卵巣発生において卵巣特異的転写因子FOXL2はWT1によるSf1の発現を

研究フロンティア
（平成年度学術奨励賞受賞論文）
卵巣発生において卵巣特異的転写因子 FOXL は
の発現を抑制する
WT による
高澤
啓，鹿島田健一
東京医科歯科大学発生発達病態学分野
その転写抑制機構などは不明であり，詳細は明らかでな
はじめに
い．特に精巣における Sf の転写の正の制御については
哺乳類の性腺の分化は，未分化性腺の発生後に Y 染
SOX が担うと考えられているが［
］
，これは卵巣での
色体上にある Sex-determining region Y （SRY/Sry）の有
Sf 発現が上昇しないことを説明できても，発現が抑制
無によって精巣・卵巣への分化が決定づけられる［
されることを説明することはできない．
］
．
マウス精巣においては性決定期である胎生．日から
われわれは，卵巣分化における Sf の発現調節に何ら
．日に SRY が発現することで SRY-box （Sox ）の
かの卵巣特異的因子が関与していると仮説を立て，卵巣
転写を活性化し，その下流にある一連の精巣分化を誘導
発生およびその維持に必須である FOXL ［
する分子の発現が促進される［
し，FOXL が卵巣分化における Sf 発現に与える影響
］
．卵巣においては性
］に注目
，
Wingless
決定期以降に Forkhead box L （FOXL /Foxl ）
を検討した．その結果 FOXL が卵巣発生初期において，
-type MMTV integration site family, member （WNT
Sf の発現を能動的に抑制することを示したので，それ
/Wnt ）
，R-spondin- （RSPO /Rspo ）といった卵巣
らについて簡略に報告したい．
特異的因子が発現することで卵巣分化が促進される［
（図
］
と
）
．
SF （AD BP ，NR A ）/Sf （Ad Bp，NR a ）は
は胎仔卵巣において相反的な発現経過
をとる
副腎，性腺の発生，分化に必須な転写因子である．これ
は Sf のノックアウトマウスでは，副腎および性腺が発
生しないこと［
］
，ヒトでは SF 異常症において，副
われわれはまず胎仔マウス性腺における Sf ，Foxl
の発現を RT―PCR 法にて定量，評価した．既報の通り，
腎低形成および性腺の低形成が生じ， XY 性分化疾患
性決定後の胎生．日以降，Sf の発現は精巣において
を呈すること［
亢進，卵巣において有意に抑制される一方，それとほぼ
］から確認される．SF は原始性腺の
発生に必須であることに加え，性決定後においては，精
同時期に卵巣における Foxl の発現が亢進した（図
巣の発生において特に重要な役割を果たす．事実，SF
また，未分化性腺において Sf の上流の制御因子である
/Sf の発現パターンは未分化性腺では XX，XY 性腺に
ことがすでに報告されている Wt および Lhx の発現は
おいて均等に発現するのに対し，性決定後では XY 性腺
性差を認めなかった．これらは，FOXL が Sf の発現
（精巣）において発現が亢進，XX 性腺（卵巣）において
を抑制するというわれわれの仮説と矛盾しないもので
は発現が抑制され性腺特異的な発現パターンをとる
［
）
．
あった．
］
．性決定後の精巣において SF は，SOX /Sox 性
腺特異的エンハンサーである TESCO において，SRY と
FOXL は WT ―KTS による
共役的に働き SOX /Sox の発現を上昇させる［
in vitro において抑制する
］な
の転写活性作用を
ど，種々の精巣分化を誘導する分子の転写活性を正に制
御する．一方，性決定後の卵巣においてみられる SF /
続いて，内因性 Foxl の発現がないマウス精巣体細胞
Sf 発現の抑制は出生時までの間持続するが，胎生期卵
由来であるTM 細胞を用いてin vitroでの解析を行った．
巣発生における SF の役割や，転写が抑制される意義，
TM 細胞に Wt ―KTS ，Lhx を導入したところ，既報
連絡先：高澤啓，東京医科歯科大学発生発達病態学分野
〒 ―
東京都文京区湯島 ― ―
TEL ： ―
―
FAX： ―
―
E-mail：[email protected]
通り［］
，WT ―KTS および LHX によって Sf の発現
