弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌効果の基礎的検討および
食品・畜産分野への適用に関する研究
Basic Study on Microbicidal Effect of Weak Acid Hypochlorous Solution
and Application in Field of Food and Livestock Industry
小 野 朋 子
年
目次
第１章
緒言
1.1 食品製造分野における微生物制御の必要性および問題点 ----------------
1
1.2 畜産分野における微生物制御の必要性および問題点
-------------------
2
------------------------------------
3
-----------------------------------------------
4
1.3 塩素系消毒剤の種類および特徴
1.4 本論文の構成と概要
第2章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の調整および特徴
2.1 弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌機序
2.2 弱酸性次亜塩素酸水溶液の安全性
---------------------------------
6
-----------------------------------
8
第3章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の各種微生物に対する基礎的な殺菌効果の検証
3.1 はじめに
--------------------------------------------------------- 10
3.2 材料および方法
3.2.1 次亜塩素酸水溶液の調製 ------------------------------------ 11
3.2.2 供試微生物 ------------------------------------------------ 12
3.2.3 菌液の調整 ------------------------------------------------ 13
3.2.4 殺菌試験 -------------------------------------------------- 15
3.3 結果および考察 ---------------------------------------------------- 15
3.4 まとめ
---------------------------------------------------------- 20
第4章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の浮遊芽胞菌および付着芽胞菌に対する殺菌効果
4.1 はじめに ---------------------------------------------------------- 22
4.2 材料および方法
4.2.1 次亜塩素酸水溶液の調製 ------------------------------------ 23
4.2.2 菌液の調整 ------------------------------------------------ 23
4.2.3 水溶液中に浮遊した芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の殺菌試験 --- 24
4.2.4 各種部材表面に付着した芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の殺菌試験 24
4.3 結果および考察
4.3.1 水溶液中に浮遊した芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の殺菌効果 --- 25
4.3.2 各種部材表面に付着した芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の
殺菌効果 ------------------------------------------------- 29
4.4 まとめ -----------------------------------------------------------
31
第5章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の生鮮野菜に対する殺菌効果および界面活性剤併用効果の検討
5.1 はじめに ---------------------------------------------------------- 33
5.2 材料および方法
5.2.1 次亜塩素酸水溶液および界面活性剤添加次亜塩素酸水溶液の調製 - 34
5.2.2 界面活性剤添加次亜塩素酸水溶液の性質 ----------------------
35
5.2.3 B.cereus 芽胞の調製 ---------------------------------------
35
5.2.4 B.cereus 芽胞に対する殺菌効果 ----------------------------- 36
5.2.5 キュウリおよびアオネギの洗浄殺菌 -------------------------- 36
5.3 結果および考察
5.3.1 界面活性剤添加次亜塩素酸水溶液の性質 ---------------------- 37
5.3.2 B.cereus 芽胞に対する殺菌効果 -----------------------------
39
5.3.3 キュウリおよびアオネギの洗浄殺菌効果 ---------------------- 40
5.4 まとめ
---------------------------------------------------------- 42
第6章
弱酸性次亜塩素酸水溶液のハクサイ殺菌への適用およびクロロホルム生成量の検討
6.1 はじめに --------------------------------------------------------- 43
6.2 材料および方法
6.2.1 弱酸性次亜塩素酸水溶液および次亜塩素酸ナトリウム水溶液の調製 44
6.2.2 ハクサイに付着する生菌数の測定 --------------------------
44
6.2.3 弱酸性次亜塩素酸水溶液を用いたハクサイの洗浄殺菌試験 ----
45
6.2.4 弱酸性次亜塩素酸水溶液で洗浄した場合のクロロホルムの生成量
47
6.3 結果および考察
6.3.1 ハクサイに付着する生菌数 --------------------------------
47
6.3.2 弱酸性次亜塩素酸水溶液を用いたハクサイの洗浄殺菌試験 ----
48
6.3.3 弱酸性次亜塩素酸水溶液で洗浄した場合のクロロホルムの生成量
50
6.4 まとめ ----------------------------------------------------------
52
第7章
弱酸性次亜塩素酸水溶液を鶏への飲水に用いた場合の殺菌効果,生産性および安全性へ
の影響
7.1 はじめに --------------------------------------------------------
54
7.2 材料および方法
7.2.1 弱酸性次亜塩素酸水溶液の調製 ----------------------------- 55
7.2.2
弱酸性次亜塩素酸水溶液の供給システム -------------------- 56
7.3 評価項目
7.3.1 残留塩素濃度 --------------------------------------------- 58
7.3.2 生菌数の測定 --------------------------------------------- 58
7.3.3 育成率および生存率ならびに産卵率の算出 ------------------- 59
7.3.4 臓器重量・血液性状・組織学的検査 ------------------------- 59
7.4 結果および考察
7.4.1 残留塩素濃度および生菌数 ---------------------------------
60
7.4.2 育成率および生存率ならびに産卵率
------------------------
64
7.4.3 臓器重量・血液性状・組織学的検査 -------------------------
66
7.5 まとめ -----------------------------------------------------------
69
第8章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による種卵消毒への適用
8.1 はじめに
------------------------------------------------------
71
8.2 材料および方法
8.2.1 弱酸性次亜塩素酸水溶液の調製 ----------------------------
72
8.2.2 弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による付着 S.aureus に対する
殺菌試験
----------------------------------------------
72
8.2.3 弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による卵殻表面の一般生菌に
対する殺菌試験
----------------------------------------
73
8.2.4 種鶏場における弱酸性次亜塩素酸水溶液噴霧による種卵消毒 --
74
8.3 結果および考察
8.3.1 弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による S.aureus および
卵殻表面の一般生菌に対する殺菌効果 ----------------------
76
8.3.2 種鶏場における弱酸性次亜塩素酸水の噴霧による種卵消毒効果
および孵化率 --------------------------------------------
79
8.4 まとめ ----------------------------------------------------------
82
第9章
総括
---------------------------------------------------------------- 83
引用文献 ---------------------------------------------------------------- 88
謝辞
------------------------------------------------------------------ 100
Summary
摘要
--------------------------------------------------------------- 102
------------------------------------------------------------------ 108
学位論文の基礎となる学術論文 ------------------------------------------- 112
参考論文
-------------------------------------------------------------- 114
第 1章
緒言
1.1 食 品 製 造 分 野 に お け る 微 生 物 制 御 の 必 要 性 お よ び 問 題 点
我 が 国 の 2013 年 の 食 中 毒 の 発 生 件 数 は 93 1 件 ， 患 者 数 は 20,80 2 人 ， う ち
死 者 1 人 で あ り ， 前 年 度 2012 年 よ り は い ず れ も 減 少 し て い る も の の ,依 然 多
くの食中毒が発生している
1)
。 ま た ， 201 1 年 に 生 レ バ ー ， ユ ッ ケ を 原 因 食 材
と し た 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 О 157，О 1 11 に よ る 集 団 食 中 毒 が
2-3)
，2 012 年 に は ，
浅 漬 け を 原 因 食 材 と し た 腸 管 出 血 性 大 腸 菌 О 157 に よ る 集 団 食 中 毒
年には給食用のパンを原因食材としたノロウイルスの集団食中毒
4)
が ,2 014
5）
が発生す
るなど，依然として大規模な集団食中毒も頻発している。特に病院，福祉施
設，学校などでは，一度に大量の食事が調理されているため，有害微生物が
混入・繁殖すると多くの喫食者に影響を与える。そのため，同一メニューを
1 回 300 食 以 上 ま た は 1 日 750 食 以 上 を 提 供 す る 調 理 施 設 で は HACCP の 概 念
に基づき大量調理施設衛生管理マニュアルが適用されている
6)
。
一 方 ， 2011 年 度 の わ が 国 の 1 人 あ た り の 1 年 間 の 野 菜 の 消 費 量 は 91.1 kg
であり，年々減少傾向にあるものの，近年の健康志向や，生活様式の変化な
ど か ら ，カ ッ ト 野 菜 の 消 費 量 は 逆 に 増 加 傾 向 に あ る
7)
。生 食 用 カ ッ ト 野 菜 は ，
野菜の細胞を切断した際に細胞液が漏出し，細胞液を栄養源として微生物が
増加し易い条件となる上，消費まで加熱工程がないため，微生物学的リスク
が高い食品である
8-9)
。そのため，カット野菜製造工場では，野菜の栽培段
階で付着した微生物の残存や，加工中の二次汚染のリスクを内包しており，
近年，カット野菜を介した集団感染事例も多く報告されている
10-11)
現在，これらの食品製造現場において，食材の洗浄殺菌に最もよく使用さ
れている殺菌剤は次亜塩素酸ナトリウムである。次亜塩素酸ナトリウムは殺
菌 効 果 が 高 く ，抗 菌 ス ペ ク ト ル が 広 く か つ 安 価 で あ り ,大 量 調 理 施 設 衛 生 管 理
マ ニ ュ ア ル で も 生 鮮 果 物 お よ び 野 菜 の 殺 菌 に 有 効 塩 素 濃 度 100 ～ 200 ppm の 次
亜塩素酸ナトリウムを用いることが推奨されている
6)
。
しかしその半面，塩素臭が食材に残存し商品価値が低下する，食材成分と
