〔実 8 頁〕 公開特許公報（Ａ） (19)日本国特許庁（ＪＰ） (12) (11)特許出願公開番号 特開2015-166327 （Ｐ２０１５−１６６３２７Ａ） (43)公開日 平成27年9月24日(2015.9.24) (51)Int.Cl. ＦＩ テーマコード(参考) Ａ６１Ｋ 38/00 (2006.01) Ａ６１Ｋ 37/02 ４Ｂ０１８ Ａ６１Ｐ 43/00 (2006.01) Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 39/06 (2006.01) Ａ６１Ｐ 39/06 ４Ｃ０８８ Ａ６１Ｋ 36/899 (2006.01) Ａ６１Ｋ 35/78 Ｕ Ａ６１Ｋ 36/00 (2006.01) Ａ６１Ｋ 35/78 審査請求 未請求 (21)出願番号 特願2014-41618(P2014-41618) (22)出願日 平成26年3月4日(2014.3.4) Ｘ 請求項の数4 ＯＬ （全13頁） 最終頁に続く (71)出願人 591060980 岡山県 岡山県岡山市北区内山下２丁目４番６号 (71)出願人 509105857 学校法人就実学園 岡山県岡山市中区西川原一丁目６番１号 (71)出願人 000001812 株式会社サタケ 東京都千代田区外神田４丁目７番２号 (74)代理人 100113181 弁理士 中務 茂樹 (74)代理人 100180600 弁理士 伊藤 俊一郎 最終頁に続く (54)【発明の名称】内因性グルタチオン増強剤 (57)【要約】 【課題】生体内におけるグルタチオン量を増強させるこ とができるため、酸化ストレスが原因となる様々な疾病 の治療や予防が期待できる内因性グルタチオン増強剤及 びその製造方法を提供する。 【解決手段】米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を 有効成分として含有する内因性グルタチオン増強剤であ る。また、アルカリ溶液を用いて米から抽出した米糠又 は米由来のタンパク質を、アスペルギルス オリゼ由来 のタンパク質分解酵素を用いて分解する前記内因性グル タチオン増強剤の製造方法である。 【選択図】図１ ( 2 ) JP 1 2015-166327 A 2015.9.24 2 【特許請求の範囲】 【特許文献】 【請求項１】 【０００５】 米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効成分とし 【特許文献１】特開２０１３−４０１１１号公報 て含有する内因性グルタチオン増強剤。 【特許文献２】ＷＯ２００５／０９４８４９号 【請求項２】 【発明の概要】 ＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ 【発明が解決しようとする課題】 ）活性剤である請求項１記載の内因性グルタチオン増強 【０００６】 剤。 本発明は上記課題を解決するためになされたものであり 【請求項３】 、生体内におけるグルタチオン量を増強させることがで 概日リズム改善剤である請求項２記載の内因性グルタチ 10 きるため、酸化ストレスが原因となる様々な疾病の治療 オン増強剤。 や予防が期待できる内因性グルタチオン増強剤及びその 【請求項４】 製造方法を提供することを目的とするものである。 アルカリ溶液を用いて米から抽出した米糠又は米由来の 【課題を解決するための手段】 タンパク質を、アスペルギルスオリゼ由来のタンパク質 【０００７】 分解酵素を用いて分解することを特徴とする請求項１∼ 上記課題は、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を ３のいずれか記載の内因性グルタチオン増強剤の製造方 有効成分として含有する内因性グルタチオン増強剤を提 法。 供することによって解決される。 【発明の詳細な説明】 【０００８】 【技術分野】 このとき、前記内因性グルタチオン増強剤が、ＮＡＴ（ 【０００１】 20 セロトニン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）活性剤 本発明は、内因性グルタチオン増強剤及びその製造方法 であることが本発明の好適な実施態様である。また、前 に関する。 記内因性グルタチオン増強剤が、概日リズム改善剤であ 【背景技術】 ることも本発明の好適な実施態様である。 【０００２】 【０００９】 グルタチオンは、生体内で産生される抗酸化物質であり また、このとき、アルカリ溶液を用いて米から抽出した 、酸化ストレスに対する防御をはじめ、細胞内における 米糠又は米由来のタンパク質を、アスペルギルス 酸化還元状態の制御、毒物や薬物の解毒などの様々な生 ゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解することを特 理作用を有することが知られている。 徴とする内因性グルタチオン増強剤の製造方法を提供す 【０００３】 ることも本発明の好適な実施態様である。 