が亢進することが確認された［（
］図
A）
．さらに FOXL
を共発現することで，WT ―KTS による Sf の発現亢
進が FOXL によって用量依存的に抑制されることが確
日本生殖内分泌学会雑誌（2015）20 : 47-51
47
高澤
啓
他
ᛶỴᐃᮇ
SF1
WT1
GATA4
LHX9
FGF9,PGD2
SRY(+)
ᮍศ໬
ᛶ⭢
⚄⤒ሐ
SRY(-)
SOX9
Amh
⢭ᕢ
WNT4
RSPO1
Fst
༸ᕢ
expression
level
FOXL2
SRY
Time(dpc)
10.5 11.5 12.5
図
図
認された（図
SOX9
性分化の分子機構（マウス）
［］より改変
マウス胎仔性腺における
，
の経時的発現（RT―PCR）
［］
胎生．∼ ．日．実線（XX）
：卵巣，破線（XY）：精巣．＊＊＊：p＜．
B）
．一方，FOXL による Sf 発現抑制
は哺乳類の間ではよく保存されており，その重要性が示
作用は LHX による Sf 転写制御に対しては明らかでは
唆されるうえ，Sf の転写を活性化する WT ―KTS，LHX
結合領域よりも Sf の近位にあることから，FOXL に
なかった（図
C）
．
FOXL は
近位 promoter に直接結合し WT ―
よる Sf 転写抑制に重要な役割を果たしている可能性が
KTS による
転写活性化を抑制する
示唆された．
われわれはこの FOXL 結合配列と思われる部位に対
して in vitro のクロマチン免疫沈降（ChIP）アッセイを
FOXL による Sf の発現抑制の機序を明らかにする
側
ために，Sf 遺伝子 ’
bp（−
行い，FOXL が Sf 近位プロモーターに直接結合する
∼＋）のプロモー
ことを確認した．さらにその配列に変異を導入したレ
ターを用いてレポーターアッセイを行った．このプロ
ポーターを用いてレポーターアッセイを行ったところ，
モーターは胎生．日の性腺において，WT ―KTS およ
FOXL による Sf 転写抑制作用が消失することを確認
び LHX が直接結合することで活性化されることが in
した（図
vivo で確認されている［］
．レポーターアッセイでも
抗作用においては，本シークエンス（−
WT ―KTS により Sf プロモーターの転写活性が上昇
の結合が必須であることを示している．さらに，WT ―
し，それは FOXL によって用量依存的に抑制された（図
KTS 結合配列に対する ChIP アッセイでは，WT ―KTS
A）
．さらに興味深いことに，われわれはこのプロモー
B）
．これらは，FOXL の WT ―KTS への拮
∼−
）へ
の Sf 近位プロモーターへの結合が FOXL の存在下に
ター領域内に FOXL の結合モチーフと相同性の高い配
よって阻害されなかったため，FOXL の（−
列を（−
への結合は WT の DNA への結合を阻害しないことが示
48
∼−
）に見い出した（図
日本生殖内分泌学会雑誌
Vol.20 2015
）
．この配列
∼−
）
卵巣発生において卵巣特異的転写因子 FOXL は WT による Sf の発現を抑制する
図
強制発現系（TM 細胞）における
＊
：p＜．
A
発現（RT―PCR）
［］
B
近位プロモーターを用いたルシフェラーゼアッセイ［］
近位プロモーター，B：FOXL 結合配列に変異を導入したプロモーター．
A：
＊
：p＜．，＊＊：p＜．，NS：有意差なし．
図
WT1
-589
LHX9
FOXL2
Sf1
1
-318
-240
Mouse
Rat
Human
Cow
Dog
-229
-222
-210
A-CAGCCAGCTGGCCAAGGTCTCTCC--AGTGC
A-CAGCCAGCTGGCCCAGGCCTCCCC--AGTGC
AACAGCCAGCTGGTCAAGGCCTCTGC--AGTGC
AACAGCCAGCTGGTCAAGGCCTCC--AGAGTGC
AACAGCCAGCTGGCCAAGGCCTCC--AGAGTGC
ͤFOXL2⤖ྜ䝰䝏䞊䝣 : GTCAAGGT/C
図
近位プロモーターと FOXL 結合配列（− ∼− bp）
WT ―KTS および LHX 結合領域［］
．FOXL 結合モチーフ［］
．
研究フロンティア
49
啓
他
Sf1 expression
高澤
WT1
LHX9
SIX1/4
9.5dpc
