してｶｽﾊﾟｰｾﾞ-3/-9 を活性化し、海馬ﾆｭｰﾛﾝや神経膠細胞のｱﾎﾟﾄｰｼｽを誘導することが示されている。また、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは SDK 産生増加ならびに SDK 活性化によって高分化 MKN-28 ﾋﾄ胃癌細胞のｱﾎﾟﾄｰｼｽを誘発することが明らかとなっている。本研究結果においては、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは SDK の産出を増加させず、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝによる中皮腫細胞増殖抑制作用における SDK の関与の可能性は低かった。一方、Cell-free PKC assay にてｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは PKC-δ 活性を有意に低下させた。このことは、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝの直接結合による PKC-δ阻害を意味している。ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝと同様に、ﾛｯﾄﾚﾘﾝによる PKC-δ阻害あるいは PKC-δノックダウンは中皮腫細胞増殖を抑制した。中皮種細胞周期解析において、PKC-δノックダウンは G0/G1 期での細胞周期停止を誘導した。これらの結果は、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝは PKC-δ阻害によって G0/G1 期で細胞周期を停止させ、中皮腫細胞増殖抑制に導くことを示している。これは、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝ作用に関する新しい知見であり、ｽﾌｨﾝｺﾞｼﾝを標的とした中皮腫治療薬開発の基盤になると思われる。