特許文献１には、米糠又は玄米由来のタンパク質を加水 30 【発明の効果】 分解してなるペプチドを有効成分として含有するジペプ 【００１０】 チジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤について記載されてお 本発明により、内因性グルタチオン増強剤及びその製造 り、長期に連続して使用しても安全であり、小腸からの 方法を提供することができる。 吸収性に優れ、ＤＰＰ−ＩＶ阻害作用が強く、しかも血 本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来 中での安定性に優れているとされている。しかしながら のタンパク質加水分解物を有効成分として含有するもの 、特許文献１には、グルタチオン増強剤として用いるこ であり、生体内におけるグルタチオン量を増強させるこ とについての記載はなかった。 とができる。したがって、酸化ストレスが原因となる様 【０００４】 々な疾病の治療や予防が期待できる。また、本発明の内 特許文献２には、ホエーを有効成分として含む内因性メ 因性グルタチオン増強剤は、米糠タンパク又は米タンパ ラトニン分泌リズムの位相調整又は振幅増強剤について 40 クをタンパク質分解酵素で分解して製造されるので、効 記載されており、食経験のあるホエーを有効成分とする 率よく大量に生産することができる。 ので、日常的に連用可能で、安全性に優れ、これらリズ 【図面の簡単な説明】 ムの異常に起因すると考えられる非２４時間睡眠・覚醒 【００１１】 症候群、時差症候群、後退勤務症候群、睡眠時無呼吸症 【図１】実施例１において、ＨｅｐＧ２細胞を用いた内 候群、中高年期睡眠障害等の睡眠障害や入眠潜時障害等 因性グルタチオン増強効果を示す図である。 の予防又は改善が期待できるとされている。しかしなが 【図２】実施例２において、ＨｅｐＧ２細胞を用いた内 ら、特許文献２には、米糠又は米由来のタンパク質加水 因性グルタチオン増強効果を示す図である。 分解物についての記載もなく、グルタチオン増強剤につ 【図３】実施例３において、ＨｅｐＧ２細胞を用いた内 いての記載もなかった。 因性グルタチオン増強効果を示す図である。 【先行技術文献】 50 オリ 【図４】実施例４において、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用い ( 3 ) JP 3 2015-166327 A 2015.9.24 4 た内因性グルタチオン増強効果を示す図である。 、５ＮのＮａＯＨ水溶液でｐＨを７．０∼８．０に調整 【図５】実施例４において、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用い した後、タンパク質分解酵素を加え、４０∼５０℃で１ た内因性グルタチオン増強効果を示す図である。 ２∼２４時間反応を行う。次いで、酵素を失活させ、液 【図６】実施例５において、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用い 体窒素で凍結乾燥して米糠又は米由来のタンパク質加水 たＮＡＴ活性増強効果を示す図である。 分解物を得ることができる。すなわち、本発明において 【発明を実施するための形態】 、米糠又は米由来のタンパク質加水分解物は、タンパク 【００１２】 質分解酵素により加水分解されることで得られるもので 本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来 ある。 のタンパク質加水分解物を有効成分として含有するもの 【００１７】 である。米糠又は米由来のタンパク質加水分解物を有効 10 タンパク質分解酵素としては、ペプシン、プロテアーゼ 成分として含有することにより、生体内におけるグルタ Ａ、プロテアーゼＢなど市販のタンパク質分解酵素を使 チオン量を増強させることができる。したがって、酸化 用することができるが、具体的には、ビオプラーゼＳＰ ストレスが原因となる様々な疾病の治療や予防が期待で 、デナチームＡＰ、プロテアーゼＰ、ペプチターゼＲ、 きる。ここで、本発明者らは、米糠又は米由来のタンパ ウマミザイムＧなどを挙げることができる。なかでも、 ク質加水分解物がペプチドであることを確認している。 アスペルギルス したがって、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米 ｒｙｚａｅ）由来のタンパク質分解酵素を用いることに 糠又は米由来のタンパク質を加水分解物してなるペプチ より、得られる米糠又は米由来のタンパク質加水分解物 ドを有効成分として含有するものである。 によるグルタチオン増強効果が高くなる利点を有するた 【００１３】 め好ましい。 本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米から抽出した 20 【００１８】 米糠又は米由来のタンパク質を原料とするが、米として アスペルギルス は、品種、種類、精米方法に限定されず、ジャポニカ米 ては、ペプチターゼ及びプロテアーゼを有する上述の市 、インディカ米など種々の米を用いることができる。