塩素分が反応してトリハロメタンが生成するなど等の課題を抱えている
12-14)
。 ま た ,次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム は 使 用 の 都 度 ， 希 釈 調 製 す る 必 要 が あ る
ため使用現場での手間が煩雑であり，希釈ミスや不適正な使用方法にによっ
て殺菌が不十分となり食中毒が発生した事例も報告されている
15-16)
。そ の た
め，次亜塩素酸ナトリウムの欠点を克服し，より確実かつ効果的に殺菌に使
用できる技術が求められている。
1.2
畜産分野における微生物制御の必要性および問題点
養鶏をはじめとする畜産分野においては同種の動物を同じ場所で高密度飼
育 す る こ と か ら ，感 染 症 の リ ス ク が 非 常 に 高 い 。近 年 で は 2011 年 に 高 病 原 性
ト リ イ ン フ ル エ ン ザ (H1N1 型 ) 1 7 - 1 8 ) お よ び 牛 口 蹄 疫 が 発 生 し 大 き な 問 題 と な
った
19-20）
。こ れ ら の 感 染 症 が 発 生 す る と ，多 く の 動 物 に 感 染 し て 死 亡 す る だ
けでなく，感染を食い止めるために同畜舎・農場内の家畜の淘汰や発生農場
か ら 半 径 10 k m 圏 内 の 農 場 で の 家 畜 の 移 動 制 限 な ど が 行 わ れ る た め ， 経 済 的
な損失も莫大である。
これまで家畜の感染症は各種抗生物質を投与することで制御してきたが，
過剰の抗生物質投与は薬剤耐性微生物を産生し，畜産分野のみならず医療現
場での薬剤耐性微生物による院内感染の原因にもなっていることが報告され
ており
21-22)
，抗 生 物 質 の 使 用 量 の 削 減 が 求 め ら れ て い る 。そ の た め ，今 後 は
動物の飼育環境の衛生管理を徹底することで，病気の蔓延を防止する方法に
転換しつつある。
また，サルモネラ菌，カンピロバクターおよび病原性大腸菌等が農場内で
動物や卵等に付着し，最終食品にまで残存して食中毒の原因になる事例も報
告されている
23-26)
。そ の た め ，食 品 の 安 全 性 の 観 点 か ら も 飼 育 農 場 で の 衛 生
管 理 が 重 要 視 さ れ て お り ， 農 林 水 産 省 で は 生 産 農 場 に お け る 農 場 HACCP を 推
進 し て い る 。2 009 年 に は 畜 産 農 場 の 飼 養 衛 生 管 理 向 上 の 取 り 組 み 認 証 基 準 が
公表され，畜産現場での衛生管理の取り組みはさらに進みつつある。
農場内の衛生管理には，現在多種の消毒剤が使用されているが，主として
畜舎の環境消毒や出入口の靴底には逆性石鹸，畜舎内の燻蒸や受精卵の消毒
にはホルマリンが使用されている
27-29）
。し か し ，逆 性 石 鹸 は 抗 菌 ス ペ ク ト ル
が 狭 く ，口 蹄 疫 ウ イ ル ス や 芽 胞 菌 に は 効 果 が な い
30)
。ま た ，ホ ル マ リ ン は ヒ
ト に 対 す る 発 が ん 性 が あ り ，2009 年 に 労 働 安 全 衛 生 法 の 第 3 類 か ら 第 2 類 物
質に引き上げられ，管理濃度の設定や作業環境測定の義務化など，取扱いが
厳格化されている
31-33)
。そ の た め ，畜 産 分 野 に お い て は 殺 菌 効 果 が 高 く か つ
安全性が高い消毒剤の開発およびその適正な使用が求められている。
1.3
塩素系消毒剤の種類および特徴
前述の食品および畜産分野で汎用されている消毒剤の 1 つとして塩素系消
毒剤が挙げられる。塩素系消毒剤の殺菌因子は有効塩素であり，これは遊離
塩素と結合塩素に大別される
13,34）
。
遊離塩素は殺菌効果が高く，抗菌スペクトルが広い反面，有機物の影響を
受けやすいという性質がある。遊離塩素を利用する消毒剤としては次亜塩素
酸 ナ ト リ ウ ム ，次 亜 塩 素 酸 カ ル シ ウ ム 等 が あ り ，い ず れ も 水 溶 液 の pH は ア ル
カリ性となる。
結 合 塩 素 は 次 亜 塩 素 酸 と ア ン モ ニ ア が 反 応 し た モ ノ ク ロ ラ ミ ン (NH 2 Cl)，ジ
ク ロ ラ ミ ン (NH Cl 2 ) ，ト リ ク ロ ラ ミ ン (NCl 3 )の 総 称 で あ る
35-36)
。殺 菌 効 果 は 遊
離 塩 素 と 比 較 す る と ， 99 ％ CT 値 が E.coli で 1900 ～ 5300 倍 ， ジ ア ル ジ ア で
16～ 23 倍 ， ウ イ ル ス で 214 倍 の 値 と な る こ と が 報 告 さ れ て お り
37)
，遊離塩
素よりも低い。しかし，水中での残留効果が高い特徴を持つ。消毒の過程で
遊 離 塩 素 を 使 用 し た 場 合 に ,有 機 物 や ア ン モ ニ ア と 反 応 し て 結 合 塩 素 が 生 成
し ,副 次 的 に 殺 菌 に 寄 与 す る 他 ,意 図 的 に ア ン モ ニ ア を 添 加 し 結 合 塩 素 を 生 成
させて殺菌やスライムの除去に用いる方法も一部の浄水場や温浴設備等で使
用されている
38-39）
。
塩素系消毒剤は食品，畜産分野のみならず，医療，福祉施設，家庭など広
範囲で使用されている。しかし，使用時の希釈の煩雑性や食品の異臭味，ト
リハロメタンの発生，金属の腐食などのデメリットを有する。
本研究では，塩素系消毒剤の持つデメリットを克服した消毒剤として，次
亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム の pH を 弱 酸 性 に 調 整 し た 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 (Weak
Acid Hypochlo rous So lution： 以 下 ， 図 表 表 記 を WAHS と 略 す ) を 開 発 し ,食 品
および畜産分野における消毒剤としての適用を検討した。
1． 4
本論文の構成と概要
本論文は，弱酸性次亜塩素酸水溶液の食品および畜産分野での有用な適用
方法の検討を目的とした一連の研究結果を記述したものであり，全 9 章から
構成される。各章の概要を以下に記す。
第 2 章 で は ,弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 調 整 方 法 お よ び そ の 特 徴 に つ い て
記述した。
第 3 章 で は ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 基 礎 的 な 殺 菌 効 果 を 確 認 す る た め ，
各種微生物の標準株および臨床分離株に対する殺菌，殺カビおよびウイルス
不 活 化 効 果 の 検 討 を 行 っ た 。ま た ，pH を 調 整 し た こ と に よ る 殺 菌 効 果 の 増 強
を 確 認 す る た め ， 各 pH に お け る 殺 菌 効 果 の 違 い に つ い て も 検 討 し た 。
第 4 章では，微生物の中でも特に消毒剤耐性が強い芽胞形成菌に着目し，
弱酸性次亜塩素酸水溶液の各種芽胞への有効な接触時間および有効塩素濃度
の探索を行った。また，実使用条件を想定し，ステンレス鋼，プラスチック
および布に付着した芽胞に対する殺菌効果についても検討した。
第 5 章では，食品分野での適用の一例として，生野菜の殺菌効果について
検討を行った。本章では特に，カット野菜の材料として，殺菌が特に困難な
キュウリおよびアオネギの洗浄殺菌法について詳細に検討した。
第 6 章では，食品分野で実際の食品製造工場での製造ラインへの適用を想
定 し ，漬 物 の 原 料 と な る ハ ク サ イ を 短 時 間 で 殺 菌 す る 方 法 に つ い て 検 討 し た 。
また，消毒副生成物であり，トリハロメタンの一種であるクロロホルムの生
成量についても測定した。
第 7 章では，畜産分野での適用の一例として，養鶏場での衛生管理の一環
に，鶏への飲用水に弱酸性次亜塩素酸水溶液を利用した場合の飲用水の殺菌
効果および鶏に対する生産性および安全性への影響について検討を行った。
第 8 章 で は ，畜 産 分 野 で の 適 用 の 一 例 と し て ，ブ ロ イ ラ ー 種 鶏 の 種 卵 (受 精
卵 )消 毒 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 を 適 用 す る こ と を 目 的 と し ，弱 酸 性
次亜塩素酸水溶液を噴霧した場合の卵殻表面の微生物に対する殺菌効果およ
び孵化率について検討を行い，現行のホルマリン燻蒸法との比較を行った。
第 9 章では，本研究結果を総括した。
第 2章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の特徴
2.1
弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌機序
Fig.2-1 に 次 亜 塩 素 酸 の 水 中 で の 存 在 形 態 と pH と の 関 係 を 示 す 。次 亜 塩 素
酸 (HClO)の 解 離 定 数 ( p K a )は 25 ℃ で 7.5 で あ り
40)
，溶 液 の p H に 依 存 し て 形 態
が変化することが知られている。アルカリ域ではイオン形の次亜塩素酸イオ
ン （ OCl - ） の 割 合 が 大 き く ， pH を 低 下 さ せ る と 分 子 型 の 次 亜 塩 素 酸 (HClO)の
割 合 が 増 加 す る 。さ ら に 強 酸 性 域 に な る と 有 効 塩 素 の 一 部 は 塩 素（ Cl 2 ）と な
り ， 気 相 に 飛 散 す る 。 pH 6 の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で は 有 効 塩 素 の 97 %
が 次 亜 塩 素 酸 （ HClO ）， 3 % が 次 亜 塩 素 酸 イ オ ン （ ClO - ） と し て 存 在 し て い る
。
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41-42)
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次亜塩素酸水溶液の殺菌効果は，全有効塩素濃度ではなく次亜塩素酸
(HClO)の 濃 度 に 強 く 依 存 す る
43)
。次 亜 塩 素 酸 の 殺 菌 機 序 は 酸 化 に よ る 細 胞 壁
お よ び 生 体 膜 の 損 傷 ， 酵 素 活 性 の 失 活 ， D NA の 損 傷 ， イ オ ン 透 過 性 の 障 害 等
と さ れ て い る が ，特 に 細 菌 の 形 質 膜 の 膜 透 過 性 が pH 域 に よ っ て 大 き く 変 化 す
る こ と が 知 ら れ て い る 。 Fig.2-2 に 細 菌 に 対 す る 次 亜 塩 素 酸 の 膜 透 過 性 お よ
び 殺 菌 機 能 の 概 念 図 を 示 す 。 一 般 に ,細 胞 の 最 外 部 に は 細 胞 壁 , そ の 内 側 に は
形質膜という生体膜が存在する。細胞壁はイオンや低分子の親水性分子を容
易 に 透 過 さ せ る の に 対 し ,リ ン 脂 質 二 重 層 を 基 本 構 造 と す る 形 質 膜 は イ オ ン
や 低 分 子 量 分 子 の 透 過 を 妨 げ る 。そ の た め ,負 の 電 荷 を 持 つ 次 亜 塩 素 酸 イ オ ン
(ClO - ) は 容 易 に 形 質 膜 を 通 過 で き ず ， 細 胞 壁 お よ び 形 質 膜 の 外 側 か ら の み 酸
化 作 用 を 及 ぼ し て 殺 菌 を 行 う 。一 方 ,分 子 型 の 次 亜 塩 素 酸 (HClO )は 受 動 拡 散 に
よって微生物の細胞壁と形質膜を通過して菌体の内部と外部の両面から酸化
作 用 を 与 え る 。細 胞 内 に 進 入 し た 次 亜 塩 素 酸 (HClO)は ,脂 質 二 重 層 や 膜 輸 送 タ
ン パ ク 質 ,細 胞 質 お よ び 形 質 膜 に 存 在 す る 酵 素 系 ,核 酸 ,リ ボ ソ ー ム な ど に 酸
化 作 用 を 及 ぼ す た め , 次 亜 塩 素 酸 イ オ ン (OC l - ) よ り も 殺 菌 効 果 お よ び 殺 菌 速
度が増大する
34)
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弱酸性次亜塩素酸水溶液の安全性
弱酸性次亜塩素酸水溶液の生体に対する安全性についてはマウスおよびラ
ットを用いた経口投与試験，眼刺激試験，皮膚感作試験において検討されて
い る 。こ れ ら の 試 験 に よ り ,有 効 塩 素 濃 度 20 0 ppm の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液
の安全性は水道水と差がないことが確認されている
44-46)
。ま た ，ラ ッ ト へ の
噴霧吸入試験により噴霧粒子の吸入の安全性も確認されているが，噴霧粒子
の 吸 入 に よ る 体 重 ,血 液 性 状 お よ び 肺 等 の 組 織 へ の 悪 影 響 も 認 め ら れ な か っ
た
47-48)
。 そ の た め ,空 間 中 に 霧 化 さ せ て 噴 霧 し ， 浮 遊 菌 対 策 に 使 用 す る こ と
も可能である。
ま た ,塩 素 系 の 消 毒 剤 は ，有 機 物 と 反 応 し て 発 が ん 性 物 質 で あ る ト リ ハ ロ メ
タンが生成する問題が知られている
49)
。ト リ ハ ロ メ タ ン の 生 成 量 は ア ル カ リ
域で多く，弱酸性域では次亜塩素酸ナトリウムと比較してトリハロメタンの
生 成 量 は 10 分 の 1 程 度 と な る こ と が 報 告 さ れ て お り ，安 全 性 の 高 い 資 材 で あ
る
50)
。
弱酸性次亜塩素酸水溶液は次亜塩素酸ナトリウムと同様，有機物，温度，
紫 外 線 な ど の 要 因 で 次 亜 塩 素 酸 が 分 解 し て 塩 (NaCl) に な り , 有 効 塩 素 濃 度 が
低下する
51-53）
。 pH に よ る ウ シ 血 清 ア ル ブ ミ ン (BSA)お よ び ペ ク チ ン に 各 pH
の 次 亜 塩 素 酸 を 接 触 さ せ た 場 合 ， p H が 4. 5～ 6.0 の 範 囲 で 有 効 塩 素 濃 度 の 残