図
図
ノックアウトマウス胎仔卵巣における
WT：野生型．＊：p＜．，＊＊：p＜．
発現
（RT―PCR）
［］
⢭ᕢ
SOX9
FOXL2
༸ᕢ
12.5dpc
マウス胎仔性腺における
P0
発現調節機構
による Sf 発現抑制は卵巣分化の比較的早期に限定され
る可能性が示された．Foxl 以外の抑制機序に関しては
された．以上の結果より，FOXL が Sf 近位プロモー
今後さらなる検討が必要であるが，今回解析に用いた Sf
ターに直接結合することで，WT ―KTS による転写活性
近位プロモーターは卵巣発生初期以降（胎生．日以
を抑制する機序が in vitro において示された．
降）において，部分的にしか機能していない可能性が示
唆されており［，］
，そうした卵巣における特異的
FOXL は卵巣発生初期に Sf の発現を抑制する
エンハンサーの変動などが寄与している可能性がある．
これらについては今後の解析が待たれるところである．
以上で示された FOXL が Sf 発現を抑制する機構が
近年，熊本大学藤本らが未分化性腺の発生における Sf
in vivo においても同様に認められるかどうか，という点
の発現制御に関わる新たな因子として SIX /SIX を報
について検証を行うために，Foxl ノックアウトマウス
告した［］が，SIX /SIX の Sf への発現制御におけ
の胎仔卵巣における Sf の発現を RT―PCR 法で定量し
る FOXL の作用に関しては今後の検討課題としたい．
一般に WT―KTS は転写因子として，下流遺伝子の転
た．その結果，野生型に対して Foxl ノックアウトマウ
スでは Sf の発現が有意に亢進していた（図
）
．これ
写活性，もしくは抑制に作用することが知られており，
らは卵巣発生において FOXL が Sf の発現を抑制して
それらは標的遺伝子や結合する制御領域によって決まる
いることを示唆するものである．さらに，ノックアウト
と考えられている．今回の報告は，WT ―KTS が同一の
マウスと野生型における Sf 発現の差は胎生．日で最
標的遺伝子に対し，同一の結合部位において，他の分子
も大きく，出生時にはその差を認めなかったことから，
（この場合は FOXL ）の存在/非存在によって，転写活
FOXL による Sf 発現抑制は卵巣分化の比較的早期に
性が抑制されることを示した．こうした WT の転写制
限定されると考えられた．
御については，これまで報告がなく，新たな WT の制
御機構として興味深いと考えている．WT は性腺だけ
おわりに
ではなく，心臓や神経系の発生にも重要であり，今回の
発見はそうした臓器発生における WT の機能を検討す
われわれは，卵巣特異的な Sf の転写抑制において，
るうえで貴重な示唆を与えるものと考える．
卵巣特異的転写因子である FOXL による能動的な機構
が関与することを示した（図
本検討は，卵巣分化を制御する新たな分子機構を明ら
）
．近年，性分化におい
かにしたものであり，今後のさらなる検討を通じて，
て，卵巣特異的因子と精巣特異的因子の拮抗的な機構が
XX 性分化疾患や卵巣形成不全の原因究明につながるこ
報告されるようになっているが，今回の検討の結果は Sf
とを期待したい．
の転写制御においても，同様の機構が関与し制御され
ている事を示すものである．
今回の検討より，Sf の卵巣での発現が能動的に抑制
されていることが判明したことから，卵巣での Sf の過
剰は卵巣発生に何らかの不都合を起こす可能性があるの
ではないかと考えている．
また，Foxl ノックアウトマウスにおいて，Sf の発
現上昇は，胎生．日までであったことから，FOXL
50
日本生殖内分泌学会雑誌
Vol.20 2015
謝
辞
本稿は
年度に日本生殖内分泌学会学術奨励賞を受賞し
た研究内容をまとめたものである．本稿の執筆の機会を与え
てくださいました日本生殖内分泌学会理事長苛原稔教授，
第回学術集会会長北脇城教授に感謝申し上げます．
卵巣発生において卵巣特異的転写因子 FOXL は WT による Sf の発現を抑制する
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研究フロンティア
51

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