米 販のウマミザイムＧ（至適ｐＨ８．０、中性付近で有効 糠は、通常大量に廃棄されるものであるので、グルタチ に作用し、至適温度４５℃）、及びアスペルギルス オン増強作用に優れることに加え、原料ソースの点でも リゼが生産するプロテアーゼを製剤化したデナチームＡ 好ましい。原料として米糠を用いる場合は脂質成分を除 Ｐ（至適ｐＨ７．０、至適温度５０℃）を挙げることが 去することが好ましい。 できる。これらの酵素を用いることにより、グルタチオ 【００１４】 ン増強効果が高い本発明の内因性グルタチオン増強剤を 脱脂の方法としては特に制限されるものではなく、機械 得ることができる。また、これらの酵素を用いると、タ 搾油、溶剤による抽出方法などを用いることができる。 30 ンパク質加水分解物の収率が５０％以上を示す点でも好 食品に用いられるためには、残留してはならないヘキサ ましい。したがって、アルカリ溶液を用いて米から抽出 ンなどの溶剤を用いることは避けるべきであり、かかる した米糠又は米由来のタンパク質を、アスペルギルス 観点からは、機械搾油やエタノールを用いた抽出により オリゼ由来のタンパク質分解酵素を用いて分解する内因 脂質を除去することが好ましい。 性グルタチオン増強剤の製造方法が本発明の好適な実施 【００１５】 態様である。 本発明の内因性グルタチオン増強剤に使用される米糠又 【００１９】 は米由来のタンパク質加水分解物を製造するには、まず 本発明において、内因性グルタチオン増強剤に含まれる 、米糠又は米から、米糠タンパク又は米タンパクをアル 米糠又は米由来のタンパク質加水分解物の含有量として カリ溶液で溶出させる。アルカリ溶液としては、ｐＨを は特に限定されないが、終濃度が０．１∼１００ｍｇ／ １２．５近辺に調整したＮａＯＨ水溶液を用い、この溶 40 ｍＬとなるように添加されることが好ましい。終濃度が 液に米糠又は米などを添加し、４０∼６０℃の温度で撹 ０．１ｍｇ／ｍＬ未満の場合、グルタチオン増強効果が 拌しながら２∼５時間程度抽出する。次いで、遠心分離 得られないおそれがあり、０．５ｍｇ／ｍＬ以上である 機などの分離手段でろ液とろ過物とに分離し、１∼２Ｎ ことがより好ましく、１ｍｇ／ｍＬ以上であることが更 の希塩酸でろ液のｐＨを４に調整し、タンパク質を沈殿 に好ましく、３ｍｇ／ｍＬ以上であることが特に好まし させ、減圧乾燥などで乾燥させて米糠タンパク又は米タ い。一方、終濃度が１００ｍｇ／ｍＬを超える場合、不 ンパクを得ることができる。タンパク質を得る方法はこ 溶になるおそれがあり、５０ｍｇ／ｍＬ以下であること れに限定されるものではなく、酵素により糖質、セルロ がより好ましく、３０ｍｇ／ｍＬ以下であることが更に ース等を水溶化して得ても良い。 好ましい。 【００１６】 【００２０】 得られた米糠タンパク又は米タンパクを蒸留水に懸濁し 50 本発明の内因性グルタチオン増強剤は、例えば経口的に オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏ オリゼ由来のタンパク質分解酵素とし オ ( 4 ) JP 2015-166327 A 2015.9.24 5 6 投与して、生体内におけるグルタチオン量を増強させる 反応を停止させた。これをＨＰＬＣの試料とした。ＨＰ ことができる。経口投与に用いる本発明の内因性グルタ ＬＣによる分析には、ＯＤＳカラムを使用し、移動層は チオン増強剤の剤形は、錠剤、カプセル剤、細粒剤、散 ７５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．９）、アセトニ 剤、タブレット剤、トローチ剤、舌下剤、液剤などが可 トリルを用いた。移動層中のアセトニトリル濃度を１％ 能である。また、本発明の内因性グルタチオン増強剤は から１５％まで段階的に上昇させ、蛍光誘導体化したグ 、各種食品、各種飲料に添加して用いることもできるし ルタチオンを分離した。検出には、蛍光検出器（励起波 、サプリメントとして用いてもよい。 長：３８０ｎｍ、蛍光波長：５１０ｎｍ）を用いた。 【００２１】 【００２４】 本発明の内因性グルタチオン増強剤は、米糠又は米由来 （グルタチオン上昇活性の測定） のタンパク質加水分解物を有効成分として含有する。前 10 ヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２を１．５×１０ 記タンパク質加水分解物は、生体内におけるグルタチオ ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ ン量を増強させることができ、安全性が高く、数々の医 ＦＢＳ入りのＭＥＭ培地で３７℃、５％ＣＯ２ で４８時 薬品、特定用保健食品、機能性食品等への利用が期待で 間培養した。培地交換後、被験物質を終濃度２．５、５ きる。