存率が高い傾向が認められているものの，有機物の共存により殺菌効果は低
下することが報告されている
54）
。反 面 ，環 境 負 荷 が 低 く 高 濃 度 で 大 量 に 使 用
する場合以外は排水時に中和処理の必要がない
55)
。
弱酸性次亜塩素酸水溶液の国内の各種法的位置づけとしては，特定化学物
質 ，危 険 物 ，毒 劇 物 , 医 薬 品 の い ず れ に も 該 当 し な い 。食 品 分 野 で は ，使 用 時
に用事調製したものは食品添加物として認可されており，食品や器具の殺菌
に用いることが可能である
56)
。
第 3章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の各種微生物に対する基礎的な殺菌効果の検証
3.1
はじめに
塩 素 は ， 1774 年 に ス ウ ェ ー デ ン の 化 学 者 C.W.Scheele に よ っ て 発 見 さ れ ，
1810 年 に 英 国 の 化 学 者 H.Davy に よ っ て ’ 塩 素 (Chlorine )’ と 名 付 け ら れ て
以 来 ，世 界 中 で 使 用 さ れ て い る 消 毒 資 材 の 1 つ で あ る
57)
。塩 素 系 消 毒 剤 の 中
で も ，次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム (NaClO) は 高 い 殺 菌 効 果 と 広 い 抗 菌 ス ペ ク ト ル を
持つこと，液状で使用が容易であること，微生物や有機物と反応後は無害な
塩化物イオンに還元されること，安価であるなどの長所をもつことから，医
療・食品・畜産等の分野において汎用されている
58)
。
次亜塩素酸ナトリウムは医療分野においてはリネン・医療用具・環境に有
効 塩 素 濃 度 20 0～ 500 ppm で の 清 拭 あ る い は 浸 漬 で ，食 品 製 造 分 野 に お い て は
器 具 や 食 材 に 有 効 塩 素 濃 度 100～ 20 0 ppm で の 洗 浄 で 用 い ら れ て い る
59)
。し
かし，これらの有効塩素濃度で次亜塩素酸ナトリウムを用いた場合，使用時
に接液した金属部への腐食性があること，ヒトの粘膜への刺激や異臭がある
ことが問題となっている。また，食品分野の場合，次亜塩素酸ナトリウム特
有の塩素臭が異臭味としてクレームの原因になるだけでなく，食材の有機物
と反応して発がん性物質であるトリハロメタンが生成され食品中に残存する
という健康上の問題も存在する
49-50)
。 ま た ,異 臭 味 お よ び ト リ ハ ロ メ タ ン 除
去のため，後段の水洗工程にて大量の水ですすぐ必要があり，製造コストの
増加の一因となっている。
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は ，次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 の pH を 弱 酸 性 に
調 整 す る こ と で ， 水 中 に お け る 有 効 塩 素 中 の 分 子 型 の 次 亜 塩 素 酸 (HClO)の 割
合 を 増 加 さ せ て い る 。 荷 電 を 持 た な い 次 亜 塩 素 酸 (HClO )は 微 生 物 細 胞 内 に 速
や か に 浸 入 し ，細 胞 内 外 か ら 効 果 的 に 作 用 す る た め
34,53)
，次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ
ウムよりも低濃度かつ短時間で殺菌が可能となる。そのため金属への腐食や
異臭味が軽減され，殺菌処理後段の濯ぎの水量および時間も減少・短縮する
ことが可能である。
本 研 究 で は ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 基 礎 的 な 殺 菌 効 果 の 確 認 を 行 っ た 。
すなわち，弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌効果および抗菌スペクトルを明ら
かにするため，各種微生物の標準株および臨床分離株に対する殺菌およびウ
イルス不活化効果の検討を行った。また，次亜塩素酸ナトリウムとの殺菌効
果 を 比 較 す る た め ， p H を 弱 酸 性 ～ ア ル カ リ 性 域 に 調 整 し ， 各 pH に お け る 殺
菌効果の違いについても比較した。
3.2
材料および方法
3.2.1
次亜塩素酸水溶液の調製
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 原 料 と し て は ,い ず れ も 食 品 添 加 物 認 可 さ れ て
い る 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム (有 効 塩 素 濃 度 6 %)と 希 塩 酸 (8.5 %)を 使 用 し た 。
調 製 は 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 生 成 装 置 ( HSP-1000SME ( 株 )エ イ チ ・ エ ス ・ ピ
ー )を 用 い て 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム と 希 塩 酸 を 水 道 水 と 希 釈 混 合 し て 行 っ た 。
試 験 に あ た っ て は ,次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は 有 効 塩 素 濃 度 50 ppm， p H 5.0, 6.0,
7.0, 8.0 に 調 製 し ,p H は EH Controller P H-51（ (株 )IWA KI）， 有 効 塩 素 濃 度
は ハ ン デ ィ 水 質 計 ア ク ア ブ AQ-102 (柴 田 科 学 (株 ))を 用 い て 測 定 し た 。
3.2.2
供試微生物
供 試 微 生 物 と し て 標 準 株 は 細 菌 10 株 ， 真 菌 2 株 ， ウ イ ル ス は 1 株 を 用 い た 。
臨 床 分 離 株 は 細 菌 7 種 33 株 ，真 菌 は 4 種 1 4 株 を 用 い た 。Table 3 -1，Table 3-2
に各々標準株および臨床分離株の供試微生物を示す。
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3.2.3 菌 液 の 調 製
微 生 物 を 実 験 に 供 す に あ た り ，前 培 養 と し て 細 菌 の 場 合 は 標 準 寒 天 培 地 上 ，
Candida 属 は サ ブ ロ ー 寒 天 培 地 上 に て 24 時 間 ， Aspergillus niger は ポ テ ト
デ キ ス ト ロ ー ス 寒 天 培 地 上 で 7 日 間 ， い ず れ も 37 ℃ で 培 養 し た 。 培 養 後 ，
コロニーの一部を白金耳にて採取し，滅菌精製水中に接種菌数が
1.0×10 7 ~ 8 CFU/m L と な る よ う 懸 濁 し ， 供 試 菌 液 と し て 用 い た 。 芽 胞 菌 2 種
( Bacillus subtilis, B.cereus )は 1 4 日 間 ， 35 ℃ で 標 準 寒 天 培 地 上 に 前 培 養
して芽胞を形成させたコロニーを白金耳にて採取して滅菌生理食塩水に懸濁
し ， 60 ℃ ， 1 分 間 加 熱 し て 増 殖 型 細 胞 を 死 滅 さ せ た 後 ， 滅 菌 生 理 食 塩 水 に て
3000 rpm で 2 回 遠 心 洗 浄 し た も の を 芽 胞 懸 濁 液 と し た 。実 験 に あ た っ て は 芽
胞 懸 濁 液 を Meller 染 色 し ， 顕 鏡 に て 9 0 % 以 上 が 芽 胞 で あ る こ と を 確 認 し て
試 験 に 供 し た 。 大 腸 菌 フ ァ ー ジ Qβ は 高 密 度 集 積 培 養 状 態 で 冷 蔵 保 存 し た も
の を 使 用 し た 。 Qβ の 高 密 度 集 積 培 養 液 の 調 整 法
60-61)
を 以 下 に 示 す 。 Table
3-3 に 示 す 大 腸 菌 フ ァ ー ジ 定 量 用 液 体 培 地 10 mL に 宿 主 細 菌 で あ る 大 腸 菌
( Escherichia coli K -12F + A/λ )を 移 植 し て 37 ℃ ， 120 rpm ， 20±2 時 間 振
と う 培 養 し た 。そ の 培 養 液 を 大 腸 菌 フ ァ ー ジ 定 量 用 液 体 培 地 200 mL に 全 量 移
植 し ，こ れ に Q β 保 存 液 (10 9 PFU/mL )を 10 m L 接 種 し ，同 様 に 37 ℃ ，120 rpm，
5 時 間 振 盪 培 養 し Qβ を 増 殖 さ せ た 。 宿 主 菌 体 を 除 去 す る た め ， 培 養 液 を 遠
心 分 離 (4 ℃ ， 8000 rp m， 20 min)し た 後 ， 孔 径 0.45 μ m の メ ン ブ ラ ン フ ィ ル
タ ー (ADVANTEC MENBR ANE FILTERS Cat.No . A045A047A) を 用 い て 濾 過 し ， Qβ
高 密 度 集 積 培 養 液 (10 9 ～ 1 0 P FU/mL) を 得 た 。 試 験 に あ た っ て は ， 滅 菌 精 製 水 に
Qβ 数 が 10 7 PFU/ mL と な る よ う に 懸 濁 し た も の を Qβ 懸 濁 液 と し た 。
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3.2.4
殺菌試験
供 試 菌 液 お よ び 芽 胞 懸 濁 液 0.2 mL に 有 効 塩 素 濃 度 50 p pm の 次 亜 塩 素 酸 水
溶 液 1.8 mL を 加 え た の ち 速 や か に ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー を 用 い て 撹 拌 し ，室
温 に て 一 定 時 間 接 触 さ せ た 。 一 定 時 間 後 ， BHI 液 体 培 地 4.0 m L を 加 え て 次 亜
塩 素 酸 水 溶 液 中 の 残 留 塩 素 を 失 活 さ せ た 。 BHI 液 体 培 地 は 72 時 間 ， 37 ℃ で
培養後，目視にて培地の濁りの有無を確認し，濁りのあるものを陽性，ない
も の を 陰 性 と 判 定 し た 。 Aspergillus niger の 場 合 は ， 供 試 菌 液 に 前 述 と 同
様次亜塩素酸水溶液に接触させた後，被験液の一部を経時的に採取してポテ
ト デ キ ス ト ロ ー ス 培 地 に 0.1 mL 平 板 塗 布 し ， 24 ℃ , 7 日 間 培 養 し た 後 に シ
ャーレを観察し，コロニーが出現したものを陽性，しなかったものを陰性と
判 定 し た 。 Qβ の 場 合 は ， 前 述 と 同 様 Q β 懸 濁 液 に 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 に 接 触
さ せ た 後 ， 全 量 の 0. 1 %と な る よ う に チ オ 硫 酸 ナ ト リ ウ ム を 速 や か に 添 加 し
て残留塩素を失活させたものを処理液とし，大腸菌ファージ定量用培地を用
い た 二 層 寒 天 プ ラ ー ク 形 成 法 に よ り 3 7 ℃ ， 24 時 間 培 養 後 ， Qβ の プ ラ ー ク
の有無を確認し，プラークのあるものを陽性，ないものを陰性として判定し
た 。こ れ ら の 生 存 菌 の 検 出 限 界 は 細 菌 お よ び Candida.albicans は 0.5 CFU/mL，
A.niger は 10 CFU/mL , Qβ は 10 PF U/mL で あ っ た 。
殺菌効果は，標準菌株の場合は次亜塩素酸水溶液処理後に初めて陰性とな
っ た 接 触 時 間 ，す な わ ち 最 短 殺 菌 時 間 を 求 め 評 価 し た 。臨 床 分 離 株 の 場 合 は ，
次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 接 触 時 間 が 15 秒 の 条 件 で 菌 の 増 殖 が 見 ら れ た も の を 陽
性，見られなかったものを陰性とし，陰性となった菌株数を求め評価した。
3.3
結果および考察
Table3-4 に 各 種 標 準 株 に お け る 細 菌 ，カ ビ お よ び ウ イ ル ス に 対 す る 次 亜 塩
素酸水溶液の最短殺菌時間を示す。
全 て の 微 生 物 は pH 5 ～ 8 の 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で 15～ 3600 秒 で 殺 菌・不 活 化
されており，次亜塩素酸水溶液は本実験に供したすべての微生物に対して殺
菌効果を有していた。
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ま た ， 供 試 菌 種 に よ っ て 殺 菌 効 果 の 違 い が 認 め ら れ た 。 Psuedomonas
aeruginosa ， Escherichia coli ， Staphylococcus aureus ， Enterococcus
faecalis， Enterococcus faecium お よ び Q β は 全 て の pH 域 で 最 短 殺 菌 時 間
が 15 秒 と 最 も 短 い 時 間 で 殺 菌・不 活 化 さ れ た 。こ れ ら の 菌 種 は 次 亜 塩 素 酸 水
溶 液 に 対 し て 抵 抗 性 が 低 か っ た 。 Acinetobacter baumannii ， Salmonella
typhimurium ， C.albicans は pH 5 の 弱 酸 性 域 で は 1 5 秒 の 接 触 で 検 出 限 界 以
下 と な っ た が ，pH が 上 昇 す る に つ れ 最 短 殺 菌 時 間 が 長 く な り ，pH 8 の ア ル カ
リ 域 で は い ず れ も 30 秒 と な っ た 。こ の 結 果 よ り こ れ ら の 菌 種 は 次 亜 塩 素 酸 水
溶液に対して中程度の抵抗性を持つことが明らかとなった。
