diss. eth no. 23122 USING FLUORESCENCE - ETH E

diss. eth no. 23122
U S I N G F L U O R E S C E N C E C O R R E L AT I O N
SPECTROSCOPY TO DISSECT THE
B I O C H E M I S T RY
OF MICROTUBULE INTERACTING PROTEINS
IN LIVE CELLS
A dissertation submitted to
eth zurich
for the degree of
doctor of sciences
presented by
mathias bayer
Diploma in Physics (TU Dresden)
born on 28 February 1981
in Böblingen, Germany
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Yves Barral, examiner
Dr. Gabór Csúcs, co-examiner
Prof. Dr. Ben Schuler, co-examiner
Prof. Dr. Jackie Vogel, co-examiner
2015
Abstract
This work focuses on the molecular mechanisms that govern mitotic
spindle positioning during yeast cell division. Asymmetrically dividing cells such as budding yeast need to tightly control the temporal and
spatial aspects of positioning their mitotic spindle in order to properly
segregate genetic information and cell fate determinants. The specification of microtubules (MT) on a molecular level is a key element driving
this process. To investigate proteins contributing to this specification
in the cytoplasm of living cells on a single molecule level, a very sensitive tool was developed and implemented, fluorescence correlation
spectroscopy (FCS). This enables the recording of mobility, oligomerisation and concentration of any labeled protein. Moreover, with two
species labeled, FCS can probe the chemical affinity of their interaction.
This approach has the advantage to obtain classical biochemical parameters in the context of living cells. Using FCS, we find that Kar9, one
key astral microtubule (aMT) identificator, is in a tight complex with
its aMT anchor Bim1, an EB1 family MT plus tip binding protein, also
in cases where Kar9 does not localise at aMTs. Phosphorylation was
reported to prevent Kar9 localisation at aMTs. Consistent with this we
find that phosphorylation increases the mobility of the Kar9-Bim1 complex, but not its affinity. We speculate that the complex exists in two
functionally distinct conformational states, with different preferences
for aMTs. Further, we find evidence that phosphorylation of Kar9 activates a nuclear import signal, which we show to be linked with the
conformational state of the Kar9-Bim1 complex. Kar9 at aMTs has
been reported to bind a number of additional proteins, among them
its own regulatory kinase Cdk1 and its cyclin Clb4. We propose a
model where plasticity in complex conformation allows Kar9/Bim1 to
read out distinct biochemical activities with respect to nuclear import/export, Cdk1/Clb4 activity, and resistance for Cdk1/Clb4 dependent
phosphorylation. Our model helps us to understand how the interplay
between Cdk1/Clb4 and Kar9 is able to create different functional areas around the aMTs emanating from the two spindle poles in the same
cytoplasm.
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Zusammenfassung
Diese Arbeit befasst sich mit den molekularen Abläufen, die die SpindelPositionierung während der Hefe-Zellteilung bestimmen. Zellen, die
sich asymmetrisch Teilen, darunter Bäckerhefe, müssen die Position ihrer mitotischen Spindel präzise koordinieren, damit die korrekte Übergabe der genetischen Information und von Differenzierungsfaktoren,
sichergestellt wird. Hierfür ist die Ausbildung verschiedenartiger Mikrotubuli (MT) auf molekularer Ebene grundlegend. Um Proteine im
Zytoplasma lebender Zellen auf Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen,
haben wir eine sehr sensitive Methode entwickelt und angewandt, die
Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS). Diese ermöglicht uns,
die Mobilität, den Oligomerisierungsstatus, und die Konzentration einer jeglichen markierten Proteinsubstanz zu bestimmen. Darüber hinaus erlaubt uns die Methode, bei zwei gleichzeitig markierten Substanzen, deren chemische Affinität zu bestimmmen. Dieser Ansatz hat den
Vorteil, klassische biochemische Parameter direkt im Kontext lebender
Zellen zu ermitteln. Mittels FCS zeigen wir, dass Kar9, ein zentraler
Baustein der Identifizierung von astralen Microtubuli (aMT), im festen Komplex an seinen Anker an aMT, Bim1, bindet, einem Protein
der an MT Plus-Enden bindenden EB-Familie, und zwar auch dann,
wenn diese sich nicht am MT befinden. Es ist bekannt, dass Phosphorylierung die Lokalisierung von Kar9 an aMTs beeinflusst, damit
konform zeigen wir, dass der Kar9-Bim1 Komplex seine Mobilität unter Phosphorylierung ändert, nicht jedoch seine Bindungsstärke. Wir
vermuten, dass der Komplex in zwei funktional verschiedenen Konformationen auftritt, mit unterschiedlicher Präferenz für aMTs. Weiterhin finden wir Hinweise, dass Phosphorylierung an Kar9 ein ZellkernImport-Signal auslöst, und wir zeigen, dass dieses Signal eng mit der
Konformation zusammenhängt. Kar9 selbst bindet eine Reihe von weiteren Partnern am aMT, darunter seinen eigenen Regulator, die Kinase
Cdk1, und Ihr Cycline Clb4. Wir schlagen ein Modell vor, in welchem
Plastizität in der Komplexbildung Kar9/Bim1 erlaubt, unterschiedliche
biochemische Aktivitäten auszulesen bezüglich Import/Export in den
Zellkern, Cdk1/Clb4 Aktivität, und Widerstand gegenüber Cdk1/Clb4abhängiger Phosphorylierung. Mithilfe des Modells versuchen wir zu
veranschaulichen, wie das Wechselspiel zwischen Kar9 und Cdk1/Clb4
zu einer verschiedenartigen Funktionalisierung der aMTs, kommend
von den zwei Spindelpolen, führen kann.
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