本発明の内因性グルタチオン増強剤は、安価に入 、１０ｍｇ/ｍＬになるように添加し、２４時間共培養 手することができるという利点があり、実用上極めて利 した。培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳで二回洗浄後、細 用価値が高い。また、後述する実施例で示されているよ 胞をセルスクレーパーで回収した。 うに、本発明の内因性グルタチオン増強剤は、ＮＡＴ活 【００２５】 性を増強させることができる。 （細胞内グルタチオンの抽出） したがって、ＮＡＴ（セロトニン−Ｎ−アセチルトラン 回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ スフェラーゼ）活性剤であることが本発明の好適な実施 20 Ｍ ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５， 態様であり、概日リズム改善剤であることが本発明のよ ０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した り好適な実施態様である。このように、本発明の内因性 。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加 グルタチオン増強剤は、ＮＡＴ活性剤や概日リズム改善 して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心 剤として用いられることにより、睡眠障害や入眠潜時障 した。さらに、５０μＬの４Ｍ 害等の各種症状を予防又は改善することが可能となる。 て撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し 【実施例】 て上清を回収し、細胞抽出液とした。 【００２２】 【００２６】 以下、実施例を用いて本発明の内因性グルタチオン増強 （グルタチオンの定量方法２） 剤を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定さ 細胞内グルタチオンの定量はＤＴＮＢ法を用いて行った れるものではない。なお、本発明において、用いた方法 30 。１５ｍＬの１２５ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７ を以下に記載した。 ．５、６．２５ｍＭ 【００２３】 ＴＮＢ、１０μＬの１０００ｕ／ｍＬグルタチオンレダ （グルタチオンの定量方法１） クターゼを混合し反応液とした。９６ｗｅｌｌ Analytica Chimica Acta, 205 (1988) 29-41に記載され ｔｅに、８０μＬのグルタチオン標準液または細胞抽出 た方法に準じてグルタチオンの定量を以下のようにして 液と、８０μＬの反応液とを添加した。さらに、４０μ 行った。下記細胞内グルタチオンの抽出における方法に Ｌの１．０５ｍＭ 従って得られた細胞抽出液５０μＬに、０．２％ＡＢＤ 、プレートリーダーのカイネティックモード（吸光度４ −Ｆ（4-fluoro-7-sulfamoylbenzofurazan）溶液（５ｍ ０５ｎｍ）で１分３０秒測定した。その反応速度からグ Ｍ ルタチオン量を計算した。 ＥＤＴＡを含む０．７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ ５ ｃｅｌｌ/ ｐｌａｔｅに播種し、１０％ ＢＡＰＳ／０．１ Ｋ２ ＨＰＯ４ を添加し ＥＤＴＡ）、５ｍＬの６ｍＭ Ｄ ｐｌａ ＮＡＤＰＨを添加して反応を開始し ｐＨ９．３）に溶解）を２５０μＬ加え、６０℃、５分 40 【００２７】 間反応させた。冷却後、酢酸エチル５００μＬ加え攪拌 （脱脂米糠の製造） し１５，０００ｒｐｍ、４℃、１分間遠心後、酢酸エチ 精米工場からの生糠を７０∼１００℃に加熱することに ル層を取り除いた。この操作を３回行い、未反応のＡＢ より、生糠に残留するリパーゼを失活させ、油が絞りや Ｄ−Ｆを除去した。水層に２％ＳＢＤ−Ｆ（4-fluoro-7 すい状態にしてレイノルズ社（ドイツ）製の搾油機ＡＰ -sulfobenzofurazan, ammonium salt）溶液（５ｍＭ １４／２２を用いて搾油した。圧搾された油と（半）脱 ＥＤＴＡを含む０．７Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ 脂米糠を分離し、半脱脂米糠には３∼５倍量のエタノー ９．３）に溶解）、１０％ＴＢＰ(tri-n-butylphosphin ルを入れ、３０∼６０℃で０．５∼４時間撹拌し、その e)溶液（２−プロパノール／アセトニトリル（２:９８ 後５Ａの濾紙にてろ過した。この撹拌とろ過を再度繰り ）で希釈）をそれぞれ２５μＬずつ加え、６０℃、２０ 返し、半脱脂米糠を７０℃以下の通風乾燥機で半脱脂米 分間反応させた。冷却後、４Ｍ 糠の水分が５％以下になるように乾燥し、脱脂米糠を得 ＨＣｌを５０μＬ加え 50 ( 5 ) JP 2015-166327 7 A 2015.9.24 8 た。 