Stenotrophomonas maltophilia ， B.subtilis， B.cereus， A.niger は pH 6
の 場 合 で 最 短 殺 菌 時 間 が 各 々 60 秒 ，30 0 秒 ，600 秒 ，300 秒 と 他 の 微 生 物 よ り
も長く，次亜塩素酸水溶液に対して高い抵抗性を有していた。また，これら
の 菌 種 は 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の pH に よ っ て 殺 菌 効 果 に 大 き な 影 響 を 受 け た 。
例 え ば B.subtilis の 場 合 ， pH 5， 6 の 弱 酸 性 域 で は 最 短 殺 菌 時 間 は 300 秒 で
あ っ た が ， pH 8 の ア ル カ リ 性 域 で は 3600 秒 と 大 幅 に 長 く な っ た 。
Table 3-5 に 各 種 臨 床 分 離 株 に 対 す る 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 殺 菌 効 果 を 示 す 。
有 効 塩 素 濃 度 50 ppm ， 15 秒 間 接 触 の 条 件 下 で は ， 本 試 験 に 供 し た 細 菌 7 種
33 株 全 て に お い て 陰 性 と な っ た 。 Candida 属 に つ い て は pH 5～ 7 の 範 囲 で は
4 種 14 株 全 て が 陰 性 と な っ た が ，p H 8 で は C.albicans が 10 株 中 5 株 ，そ の
他 の Candida 属 4 種 の 全 て が 陽 性 と な っ た 。 こ の 結 果 よ り ， Candida 属 は 細
菌 と 比 較 し て 次 亜 塩 素 酸 に 対 す る 抵 抗 性 が 高 く ，そ の 殺 菌 効 果 は pH に よ る 影
響を受けることが明らかとなった。
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以 上 の 結 果 よ り ， 標 準 株 ， 臨 床 分 離 株 と も 弱 酸 性 域 で あ る pH 5.0， 6.0 に
お い て 殺 菌 効 果 が 高 い こ と が わ か っ た 。こ の 結 果 は ，p H の 違 い に よ る 塩 素 の
形態の違いからくるものと考えられる
62-63)
。次 亜 塩 素 酸 の 殺 菌 効 果 を よ り 詳
細 に 検 討 す る た め ，次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 に 対 し て 抵 抗 性 の 高 か っ た B.subtilis，
B.cereus， A.niger の 有 効 塩 素 中 の 次 亜 塩 素 酸 (HClO) の 存 在 比 と 殺 菌 効 果 の
関 係 を 求 め た も の を F ig.3-1 に 示 す 。
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す な わ ち 縦 軸 に 各 pH に お け る 最 短 殺 菌 濃 度 ， 横 軸 に pH か ら 求 め た 有 効 塩 素
に 占 め る 次 亜 塩 素 酸 ( HClO)の 割 合 ( ％ )を プ ロ ッ ト し た 。 p H 5,6,7 ,8 に お け る
次 亜 塩 素 酸 (H ClO) の 割 合 は 解 離 定 数 (p K a )7.5(25 ℃ ) 3 4 ) か ら 算 出 し ， 各 々
99.7 ％ ， 96.9 ％ ， 7 6.0 ％ ， 2 4.0 ％ で あ っ た 。 有 効 塩 素 濃 度 5 0 ppm の 場 合
に お け る 3 種 の 菌 の 最 短 殺 菌 時 間 と 次 亜 塩 素 酸 (HClO) の 存 在 比 は 線 形 近 似 し ，
決 定 係 数 (r 2 )は B.subtilis，B.cereus，A.niger が 各 々 0.9 5，0. 98 お よ び 0.99
と強い相関が認められた。この結果は，次亜塩素酸水溶液の殺菌効果が有効
塩 素 濃 度 で な く 次 亜 塩 素 酸 (HClO) 濃 度 に 依 存 す る こ と を 示 し て お り ， 福 崎 ら
の既存の研究結果とも一致する
64)
。ま た Fig.3-1 の 近 似 直 線 の 傾 き は ，各 菌
種における次亜塩素酸水溶液への抵抗性の傾向を示している。芽胞菌 2 種
( B.cereus， B.subtilis )は A.niger と 比 較 し て 近 似 直 線 の 傾 き が 大 き く ， 次
亜 塩 素 酸 水 溶 液 の pH に よ っ て 殺 菌 効 果 に 影 響 を 受 け や す い 。こ れ は 芽 胞 表 面
の 疎 水 性 ，電 位 お よ び 膜 構 造 に よ る も の と 考 え ら れ る
65-66)
。ま た ，本 研 究 に
お い て は ，次 亜 塩 素 酸 に 対 し て 抵 抗 性 が 低 い 微 生 物 は pH の 違 い に よ る 殺 菌 効
果が見られなかったが，次亜塩素酸を殺菌因子とする電解水では有効塩素濃
度 1～ 5 ppm で 弱 酸 性 域 の 殺 菌 効 果 が 向 上 す る こ と が 報 告 さ れ て お り
67)
，弱
酸性次亜塩素酸水溶液においても有効塩素濃度が低い場合は殺菌効果に差が
表れると予想される。
ま た ,臨 床 分 離 株 の 中 に は MRSA( メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 )を は じ め
とする抗生物質に対する薬剤耐性菌があることが報告されている
68)
。病 院 以
外の分野，すなわち畜産分野においても家畜に過剰投与された抗生物質によ
り薬剤耐性菌が出現し，食品を介して薬剤耐性菌が伝播する危険性も報告さ
れている
21-22)
。 そ の た め ,畜 産 分 野 お よ び 食 品 製 造 分 野 で も 薬 剤 耐 性 菌 に 対
す る 殺 菌 を 行 う こ と が 求 め ら れ て い る 。本 試 験 に お い て , 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水
溶 液 は MRSA お よ び MS SA に 対 し て も 高 い 殺 菌 効 果 が 確 認 さ れ た こ と か ら ， 畜
産および食品製造分野においても通常の微生物制御と同時に薬剤耐性菌対策
としても有用性が高いことが示唆された。
3.4
まとめ
各種標準株および臨床分離株に対する弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌およ
びウイルス不活化効果の検討を行った。弱酸性次亜塩素酸水溶液は本試験で
供したすべての細菌，カビおよびウイルスに対して高い殺菌・ウイルス不活
化 効 果 を 有 し て い た 。ま た ，殺 菌 ・ ウ イ ル ス 不 活 化 効 果 は 弱 酸 性 域 で あ る pH
5.0，6.0 で 向 上 し ，ア ル カ リ 性 で あ る 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム よ り も 殺 菌 ・ ウ
イルス不活化効果が高いことが明らかとなった。
以上の結果より，弱酸性次亜塩素酸水溶液は殺菌剤として有用性が高いこ
とが示された。
第 4章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の浮遊芽胞菌および付着芽胞菌に対する殺菌効果
4.1
はじめに
Bacillus 属 や Clostridium 属 の 芽 胞 菌 に よ る 微 生 物 汚 染 は 医 療 ･食 品 分 野
等 に お い て 深 刻 な 問 題 と な っ て い る 。医 療 施 設 に お い て ，200 6 年 に は リ ネ ン
類 ， 特 に シ ー ツ 等 を 介 し た Bacillus cereus に よ る 院 内 感 染 が 報 告 さ れ て お
り
69)
， 偽 膜 性 大 腸 炎 の 原 因 菌 で あ る Clostridium diffcile の 病 院 内 で の 検
出事例も年々増加している
70-71)
。 食 品 分 野 に お い て は ， B.cereus ，
Clostridium botulinum お よ び Clostridium perfringens が 食 中 毒 菌 と し て
知られている
72-74)
。ま た ，近 年 は ，果 汁 飲 料 な ど の 製 造 過 程 に お い て ジ ュ ー
ス や 酸 性 飲 料 内 で 耐 熱 性 好 酸 性 菌 ( Thermo -Acidophilic Bacill i； 以 下 TAB)
の 一 種 で あ る Alicyclobacillus 属 菌 が 臭 気 成 分 グ ラ イ ヤ コ ー ル を 産 生 し ，商
品価値の低下が問題となっている
75-76)
。
芽胞は，一般的に消毒剤や熱に対する抵抗性が高く，エタノールや塩化ベ
ンザルコニウムでは効果が十分に得られないため，殺菌には高水準消毒剤で
あるグルタラールや過酢酸，中水準消毒剤である次亜塩素酸ナトリウム等が
使用されている
77-78）
。し か し ，高 ・ 中 水 準 消 毒 剤 は 殺 菌 効 果 が 高 い 反 面 ，グ
ルタラールによる作業者への健康被害や
79）
，次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム に よ る 金
属 腐 食 ･食 品 へ の 異 臭 味 等 の 副 次 的 な 問 題 を は ら ん で い る
52-53,80)
。
第 3 章で弱酸性次亜塩素酸水溶液の各種微生物に対する殺菌およびウイル
ス 不 活 化 効 果 に つ い て 検 討 を 行 っ た と こ ろ ，芽 胞 菌 で あ る B.subtilis お よ び
B.cereus は 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 に 対 し て 高 い 抵 抗 性 を 有 す る こ と が わ か っ た 。
し か し ，pH を 弱 酸 性 域 に 調 製 す る こ と に よ り 殺 菌 効 果 が 向 上 す る こ と も 確 認
された。本研究では芽胞に対する弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌効果をより
詳 細 に 検 討 す る こ と を 目 的 と し ，食 中 毒 や 院 内 感 染 の 原 因 菌 で あ る Bacillus
cereus ， 果 汁 飲 料 等 の 変 敗 原 因 と な る 耐 熱 性 好 酸 性 菌 の 一 種 で あ る
Alicyclobacillus acidoterrestris， 偽 膜 性 大 腸 炎 の 院 内 感 染 起 因 菌 で あ る
Clostridium difficile の 3 種 の 芽 胞 に 対 す る 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 殺
菌試験を行った。また，弱酸性次亜塩素酸水溶液を実使用する場合，芽胞菌
は水中に付着した状態だけでなく，様々な部材上に付着していることが想定
される。そこで，各種部材表面に付着した芽胞に対する殺菌効果についても
検討した。
4.2
材料および方法
4.2.1
次亜塩素酸水溶液の調製
次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 調 製 は 3.2.1と 同 様 の 方 法 で 有 効 塩 素 濃 度 1 0～ 200 ppm，
pH 6.0,9.0に 調 製 し た 。pHお よ び 有 効 塩 素 濃 度 も 3.2.1と 同 一 の 方 法 で 測 定 し
た。
4.2.2
菌液の調製
供 試 菌 株 と し て
Bacillus cereus (N BRC13597) ， Alicyclobacillus
acidoterrestris (AT CC49025) お よ び Clostridium difficile
(JCM1296)を
用 い た 。 芽 胞 液 の 調 製 に あ た っ て は ， B.cereus は 標 準 寒 天 培 地 ( 日 水 製 薬
(株 ))， A. acidoterrestris は YSG 寒 天 培 地 (Difco 社 ) ， C.difficile は GAM
寒 天 培 地 ( 日 水 製 薬 ( 株 )) 上 に 供 試 菌 株 を 塗 布 し ， B.cereus お よ び
C.difficile は 37 ℃ ， A. acidoterrestris は 45 ℃ で 5 日 間 培 養 し て 芽 胞
を 形 成 さ せ た 。 な お ， C.difficile は 嫌 気 培 養 を 行 っ た 。
芽胞を含むコロニーを平板から白金耳を用いて採取して滅菌精製水に懸濁
し ， 80 ℃ ， 1 0 分 の 加 熱 処 理 を 行 い ， 増 殖 型 細 胞 を 死 滅 さ せ た 後 ， 滅 菌 精 製
水 に て 3000 rp m で 2 回 遠 心 洗 浄 し た も の を 芽 胞 懸 濁 液 と し た 。実 験 に あ た っ
て は ，芽 胞 懸 濁 液 を M eller 染 色 し ，顕 鏡 に て 90 ％ 以 上 が 芽 胞 で あ る こ と を
確認して実験に供した。
4.2.3
水溶液中に浮遊した芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の殺菌試験
芽 胞 懸 濁 液 0. 1 mL を 各 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 3 0 mL に 添 加 し ， 一 定 時 間 接 触 さ
せ た も の を 試 料 液 と し た 。試 料 液 の 初 菌 濃 度 は B.cereus 5.9～ 6 .2 logCFU/mL，
A. acidoterrestris 5.5～ 5.9 logCFU/mL ， C.difficile 5.7～ 5. 9 logCFU/mL
で あ っ た 。試 料 液 の 一 部 を 経 時 的 に 採 取 し ，速 や か に 0 .1 ％ チ オ 硫 酸 ナ ト リ
ウムを添加した滅菌生理食塩水中に混和して残留塩素を失活処理した。失活
処 理 後 ， 適 宜
10 倍 段 階 希 釈 し て
B.cereus は 標 準 寒 天 培 地 ， A.
acidoterrestris は Y SG 寒 天 培 地 ，C.difficile は GAM 寒 天 培 地 上 に 平 板 塗 抹
し ， 37℃ ( A. acidoterrestris .は 4 5 ℃ ) 4 8 時 間 培 養 後 ， 生 存 芽 胞 数 を 測 定
した。
4.2.4 各 種 部 材 表 面 に 付 着 し た 芽 胞 に 対 す る 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 殺 菌 試 験
部 材 は ポ リ ス チ レ ン (φ 86 mm, 滅 菌 シ ャ ー レ ) ， ス テ ン レ ス 鋼 ( SUS304,50
mm×50 mm)， 布 (木 綿 , 50 mm×50 mm )の 3 種 を 選 定 し た 。 ポ リ ス チ レ ン お よ び
ス テ ン レ ス 鋼 表 面 に 各 種 芽 胞 懸 濁 液 0.1 m L を 接 種 し ，コ ン ラ ー ジ 棒 で 表 面 全
体に塗布した後，室温にて 1 時間乾燥させたものを検体とした。布は芽胞懸
濁 液 を 10 倍 希 釈 し た も の を 1 mL 接 種 し て 塗 布 ， 乾 燥 さ せ た も の を 検 体 と し
た 。 各 検 体 の 1 枚 あ た り の 初 菌 数 は B.cereus
acidoterrestris
4. 8 ～ 5.5
logCFU/pl ate,
4.7～ 4. 9 logCF U/plate， A.
C.difficile
3.6 ～ 3.8
logCFU/plate で あ っ た 。各 検 体 を 滅 菌 シ ャ ー レ 内 に 設 置 し ，有 効 塩 素 濃 度 50
ppm お よ び 200 ppm ， pH 6 お よ び 9 の 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 30 mL を 接 触 さ せ 一
定 時 間 静 置 し た 後 ，0. 1 ％ チ オ 硫 酸 ナ ト リ ウ ム 1 mL を 混 和 し て 残 留 塩 素 を 失
活させた上で次亜塩素酸水溶液を静かに除去した。検体に直接芽胞殺菌試験
と 同 様 の 寒 天 培 地 を 加 え て 混 釈 し ，48 時 間 培 養 後 に 検 体 1 枚 あ た り の 生 菌 数
を測定した。
4.3
結果および考察
4.3.1
水溶液中に浮遊した芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の殺菌効果
Fig.4-1 に B.cereus ， A. acidoterrestris お よ び C.difficile の 芽 胞 に 次
亜塩素酸水溶液を接触した場合の殺菌効果を示す。すべての系において接触
時間および有効塩素濃度の増加とともに生菌数は減少した。検出限界以下
(<10 CFU/mL) に す る た め の 接 触 条 件 は ， B.cereus の 場 合 ， pH 9 で は 有 効 塩 素
濃 度 200 ppm， 240 分 必 要 で あ っ た が ， pH 6 で は 同 時 間 条 件 で は 有 効 塩 素 濃
度 10 ppm で 検 出 限 界 以 下 と な り ， 有 効 塩 素 濃 度 200 pp m で は 5 分 で あ っ た 。
同 様 に ， A.acidoterrestris の 場 合 は ， pH 9 で は 有 効 塩 素 濃 度 200 ppm， 60
分 だ っ た の に 対 し ， pH 6 で は ， 有 効 塩 素 濃 度 10 ppm ， 240 分 で あ っ た 。
C.difficile の 場 合 で は ， pH 9 で は ， 有 効 塩 素 濃 度 10 ppm， 1 20 分 で あ っ た
が ， pH 6 で は ， 有 効 塩 素 濃 度 10 ppm， 3 0 分 で あ っ た 。 す な わ ち 芽 胞 3 種 す
べ て に お い て pH 6 の 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は p H 9 の 場 合 よ り も 低 い 有 効 塩 素 濃
度あるいは短い接触時間で検出限界以下にすることが可能であった。
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消 毒 剤 の 効 果 を 評 価 す る 際 に ， 消 毒 剤 濃 度 (C:ppm)と 接 触 時 間 (T:min)を 乗
じ た 濃 度 時 間 積 (CT 値 )が 用 い ら れ る 。本 試 験 に お い て も ，芽 胞 に 対 す る 殺 菌
効果を，接触時間および有効塩素濃度から濃度時間積を求めて評価した。
Fig.4-1 よ り ，初 発 芽 胞 数 ( N 0 )に 対 す る 一 定 時 間 後 の 生 存 芽 胞 数 ( N )か ら 生 残
率 を 求 め ， 以 下 の 式 よ り ， 対 数 生 残 率 (S) を 求 め た 。
S＝ log( N / N 0 )
( 1)
浮 遊 芽 胞 の 対 数 生 残 率 (S)を 算 出 し ，縦 軸 に S，横 軸 に 濃 度 時 間 積 を プ ロ ッ ト
し ， 近 似 式 を 求 め た も の を Fig.4-2 に 示 す 。 S は ， 濃 度 時 間 積 に 対 し て 対 数
近 似 し ， 決 定 係 数 r 2 = 0.53～ 0.88 の 相 関 が 認 め ら れ た 。 こ の 近 似 式 よ り S を
-4.0(99.99 %) 低 下 さ せ る 場 合 の 濃 度 時 間 積 の 値 を 求 め た も の を Table 4-１
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に 示 す (以 下 CT 値 と 略 す )。B.cereus ，A. acidoterrestris お よ び C.difficile
の pH 6 の 場 合 の 99 .9 9 % CT 値 は ， 各 々 250 ， 2800， 140 ppm･m in で あ り ， A.
acidoterrestris
が 他 2 種 の 芽 胞 と 比 較 し て 高 い CT 値 を 示 し ， 次 亜 塩 素 酸
水溶液に対して抵抗性が高いことが示された。また，芽胞 3 種とも同有効塩
素 濃 度 の 場 合 ， pH 9 の 場 合 の CT 値 は pH 6 よ り も 大 き く ， 4.1～ 8.1 倍 の 値 を
示 し た 。 塩 素 の 殺 菌 の 主 体 は 非 解 離 型 の 次 亜 塩 素 酸 (HC lO)で あ る こ と が 報 告
されている
10-11)
。 次 亜 塩 素 酸 の 解 離 定 数 p K a ＝ 7.5 よ り
34)
， pH 6 お よ び 9 の
場 合 の 次 亜 塩 素 酸 (HO Cl) の 濃 度 比 率（ 存 在 比 率 ）を 求 め る と ，各 々 96.9 ％ ，
3.1 ％ で あ り ， pH 6 で は 次 亜 塩 素 酸 (HClO )の 割 合 が 大 き い こ と か ら ， 高 い 殺
菌効果が得られたと考えられる。
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4.3.2 各 種 部 材 表 面 に 付 着 し た 芽 胞 に 対 す る 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 殺 菌 効 果
Fig.4-3 に ポ リ ス チ レ ン ， ス テ ン レ ス 鋼 お よ び 布 に 付 着 さ せ た 芽 胞 3 種 を
次亜塩素酸水溶液に接触した場合における殺菌効果を示す。すべての条件に
おいて，時間の経過とともに生菌数の減少が見られ，いずれの条件において
も ， 同 有 効 塩 素 濃 度 で あ れ ば pH 6 の ほ う が 早 く 検 出 限 界 以 下 ( <1 CFU/検 体 )
と な っ た 。 B.cereus の 場 合 ， 検 出 限 界 以 下 に す る た め の 接 触 条 件 は ， pH 6，
有 効 塩 素 濃 度 200 ppm で ，ポ リ ス チ レ ン で 5 分 ，ス テ ン レ ス 鋼 で 15 分 ，布 で
1 分 以 内 で あ っ た の に 対 し ， pH 9， 有 効 塩 素 濃 度 200 pp m で は ， 60 分 の 接 触
が 必 要 で あ っ た 。 A.acidoterrestris の 場 合 も ， pH 6， 有 効 塩 素 濃 度 200 ppm
の 条 件 で は ，5～ 15 分 で あ っ た が ，pH 9 ，有 効 塩 素 濃 度 20 0 ppm の 条 件 で は ，
ス テ ン レ ス 鋼 で 60 分 ，布 で 120 分 で あ り ，ポ リ ス チ レ ン は 180 分 で も 検 出 限
界 以 下 に な ら な か っ た 。 C.difficile の 場 合 も ，pH 6，有 効 塩 素 濃 度 200 ppm
の 条 件 で は 5 ～ 15 分 で あ っ た の に 対 し ， p H 9， 有 効 塩 素 濃 度 20 0 ppm で 30～
60 分 で あ っ た 。
付着芽胞菌についても浮遊芽胞と同様に，ポリスチレン，ステンレス鋼お
よ び 布 表 面 へ の 付 着 菌 に 対 す る 対 数 生 残 率 (S)を 算 出 し ，縦 軸 に S と 横 軸 に 濃
度時間積をプロットして近似式を求めた。Ｓは浮遊菌の場合と同様に濃度時
間 積 に 対 数 近 似 し ， 決 定 係 数 は r 2 =0.67 ～ 0.98 の 範 囲 で あ っ た 。 付 着 菌 の CT
値 を Table4-2 に 示 す が ， す べ て の 系 に お い て ， pH 9.0 の 場 合 の 方 が pH 6.0
の 場 合 と 比 較 し て CT 値 の 値 が 大 き く ，付 着 菌 に お い て も 弱 酸 性 域 で 殺 菌 効 果
が高かった。
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芽 胞 の 種 類 毎 に 比 較 す る と ，CT 値 は pH お よ び 部 材 に 関 わ ら ず ，B.cereus，
C.diffcile，A. acidoterrestris
の 順 に 増 大 す る 傾 向 が 認 め ら れ た 。ま た ，
pH 6 の 場 合 に は ， す べ て の 芽 胞 に お い て ， 布 に 付 着 さ せ た 場 合 に 高 い CT 値
を示した。布は，他 2 種の部材と異なり芽胞が繊維内部にまで浸潤して存在
しており，試料液が布に浸透して芽胞に接触するまでに時間を要したと考え
ら れ る 。 ま た ， ポ リ ス チ レ ン の 水 に 対 す る 接 触 角 は 8 4°(20 ℃ ) 8 1 ) ， ス テ ン
レ ス 鋼 (SUS30 4) の 水 に 対 す る 接 触 角 は 表 面 処 理 に よ っ て も 違 い 74.1 ～
115.5°(28 ℃ ) 8 2 ) で あ る 。 本 試 験 に お い て は ポ リ ス チ レ ン と ス テ ン レ ス 鋼 の
間 に CT 値 に 傾 向 は 認 め ら れ ず ，付 着 菌 に 対 す る 殺 菌 効 果 は ，部 材 の ぬ れ 易 さ ，
各芽胞の部材に対する吸着性，部材の表面構造等，他の要因の複合的な影響
があることが考えられる。
食品・医療等実際の現場において芽胞形成菌が付着状態で存在する例とし
て は ， B.cereus に 汚 染 さ れ た リ ネ ン や 食 品 類
83)
，果汁飲料製造用
CIP(Cleaning in Pla ce)配 管 内 の A. acidoterrestris の 汚 染
に て C.difficile に 汚 染 さ れ た ト イ レ ・ 床 等
84-85)
75-76)
，病院内
が 挙 げ ら れ る 。バ イ オ フ ィ
ル ム の 内 部 に 微 生 物 が 存 在 し て い た 場 合 は ，CT 値 は 増 大 す る こ と 報 告 さ れ て
いる
41-42,86)
。そ の 場 合 ，あ ら か じ め 洗 浄 工 程 に て 汚 れ や バ イ オ フ ィ ル ム を 除
去した後に残存する芽胞を死滅させる方法として，弱酸性次亜塩素酸水溶液
は十分に有用であると考えられる。
2.4
まとめ
芽胞形成菌 3 種の芽胞に対する次亜塩素酸水溶液の殺菌効果の検討を行っ
た 。芽 胞 に 対 す る 対 数 生 残 率（ S）は 有 効 塩 素 濃 度 (ppm) と 時 間 (min)の 積 に 対