ＰＬＣ用移動相（５０ｍＭ酢酸アンモニウム，ｐＨ４． 【００２８】 ３，３５％メタノール）に溶解し、生成したＮ−アセチ （米糠タンパクの調製） ルトリプタミンをＨＰＬＣにより定量することにより、 ２５０ｍｌの水に１．０ｇのＮａＯＨを溶解し、ｐＨを ＮＡＴ活性を測定した。ＨＰＬＣの分析には、カラムに １２．５付近に調整したアルカリ溶液に上記のようにし ＣＯＳＭＯＳＩＬ て得た脱脂米糠２５ｇを加え、４５℃の温度で攪拌しな ×１５０ｍｍ）を、ＨＰＬＣ用移動相に５０ｍＭ酢酸ア がら２時間抽出した。遠心分離機により、ろ液とろ過物 ンモニウム，ｐＨ４．３，３５％メタノール（流速１ｍ に分け、ろ過物にさらに上記アルカリ溶液を２５０ｍｌ Ｌ／分）を用いた。検出には、蛍光検出器（励起波長： 加え、同様に抽出した。得られたろ液を併せて１∼２規 ２８５ｎｍ、蛍光波長：３６０ｎｍ）を用いた。 定の希塩酸でｐＨ４に調整することにより、タンパク質 10 【００３１】 を溶液中に沈殿させた。これを再度、遠心分離機でろ液 実施例１ とろ過物に分けた後、ろ過物を４０℃で減圧乾燥して米 （ウマミザイムＧによる米糠由来タンパク質加水分解物 糠タンパクとして回収した。得られた米糠タンパクのタ の調製） ンパク含量はデュマ法で７７．３％であった。 上記で得た米糠タンパク２ｇをプラスチック製５０ｍＬ 【００２９】 コニカルチューブにとり、蒸留水４０ｍＬに懸だくし、 （ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞の作成） ５規定ＮａＯＨによりｐＨを７．５に調整した。ウマミ 動物細胞用発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）（ライ ザイムＧ（アマノエンザイム社製）を２０ｍｇ加え、反 フテクノロジーズ社製）に、ヒト由来セロトニン−Ｎ− 応温度を４５℃に設定した。反応装置は、エッペンドル アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）遺伝子を、Ｃ末 フ社製サーモミキサーコンフォートを用い、７５０ｒｐ 端にｍｙｃタグが付加するように組み込んだものを作成 20 ｍの攪拌を行って終夜反応を行った。終夜反応の後、静 した。このベクターを、Journal of Biological Chemis 置した状態で８０℃、３０分加熱して酵素を失活させた try, 276(26), 24097-24107(2001)に記載された方法と 。反応終了時においても、不溶物が残存していたので、 同様にして、アフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７細 反応液を２０００Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を 胞にリポフェクトアミン２０００試薬（ライフテクノロ 液体チッソにより凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フ ジーズ社製）を用いて形質転換し、ＮＡＴ発現細胞（Ｃ ラスコおよび装置を用いて、終日凍結乾燥を行い、ウマ ＯＳ／ＮＡＴ細胞）を得た。 ミザイムＧによる米糠由来タンパク質加水分解物１．２ 【００３０】 ｇ（収率７２．７％）を得た。 （ＮＡＴ活性の測定方法） 【００３２】 Journal of Biological Chemistry, 277(46), 44229-44 （ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果 235(2002)に記載された方法に準じてＮＡＴ活性の測定 30 を以下のようにして行った。ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を、１ ．５×１０ ５ ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ ５Ｃ１ ８ −ＭＳ−ＩＩ（４．６ｍｍ の評価） 得られた米糠タンパクのウマミザイムＧによるタンパク ｐｌ 質加水分解物上清の凍結乾燥物と、比較対象として、大 ａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＤＭＥＭ培地で３ 豆タンパク（不二製油社製、フジプロＥ）を同様にウマ ７℃、５％ＣＯ２ で４８時間培養した。培地交換後、被 ミザイムＧにより消化して得たタンパク質加水分解物上 験物質を終濃度５ｍｇ／ｍＬになるように添加し、２４ 清の凍結乾燥物を用い、ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオ 時間共培養した。その後培地を吸引し、１ｍＬのＰＢＳ ン濃度に対する影響を検討した。１．５×１０ で一回洗浄後、細胞を回収した。回収したＣＯＳ／ＮＡ Ｌ／３５ｍｍ Ｔ細胞を、終濃度１．