数 近 似 し た 。 C T 値 は pH が 弱 酸 性 域 に お い て 低 い 値 と な り ， 殺 菌 効 果 が 高 い
ことが明らかとなった。この傾向はポリエチレン，ステンレス鋼および布に
芽 胞 を 付 着 さ せ た 場 合 に も 同 様 で あ っ た 。 ま た ， A.acidoterrestris は ，
B.cereus お よ び C.diffcile と 比 較 し て ， 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 に 対 し て 高 い 抵
抗性を示した。以上の結果より，弱酸性次亜塩素酸水溶液は食品および医療
等の現場において有効性の高い殺菌資材であることが示された。
第 5章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の生鮮野菜に対する殺菌効果および
界面活性剤併用効果の検討
5.1
はじめに
近年，野菜全体の消費量は減少傾向にあるが，健康志向の向上および生活
様式の変化により，より簡便に使用でき，少量で使い切ることができるカッ
ト野菜の消費は増加している
87)
。生 鮮 野 菜 の 場 合 ，野 菜 の 栽 培 中 に 土 壌 や 肥
料または野鳥・野生動物からの微生物汚染を受けることがある。生食用カッ
ト野菜の場合，野菜の細胞を切断した際に細胞液が漏出し，細胞液を栄養源
として微生物が増加し易い条件となる上，消費まで加熱工程がない。そのた
め，栽培中の汚染のリスクに加え，流通および加工段階で二次汚染されるリ
スクも内包している
88-90)
。海 外 で は ，生 鮮 野 菜 お よ び カ ッ ト 野 菜 を 原 因 食 材
とした大規模な食中毒事例が頻発しており
91-93)
，日 本 国 内 で も 微 生 物 学 的 リ
スクの制御が求められている。
本章では，非加熱で食する生鮮野菜類に着目し，カット野菜の原料として
特に殺菌が困難なキュウリおよびアオネギを材料に選定し，加工工程内で弱
酸性次亜塩素酸水溶液を殺菌に使用することを想定して，その使用方法の検
討を行った。また，弱酸性次亜塩素酸水溶液の野菜表面の菌体への接触性を
向上させることを目的とし，弱酸性次亜塩素酸水溶液に界面活性剤としてポ
リグリセリン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステル配合洗浄剤をそれ
ぞれ混合して使用した場合の洗浄殺菌効果についても比較検討した。
5.2
材料および方法
5.2.1
次亜塩素酸水溶液および界面活性剤添加次亜塩素酸水溶液の調製
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は 3.2.1 と 同 様 の 方 法 で 有 効 塩 素 濃 度 100 ppm，
pH 6.0 に 調 製 し た 。pH お よ び 有 効 塩 素 濃 度 も 3.2.1 と 同 一 の 方 法 で 測 定 し た 。
界面活性剤はポリグリセリン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エステル
配 合 洗 浄 剤 を 用 い た 。 2 剤 の 構 造 を Fig.5 -1 に 示 す 。
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および洗浄剤として使用されている
91）
。HL B
（ Hydrophile- lipoph ile balance）
値 は 各 々 16 ，15 と 親 水 性 を 示 す 。界 面 活 性 剤 添 加 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は ，弱 酸
性次亜塩素酸水溶液にポリグリセリン脂肪酸エステルおよびショ糖脂肪酸エ
ス テ ル 配 合 洗 浄 剤 (シ ョ 糖 脂 肪 酸 エ ス テ ル 5 %配 合 )を 各 々 2 50 ppm と な る よ う
に 添 加 し て 調 製 し た （ 以 下 ， P-WAH S， S-W AHS と 略 す ）。
5.2.2
界面活性剤添加次亜塩素酸水溶液の性質
弱酸性次亜塩素酸水溶液に界面活性剤を添加することにより，界面活性効
果 お よ び pH， 遊 離 塩 素 濃 度 が 維 持 さ れ る か ど う か を 検 討 し た 。
界 面 活 性 効 果 は ， 水 道 水 ， 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 溶 液 （ 有 効 塩 素 濃 度 100
ppm）， 弱 酸 瀬 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， P -WAHS お よ び S-WAHS の 表 面 張 力 を 表 面 張
力 計 CBVP-A3（ 協 和 界 面 科 学 (株 )）を 用 い ，プ レ ー ト 法 に て 測 定 し 評 価 し た 。
ま た ， 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， P -WAHS お よ び S-WAHS 各 々 10 0 mL を 調 製
後 ，実 験 室 内 に 室 温 ，開 放 状 態 で 静 置 し た 場 合 の pH お よ び 遊 離 塩 素 濃 度 の 経
時 的 変 化 を 測 定 し た 。 pH は EH Con trolle r（ (株 )IWAKI）， 遊 離 残 留 塩 素 濃 度
は DPD 法 残 留 塩 素 測 定 器 （ (株 )SIB ATA） を 用 い て 測 定 し た 。
5.2.3
B.cereus 芽 胞 の 調 製
Plate-Count-A gar(ME RCK)に Bacillus cereus (NBRC 13597 )を 塗 布 し ，37 ℃
で 24 時 間 培 養 し た の ち ，5 日 間 室 温 に 静 置 し て 芽 胞 を 形 成 さ せ た 。芽 胞 を 含
む コ ロ ニ ー を 平 板 か ら 採 取 し 滅 菌 精 製 水 に 懸 濁 し た 後 ， 60 ℃ ， 10 分 の 加 熱
処理を行い，滅菌精製水を用いて 2 回洗浄し，芽胞懸濁液を調製した。実験
に 当 た っ て は ， 顕 鏡 に て 90 ％ 以 上 が 芽 胞 で あ る こ と を 確 認 し た 。
5.2.4
B.cereus 芽 胞 に 対 す る 殺 菌 効 果
基 礎 実 験 と し て ，水 中 に 浮 遊 状 態 の B.cereus 芽 胞 に 対 す る 殺 菌 効 果 を 検 討
し た 。水 道 水 ，ポ リ グ リ セ リ ン 脂 肪 酸 エ ス テ ル (250 pp m)，シ ョ 糖 脂 肪 酸 エ ス
テ ル 配 合 洗 浄 剤 (250 ppm)， 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， P -WAHS ， S-WAHS 各 々
100 mL に ， B.cereus 芽 胞 懸 濁 液 を 6.0～ 6. 3 logCFU/mL と な る よ う に 添 加 し
た も の を 試 料 液 と し た 。 な お ， P-W AHS お よ び S-WAH S は 調 製 後 5 分 以 内 に 実
験に供した。
試 料 液 の 一 部 を 経 時 的 に 採 取 し ，速 や か に 0.1 ％ チ オ 硫 酸 ナ ト リ ウ ム 添 加
滅菌生理食塩水中に混和して残留塩素を失活処理した。失活処理後，適宜希
釈 し て Plate- Count-A gar に 塗 抹 し ， 37 ℃ ， 48 時 間 培 養 後 ， 生 菌 数 を 測 定 し
た。
5.2.5
キュウリおよびアオネギの洗浄殺菌
カット野菜洗浄殺菌への適用を想定し，供試野菜として表面構造などから
殺菌効果が得られにくく，かつ生食する機会の多いキュウリおよびアオネギ
を用いた。キュウリおよびアオネギは市販品を試験に供した。水道水，弱酸
性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， P-WAHS お よ び S-WA HS を 被 験 液 と し た 。 な お ， P-WAHS
お よ び S-WAHS は 調 製 後 5 分 以 内 に 実 験 に 供 し た 。
キュウリのヘタ部およびアオネギの根部をカットして除いた後，各被験液
流水下で 1 分間，擦り洗いを行った。その後，キュウリは 2 分の 1 にカット
し た も の (100 ～ 120 g）， ア オ ネ ギ は 10 cm の 長 さ に カ ッ ト し た も の 約 10 本 (9
～ 11 g)を 各 被 験 液 30 0 mL に 投 入 し ， マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー を 用 い て 攪 拌
し つ つ 10 分 間 浸 漬 処 理 し た 。 浸 漬 処 理 後 ， キ ュ ウ リ お よ び ア オ ネ ギ の 5 g
を 滅 菌 生 理 食 塩 水 45 mL に 採 取 し 破 砕 し た も の を 試 料 原 液 と し た 。 試 料 原 液
を 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 適 宜 希 釈 し て Plate-C ount-Agar に 塗 抹 し ， 37 ℃ ， 48 時
間培養後，生菌数を測定した。
5.3
結果および考察
5.3.1
界面活性剤添加次亜塩素酸水溶液の性質
Table 5-1 に 示 す よ う に ， 水 道 水 の 表 面 張 力 は 71.7 N/m で あ り ,既 報 の 表
面張力の値ともほぼ一致した
95）
。次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム お よ び 弱 酸 性 次 亜 塩
素 酸 水 溶 液 の 表 面 張 力 は 各 々 67.2, 70.6 N/m で あ り ,水 道 水 と ほ ぼ 同 等 の 表
面張力であった。
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 に 界 面 活 性 剤 2 種 を 加 え る こ と に よ っ て ， P-WAHS
お よ び S-WAHS の 表 面 張 力 は 各 々 31. 3， 28. 0 N/m ま で 低 下 し た 。 こ れ は ， 界
面活性剤を蒸留水に混合した場合と表面張力はほぼ同等であり，界面活性効
果に弱酸性次亜塩素酸水溶液は影響を与えないことが分かった。
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Fig.5-2 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， P-WAH S お よ び S-WAH S の pH お よ び 遊
離 残 留 塩 素 濃 度 の 経 時 的 変 化 を 示 す 。初 期 pH 6.0，初 期 遊 離 残 留 塩 素 濃 度 50
ppm の と き ，p H は ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 お よ び S-WA HS は 調 製 144 時 間 後
ま で ， pH 6. 0 付 近 で 安 定 し て い た 。 P-WAH S は 調 製 後 24 時 間 以 降 pH が 低 下
し ， 144 時 間 後 に は p H 4.1 に な っ た 。
遊 離 残 留 塩 素 濃 度 は 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 場 合 ，4 8 時 間 以 内 は 濃 度 の
変 化 が 見 ら れ ず ， そ の 後 144 時 間 で 5 pp m 低 下 し た 。 P-WA HS は 48 時 間 ま で
は 濃 度 の 低 下 が 見 ら れ な か っ た が ， 144 時 間 後 で は 26 ppm ま で 低 下 し た 。
S-WAHS は 調 製 直 後 に 50 ppm か ら 40 ppm ま で 低 下 す る も の の ，24 時 間 は 40 ppm
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以上の結果より，弱酸性次亜塩素酸水溶液に界面活性剤を加えることによ
り ， 表 面 張 力 は 著 し く 減 少 し ， か つ 調 製 後 24 時 間 は p H お よ び 遊 離 残 留 塩 素
濃度の低下も少ないことがわかった。一般的に，塩素系の消毒剤は有機物と
反応すると失活して効力を失うことが知られており
51）
，洗浄剤とも反応し，