５ｍＭアセチルＣｏ−Ａを含む０ 培養した後、各サンプルを、終濃度５ｍｇ／ｍＬになる ．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を０．５ｍＬ加え ように培地に加え、２４時間培養し、細胞を回収した。 ホモジナイズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃ 40 回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ で遠心し、上清を回収した。上清７５μＬに対し、６ｍ Ｍ ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１５， ＭアセチルＣｏ−Ａおよび８ｍＭトリプタミンを含む０ ０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した ．２５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）を２５μＬ加え、 。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を添加 ３７℃、１５分間反応させた。その後、氷冷したトルエ して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心 ン／イソアミルアルコール／１Ｎ塩酸混液（９９：０． した。さらに、５０μＬの４Ｍ ６６：０．３３）を１ｍＬ加えることによって、反応を て撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠心し 停止させた。反応混合液を、３０秒間激しく振とう後、 て上清を回収し、細胞抽出液とした。グルタチオンの定 １５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心した。遠心後 量は、上記定量方法１に従って行った。得られた結果を 、有機溶媒相を７５０μＬ回収し、溶媒を遠心エバポレ 図１に示す。 ーターで留去した。得られた乾燥物を、０．１ｍＬのＨ 50 【００３３】 ５ ／２ｍ ｄｉｓｈで、ＨｅｐＧ２細胞を４８時間 ＢＡＰＳ／０．１ Ｋ２ ＨＰＯ４ を添加し ( 6 ) JP 9 2015-166327 A 2015.9.24 10 実施例２ ０℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時に （ウマミザイムＧによる米由来タンパク質加水分解物の おいても、不溶物が残存していたので、反応液を２００ 調製） ０Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソによ 米タンパク２ｇ（オリザ油化社販売、オリザプロテイン り凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装 −Ｐ７０）をプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブ 置を用いて、終日凍結乾燥を行い、デナチームＡＰによ にとり、蒸留水４０ｍｌに懸だくし、５規定ＮａＯＨに る米由来タンパク質加水分解物０．２３ｇ（収率５６． よりｐＨを７．５に調整した。ウマミザイムＧ（アマノ ９％）を得た。 エンザイム社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４５℃に 【００３６】 設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキ （プロテアーゼＰによる米由来タンパク質加水分解物の サーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って 10 調製） 終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０ 米タンパク２ｇ（オリザ油化社販売、オリザプロテイン ℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時にお −Ｐ７０）をプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブ いても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００ にとり、蒸留水４０ｍＬに懸だくし、５規定ＮａＯＨに Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより よりｐＨを７．５に調整した。プロテアーゼＰ（アマノ 凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置 エンザイム社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４０℃に を用いて、終日凍結乾燥を行い、ウマミザイムＧによる 設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミキ 米由来タンパク質加水分解物１．０ｇ（収率７２．５％ サーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行って ）を得た。 終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８０ 【００３４】 ℃、３０分加熱して酵素を失活させた。反応終了時にお （ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果 20 いても、不溶物が残存していたので、反応液を２０００ の評価） Ｇで２０分間遠心分離し、その上清を液体チッソにより 得られた米タンパクのウマミザイムＧによるタンパク質 凍結し、ラブコンコ社製凍結乾燥用フラスコおよび装置 加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、実施例１と同様に を用いて、終日凍結乾燥を行い、プロテアーゼＰによる して、ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度に対する影 米由来タンパク質加水分解物０．２４ｇ（収率４７．５ 響を検討した。１．５×１０ ５ ｄ ％）を得た。 ｉｓｈで、ＨｅｐＧ２細胞を４８時間培養した後、サン 【００３７】 プルをそれぞれ終濃度０、２．５、５、７．５、１０ｍ （ＨｅｐＧ２細胞を用いた内因性グルタチオン増強効果 ｇ／ｍＬとなるように培地に加え、２４時間培養し、細 の評価） 胞を回収した。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ 実施例２で得られた米タンパクのウマミザイムＧによる ＡＰＳ／０．１Ｍ ／２ｍＬ／３５ｍｍ Ｂ ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイ 30 タンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物および、米タン ズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、 パクのデナチームＡＰあるいはプロテアーゼＰによるタ 上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％ ンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、実施例１ 過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５ と同様にして、ＨｅｐＧ２細胞内のグルタチオン濃度に 分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ 対する影響を検討した。ヒト肝がん細胞ＨｅｐＧ２を１ Ｋ２ Ｈ ５ ＰＯ４ を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分 ．５×１０ 、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。グ ａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＭＥＭ培地で３７ ルタチオンの定量は、上記定量方法１に従って行った。 ℃、５％ＣＯ２ で４８時間培養した。培地交換後、被験 得られた結果を図２に示す。 物質を終濃度２．５、５、１０ｍｇ／ｍＬになるように 【００３５】 実施例３ ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅｌｌ ｐｌ 添加し、２４時間共培養した。培地を吸引し、１ｍＬの 40 ＰＢＳで二回洗浄後、細胞をセルスクレーパーで回収し （デナチームＡＰによる米由来タンパク質加水分解物の た。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ ＢＡＰＳ／０ 調製） ．１Ｍ 米タンパク２ｇ（オリザ油化社販売、オリザプロテイン ５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収 −Ｐ７０）をプラスチック製５０ｍＬコニカルチューブ した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％過塩素酸を にとり、蒸留水４０ｍＬに懸だくし、５規定ＮａＯＨに 添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で よりｐＨを７．５に調整した。