殺菌効果が低下するため，洗浄剤と混合して使用することは推奨されていな
い 。し か し ，本 実 験 で 用 い た 2 種 の 界 面 活 性 剤 は 調 製 後 24 時 間 ま で 遊 離 残 留
塩 素 濃 度 ，pH を 維 持 し ，か つ 表 面 張 力 も 低 下 し て お り ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水
溶液との併用が可能であることが明らかとなった。
5.3.2
B.cereus 芽 胞 に 対 す る 殺 菌 効 果
Fig.5-3 に B.cereus 芽 胞 に 対 す る 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ，P- WAHS，S-WAHS
および界面活性剤単独の殺菌効果を示す。蒸留水単独および界面活性剤単独
で は ， B.cereus 芽 胞 の 生 菌 数 は 低 下 せ ず ，界 面 活 性 剤 自 体 に 殺 菌 効 果 は 認 め
ら れ な か っ た 。 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 お よ び P－ WAH S， S-WA HS は い ず れ も
高い殺菌効果が認められ，界面活性剤を添加しても殺菌効果は変化しなかっ
た。
この結果より，界面活性剤 2 種は，弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌効果自
体 を 増 大 さ せ る 効 果 は な く ，浮 遊 状 態 の B.cereus 芽 胞 に 対 し て は 次 亜 塩 素 酸
(HClO)の 単 独 の 殺 菌 効 果 が 主 体 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。
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5.3.3
キュウリおよびアオネギの洗浄殺菌効果
Fig.5-4 に 水 道 水 ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ，P-WAHS お よ び S-W AHS で 洗 浄
殺菌した場合のキュウリおよびアオネギに対する殺菌効果を示す。なお有意
差 検 定 に は St udent's -t 検 定 を 用 い た 。 キ ュ ウ リ お よ び ア オ ネ ギ の 洗 浄 前 の
一 般 生 菌 数 （ C ontrol ） は 各 々 5.4， 4.9 log CFU/g で あ っ た 。 洗 浄 後 ， ア オ ネ
ギの水道水洗浄を除くすべての系で生菌数が有意に減少した。また，弱酸性
次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で の 洗 浄 後 の 生 菌 数 は キ ュ ウ リ お よ び ア オ ネ ギ で 各 々 3.8 ，
4.1 logCFU/g で あ っ た の に 対 し ， 界 面 活 性 剤 2 種 を 添 加 す る こ と に よ り ， キ
ュ ウ リ は 各 々 2 .9， 2. 2 logCFU/g ア オ ネ ギ は 各 々 2.8， 2. 1 logCF U/g ま で 生 菌
数 を 有 意 に 低 下 さ せ る こ と が 可 能 で あ っ た（ p<0.05）。ま た ，キ ュ ウ リ に お い
て は P-WAHS 洗 浄 殺 菌 よ り も S-WA HS 洗 浄 殺 菌 の 方 が 生 菌 率 が 有 意 に 低 く
（ p<0.05）， 高 い 殺 菌 効 果 が 認 め ら れ た 。
野 菜 に 存 在 す る 微 生 物 の 大 部 分 は ，野 菜 表 面 に 存 在 し て い る が
96)
，キ ュ ウ
リおよびアオネギ表面は，疎水性クチクラ層で覆われ，細菌より遥かに大き
い気孔などの植物器官が存在することから，付着微生物にとって好ましい自
己防衛環境が整えられている
せ ず ，効 果 が 得 ら れ に く い
86)
。そ の た め ，殺 菌 剤 が 野 菜 表 面 の 菌 体 に 接 触
97-99）
。本 実 験 で は ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 に 界
面活性剤を添加することにより，野菜表面への濡れ性が向上し，弱酸性次亜
塩素酸水溶液を野菜に満遍なく接触させることができたため，野菜表面に存
在する微生物に対して殺菌効果が向上したと考えられる。
また，カット野菜製造の洗浄殺菌工程は，水洗，中性洗剤で洗浄，流水す
すぎ，殺菌剤での殺菌，水洗という流れが推奨されている
6）
。界面活性剤を
弱酸性次亜塩素酸水溶液に添加して使用することができれば，中性洗剤で洗
浄する工程と殺菌剤で殺菌する工程を同時に行うことができ，工程の簡素化
が期待される。また，界面活性剤添加弱酸性次亜塩素酸水溶液で洗浄殺菌し
た場合のカット野菜の味臭の変化は，弱酸性次亜塩素酸水溶液と同程度であ
り，洗浄殺菌工程後の水洗によって，除去できるものと考えられた。
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まとめ
弱酸性次亜塩素酸水溶液に界面活性剤 2 種を添加した場合，殺菌効果およ
び界面活性効果を同時に維持することが可能であった。キュウリおよびアオ
ネギに対して弱酸性次亜塩素酸水溶液単独よりも高い殺菌効果が得られ，カ
ット野菜製造工程において有用性が高い手法であることが示唆された。
第 6章
弱酸性次亜塩素酸水溶液のハクサイ殺菌への適用および
クロロホルム生成量の検討
6.1
はじめに
第 5 章では弱酸性次亜塩素酸水溶液のカット野菜に対する基礎的な殺菌効
果とその殺菌効果の増強技術について検討を行った。第 6 章では，実際の大
規模食品製造ラインとして漬物製造ラインを想定し，弱酸性次亜塩素酸水溶
液の適用を検討した。
漬物は発酵や高塩分によって食中毒菌の増殖が抑えられる保存食だが，加
熱工程がないため，原材料に付着した微生物が品質や食中毒発生に与える影
響は極めて大きい。さらに，近年の健康志向の高まりから，漬物の塩分濃度
は減塩傾向にあり，細菌が増殖しやすい環境となっている
100-101)
。
2012 年 に は 北 海 道 で ハ ク サ イ の 浅 漬 け を 原 因 食 材 と し た 病 原 性 大 腸 菌 Ｏ
157 の 集 団 食 中 毒 が 発 生 し て お り
4)
，原料から製品までの一貫した衛生管理
の重要性が再確認されている。それに伴って漬物の衛生規範が改訂され，原
材 料 に 付 着 し た 微 生 物 を 殺 菌 す る た め ， 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 100 ppm で 1 0
分 ま た は 200 ppm で 5 分 処 理 と い う 殺 菌 工 程 が 追 加 さ れ て い る
102)
。
Fig.6-1 に 漬 物 の 製 造 工 程 を 示 す 。本 試 験 で は 実 際 の 漬 物 製 造 ラ イ ン 中 の ，
ハクサイの洗浄殺菌工程で弱酸性次亜塩素酸水溶液を使用することを想定し，
殺菌時間および殺菌方法の検討を行い，漬物衛生規範で推奨されている殺菌
法との比較を行った。また，塩素系の殺菌料を食材洗浄殺菌に用いた場合に
懸念される，発がん性物質の一種であるトリハロメタンの生成量についても
検討を行った。
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材料および方法
6.2.1 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 お よ び 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 の 調 製
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 調 製 は 3 .2.1と 同 様 の 方 法 で 有 効 塩 素 濃 度 50 ppm，
pH 6.0に 調 製 し た 。次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 は ，有 効 塩 素 濃 度 12 ％ 次 亜
塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム を 水 道 水 で 希 釈 し ， 有 効 塩 素 濃 度 100 ppm， 200 ppmと な る
よ う に 調 製 し た 。 pH お よ び 有 効 塩 素 濃 度 も 3.2.1と 同 一 の 方 法 で 測 定 し た 。
6.2.2
ハクサイに付着する生菌数の測定
ハクサイの洗浄殺菌を行うにあたり，どの部位に細菌が多く付着している
かを調べるため，まず原材料のハクサイの各部位ごとの菌数測定を行った。
試 験 は ， 漬 物 原 材 料 の ハ ク サ イ を 用 い て 行 っ た 。 検 体 の 採 集 部 位 を Fig.6- 2
に 示 す 。ハ ク サ イ の 鬼 葉（ 最 外 部 の 葉 ）2 ～ 3 枚 と 根 部 を 除 去 し て 均 一 に 混 合
したものを可食部とした。採取部位は，可食部，鬼葉，鬼葉の土付着部，ハ
ク サ イ 内 部 の 褐 変 部 ， 根 部 と し た 。 各 部 位 か ら 検 体 10 g を 90 mL 滅 菌 生 理 食
塩 水 中 に 採 取 し 破 砕 し た も の を ，適 宜 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 10 倍 段 階 希 釈 し ，標
準 寒 天 培 地（ 日 水 製 薬 (株 )）お よ び XM-G 培 地（ 日 水 製 薬 (株 )）に 平 板 塗 抹 し
た 。 37 ℃ ， 4 8 時 間 培 養 後 ， 一 般 生 菌 数 ， 大 腸 菌 群 数 お よ び 大 腸 菌 数 を 測 定
した。
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弱酸性次亜塩素酸水溶液を用いたハクサイの洗浄殺菌試験
ハ ク サ イ の 洗 浄 試 験 に 使 用 す る ハ ク サ イ は ， 6.2.2 の 試 験 同 様 ， 漬 物 原 材
料 の も の を 用 い た 。 包 丁 は 水 洗 い の 後 70 ％ エ タ ノ ー ル で 清 拭 し ,十 分 乾 燥 さ
せ た 清 潔 な も の を 用 い た 。 試 験 に あ た っ て は ,ハ ク サ イ の 鬼 葉 を 包 丁 で 2～ 3
枚 除 去 し た 後 ， 4 分 割 し ,1 枚 ず つ 葉 を 外 し た も の を 試 料 と し た 。 被 験 液 は ，
水 道 水 ， 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ( 有 効 塩 素 濃 度 50 ppm ， pH 6. 0)， 次 亜 塩 素
酸 ナ ト リ ウ ム （ 有 効 塩 素 濃 度 200 ppm ， p H 9.7） の 3 種 と し た 。 洗 浄 殺 菌 条
件 を Table 4- 1 に 示 す 。 洗 浄 殺 菌 の 条 件 は 生 食 野 菜 用 洗 浄 機 で の 使 用 を 想 定
し て 設 定 し た 。洗 浄 殺 菌 は 2 段 階 で 行 い ，ハ ク サ イ 1 kg に 対 し ，一 次 洗 浄 は
各 被 験 液 10 L に 20 秒 間 撹 拌 し ,二 次 洗 浄 は い ず れ も 水 道 水 10 L に 20 秒 間 撹
拌浸漬した。
殺菌効果の測定にあたっては，各被験液で一次洗浄，二次洗浄後のハクサ
イ の 各 々 10 g を 検 体 と し て 採 取 し , 90 mL 滅 菌 生 理 食 塩 水 中 に 採 取 し 破 砕 し た 。
こ れ を 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 適 宜 10 倍 段 階 希 釈 し ， 6.2.2 と 同 様 に 一 般 生 菌 数 ，
大腸菌群数，大腸菌数を測定した。
ま た ， 漬 物 衛 生 規 範 に 基 づ く 殺 菌 方 法 と の 比 較 を 行 う た め ， 10 L の 次 亜 塩
素 酸 ナ ト リ ウ ム に ハ ク サ イ 1 kg を 有 効 塩 素 濃 度 200 pp m は 5 分 間 ， 100 ppm
は 10 分 間 静 置 浸 漬 し ,同 様 に 殺 菌 効 果 を 測 定 し た 。
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6.2.4
弱酸性次亜塩素酸水溶液で洗浄した場合のクロロホルムの生成量