デナチームＡＰ（ナガセ 遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ ケムテックス社製）を２０ｍｇ加え、反応温度を４０℃ 加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃で遠 に設定した。反応装置は、エッペンドルフ社製サーモミ 心して上清を回収し、細胞抽出液とした。細胞内グルタ キサーコンフォートを用い、７５０ｒｐｍの攪拌を行っ チオンの定量は、上記定量方法２に従って行った。得ら て終夜反応を行った。終夜反応の後、静置した状態で８ 50 れた結果を図３に示す。 ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイズした。１ Ｋ２ ＨＰＯ４ を添 ( 7 ) JP 11 2015-166327 A 2015.9.24 12 【００３８】 上清を回収した。上清１００μＬに８．４μＬの６０％ 実施例４ 過塩素酸を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１５ （ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いた内因性グルタチオン増強 分、４℃で遠心した。さらに、５０μＬの４Ｍ 効果の評価） ＰＯ４ を添加して撹拌後、１５，０００ｒｐｍ、１０分 実施例２で得られた米タンパクのウマミザイムＧによる 、４℃で遠心して上清を回収し、細胞抽出液とした。細 タンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物および、実施例 胞内グルタチオンの定量は、上記定量方法２に従って行 ３で得られた米タンパクのデナチームＡＰによるタンパ った。得られた結果を図４及び図５に示す。 ク質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、実施例３にお 【００３９】 ける評価方法と同様にして、ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞内のグ 実施例５ ルタチオン濃度に対する影響を検討した。ＣＯＳ／ＮＡ 10 （ＣＯＳ／ＮＡＴ細胞を用いたＮＡＴ活性増強効果の評 Ｔ細胞を１．５×１０ ｌｌ ５ ｃｅｌｌ／ｍＬの濃度で６ｗｅ Ｋ２ Ｈ 価） ｐｌａｔｅに播種し、１０％ＦＢＳ入りのＭＥＭ 実施例１で得られた米糠タンパクのウマミザイムＧによ 培地で３７℃、５％ＣＯ２ で４８時間培養した。培地交 るタンパク質加水分解物上清の凍結乾燥物および、比較 換後、被験物質を終濃度２．５、５、１０ｍｇ／ｍＬに 対象として、大豆タンパク（不二製油社製、フジプロＥ なるように添加し、２４時間共培養した。培地を吸引し ）を同様にウマミザイムＧにより消化して得たタンパク 、１ｍＬのＰＢＳで二回洗浄後、細胞をセルスクレーパ 質加水分解物上清の凍結乾燥物を用い、ＣＯＳ／ＮＡＴ ーで回収した。回収した細胞に１５０μＬの１ｍＭ Ｂ 細胞内のＮＡＴ活性に対する影響を検討した。前述した ＨＣｌを添加し、３０秒ホモジナイ ＮＡＴ活性の測定方法に従って、ＮＡＴ活性の測定を行 ＡＰＳ／０．１Ｍ ズした。１５，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、 った。得られた結果を図６に示す。 【図１】 【図４】 【図２】 【図５】 【図３】 ( 8 ) JP 2015-166327 A 2015.9.24 【図６】 ──────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. Ａ２３Ｌ ＦＩ 1/305 (2006.01) テーマコード（参考） Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ２３Ｌ (72)発明者 畑中 川上 坪井 守谷 学校法人就実学園内 智恵 岡山県岡山市中区西川原一丁目６番１号 (72)発明者 福森 川上 藤田 株式会社サタケ内 晃司 東京都千代田区外神田四丁目７番２号 (72)発明者 学校法人就実学園内 武 東京都千代田区外神田四丁目７番２号 (72)発明者 岡山県農林水産総合センター生物科学研究所内 誠二 岡山県岡山市中区西川原一丁目６番１号 (72)発明者 岡山県農林水産総合センター生物科学研究所内 賀代子 岡山県加賀郡吉備中央町吉川７５４９−１ (72)発明者 1/305 唯史 岡山県加賀郡吉備中央町吉川７５４９−１ (72)発明者 Ｙ 株式会社サタケ内 明子 東京都千代田区外神田四丁目７番２号 Ｆターム(参考) 4B018 MD20 MD50 ME14 MF01 4C084 AA02 AA03 AA06 BA44 MA52 NA14 ZC192 ZC212 4C088 AB74 AC04 AD18 BA16 株式会社サタケ内 CA14 MA16 MA35 MA37 MA41 MA43 CA22 CA25 MA52 NA14 ZC19 ZC21
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