被験液で洗浄後のハクサイについて，トリハロメタンの一種であるクロロ
ホルムの生成量の測定を行った。なお，漬物衛生規範に基づき次亜塩素酸ナ
ト リ ウ ム 200 p pm に 5 分 間 お よ び 10 0 ppm に 10 分 間 静 置 浸 漬 し た 場 合 に つ い
て も 同 様 に 測 定 し た 。 10 mm 角 に カ ッ ト し た ハ ク サ イ 10 g に 各 被 験 液 100 mL
を 加 え て ，20 秒 間 撹 拌 浸 漬 し ，同 様 に 漬 物 衛 生 規 範 に 基 づ き 静 置 浸 漬 し た 後 ，
速やかに被験液および次亜塩素酸ナトリウムを除去するため水切りを行なっ
た 。 そ の 後 ， 精 製 水 5 0 mL を 加 え 5 分 間 静 置 し ， 精 製 水 の 10 m L を バ イ ア ル
瓶 に 採 取 し て 30 ℃ で 1 時 間 静 置 し た 後 ，ヘ ッ ド ス ペ ー ス - GC/ECD 法（ SHIMADZU
GC-14A） に よ り ク ロ ロ ホ ル ム 量 の 測 定 を 行 っ た 。
6.3
実験結果および考察
6.3.1
ハクサイに付着する生菌数
Table 6-2 に 洗 浄 前 の ハ ク サ イ の 各 部 位 に お け る 一 般 生 菌 数 ，大 腸 菌 群 数 ，
大 腸 菌 数 を 示 す 。な お 検 出 限 界 は 1.0 log CFU/g と し た 。洗 浄 前 の ハ ク サ イ か
ら採取したすべての部位の検体から一般生菌が検出され，可食部の一般生菌
数 は 6.4 logCF U/g で あ り ，こ の 値 は 浅 漬 の 製 造 ・ 流 通 管 理 マ ニ ュ ア ル に 記 載
された浅漬原料ハクサイの一般生菌数の値ともほぼ同等であった
103）
。最も
一 般 生 菌 数 が 多 か っ た の は ， ハ ク サ イ 内 部 の 褐 変 部 で ， 8.5 lo gCFU/g の 一 般
生菌数が検出された。これは，可食部全体よりも 2 桁以上高い値であり，褐
変が微生物によるものであることを示唆していた。製造時に褐変部が混入す
ると，漬物の浸漬液を介して，製品全体に汚染が拡大することが懸念される
ため，褐変部を除去することは重要であると考えられる。
大 腸 菌 群 数 は ， 鬼 葉 ， 鬼 葉 の 土 付 着 部 ， 根 部 に お い て 各 々 2. 9， 3.3， 2.5
logCFU/g が 検 出 さ れ た 。大 腸 菌 数 は 本 試 験 に お い て は す べ て の 検 体 で 検 出 限
界以下であった。この結果は，ハクサイは外側から土壌を介して大腸菌群に
汚染されることを示唆している。本試験においていずれの条件においても大
腸菌は検出されなかったが，大腸菌については土付着部や根部を介した汚染
経路が指摘されており
104-105)
，製 造 現 場 で は ,前 処 理 時 に 土 が 付 着 し た 鬼 葉 や
根部は除去することが望ましいと考えられた。
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6.3.2
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弱酸性次亜塩素酸水溶液を用いたハクサイの洗浄殺菌試験
Table 6-3 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 お よ び 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム で ハ ク
サイを洗浄殺菌した場合の一般生菌数を示す。なお本試験においては大腸菌
群 数 お よ び 大 腸 菌 数 は す べ て の 検 体 に お い て 検 出 限 界 以 下 （ < 1.0 logCFU/g）
であった。
洗 浄 殺 菌 前 の ハ ク サ イ の 一 般 生 菌 数 は 5.6 logCFU/g で あ っ た が ， 水 道 水 ，
50 ppm 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， 2 00 ppm 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム で 20 秒 間 の
一 次 洗 浄 を 行 っ た 場 合 ， 一 般 生 菌 数 は 各 々 5.0， 3.7， 4 .1 logC FU/g に 低 下 し
た 。さ ら に , 水 道 水 で 二 次 洗 浄 を 行 な っ た 後 の 一 般 生 菌 数 は 各 々 4.4，3.2 ，3.5
logCFU/g と な っ た 。漬 物 衛 生 規 範 に 基 づ き 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム で 静 置 浸 漬
し た 場 合 の 一 般 生 菌 数 は ， 有 効 塩 素 濃 度 100 ppm で 10 分 浸 漬 し た 場 合 4.1
logCFU/g， 200 ppm で 5 分 間 浸 漬 し た 場 合 は 3.6 logC FU/g で あ っ た 。
水道水で洗浄した場合の一次洗浄後，二次洗浄後の殺菌率を算出すると
各 々 72.6 %， 9 3.8 % と な っ た 。 こ れ は 撹 拌 に よ る 物 理 的 な 洗 浄 効 果 に よ り ，
一 般 生 菌 数 が 低 下 し た と 考 え ら れ る 。 50 p pm 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 用 い
た 場 合 の 殺 菌 率 を 算 出 す る と 各 々 9 8.6 % ， 99.5 %と な り ， 水 道 水 よ り も 明 ら
か に 高 い 殺 菌 効 果 が 認 め ら れ た 。 ま た 200 ppm 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム を 用 い
た 場 合 の 殺 菌 率 を 算 出 す る と ， 各 々 96.9 %， 99.1 %と な り ， 弱 酸 性 次 亜 塩 素
酸 水 溶 液 と ほ ぼ 同 等 の 殺 菌 効 果 で あ っ た 。pH を 弱 酸 性 に 調 整 す る こ と に よ り ,
水 中 の 塩 素 の 形 態 が 解 離 型 の 次 亜 塩 素 酸 イ オ ン （ ClO - ） か ら 非 解 離 型 の 次 亜
塩 素 酸（ HClO）に 変 化 し た こ と か ら , 低 濃 度 で も 同 等 の 殺 菌 効 果 を 得 る こ と が
できたと考えられる。
ま た ， 50 pp m 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で の 撹 拌 洗 浄 は 漬 物 衛 生 規 範 で 定 め
ら れ た 殺 菌 条 件 で あ る ，次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 200 ppm で 5 分 ，あ る い は 100
ppm で 10 分 の 浸 漬 よ り も 高 い 殺 菌 効 果 を 示 し た 。各 条 件 に お け る 二 次 洗 浄 後
お よ び 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 静 置 浸 漬 後 の 一 般 生 菌 数 に つ い て Student's- t
検 定 を 用 い ，有 意 差 を 検 定 し た と こ ろ ，二 次 洗 浄 後 の 水 道 水 と 50 ppm 弱 酸 性
次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で の 間 に 有 意 差 が 認 め ら れ た （ p<0.0 5）。
生野菜の洗浄殺菌においては，静置浸漬のみよりも撹拌やバブリング，超
音波など物理的な洗浄を組み合わせることによって殺菌効果が向上すること
が報告されている
15,106)
。また，漬物原料やカット野菜などの大規模製造工
場においては，洗浄殺菌は野菜洗浄機等のライン上で行われることが多く，
漬物衛生規範で推奨される浸漬時間を確保できない場合も多い。本試験にお
い て は ，撹 拌 と い う 物 理 的 な 洗 浄 を 組 み 合 わ せ る こ と に よ っ て ，20 秒 と い う
短時間でも漬物衛生規範で求められる殺菌効果と同等の効果が得られており，
食品製造工程においても適用が可能であると考えられる。
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弱酸性次亜塩素酸水溶液で洗浄した場合のクロロホルムの生成量
トリハロメタンは水道水の浄水過程や食材の洗浄過程で水中のフミン質等
の有機物と有効塩素が反応して生成する物質で，日本では水道水質基準に総
トリハロメタンとクロロホルム，ブロモジクロロメタン，ジブロモクロロメ
タンおよびブロモホルムの 4 物質が定められている
107-108)
。総トリハロメタ
ンのうち，クロロホルムおよびブロモジクロロメタンは発がん性が疑われて
お り ， IARC( 国 際 が ん 研 究 機 関 ) の Group2B ( 発 が ん 性 が あ る か も し れ な い 物
質 )に 分 類 さ れ て い る
109)
。ク ロ ロ ホ ル ム は ，一 般 的 に 総 ト リ ハ ロ メ タ ン に 占
める割合が大きいことから
110)
，食品中へ残存し人体へ与える影響が大きい
と考え，検討を行った。
Table 6-4 に 水 道 水 , 50 ppm 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ,20 0 ppm 次 亜 塩 素 酸
ナトリウムでハクサイを洗浄殺菌した場合のハクサイに残存したクロロホル
ム の 生 成 量 を 示 す 。 洗 浄 殺 菌 前 の ハ ク サ イ の ク ロ ロ ホ ル ム 量 は 0.09 μ g/g
で あ っ た 。 水 道 水 ， 5 0 ppm 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 ， 200 ppm 次 亜 塩 素 酸 塩
素 酸 ナ ト リ ウ ム で 20 秒 間 撹 拌 洗 浄 殺 菌 し た 後 の ハ ク サ イ の ク ロ ロ ホ ル ム の
生 成 量 は ， 各 々 0.16 ， 0.19， 0.89 μ g/g で あ り ， 洗 浄 殺 菌 前 の ハ ク サ イ よ り
もいずれも高い値となった。また，漬物衛生規範に基づき次亜塩素酸ナトリ
ウ ム で 静 置 浸 漬 し た 場 合 の ク ロ ロ ホ ル ム の 生 成 量 は ， 有 効 塩 素 濃 度 100 pp m
で 10 分 お よ び 200 pp m で 5 分 間 の 場 合 で 各 々 0.71， 0.87 μ g/g で あ っ た 。
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 と 水 道 水 を 比 較 し た 場 合 ,ク ロ ロ ホ ル ム の 生 成 量
は ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。 こ れ に 対 し 200 pp m の 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム を 用 い た
場 合 で は 0.89 μ g/g で あ り ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で 洗 浄 殺 菌 し た 場 合 の
約 4.5 倍 ，さ ら に 漬 物 衛 生 規 範 に 基 づ く 洗 浄 殺 菌 を 行 っ た 場 合 の 0.71，0.8 7
μ g/g よ り 高 い 生 成 量 で あ り ， 本 試 験 の 条 件 の 中 で 最 も 高 い ク ロ ロ ホ ル ム 生
成量であった。クロロホルムの生成量はアルカリ域で増大することが報告さ
れており
44-45)
，本 試 験 に お い て も 弱 酸 性 域 に 調 整 す る こ と に よ り 水 道 水 と 同
程度にまでクロロホルムの生成量が抑制されたと考えられる。
なお，食品中のクロロホルムの基準値は定められていないが，国内の水道
水 の 水 質 基 準 で は 0. 06 mg/L， WHO で は 0. 2 mg/L と 定 め ら れ て お り
111-112)
,
本 試 験 に お け る ク ロ ロ ホ ル ム 生 成 量 は こ の 値 よ り も 高 い 。し か し ,ク ロ ロ ホ ル
ムは水洗や空気中への揮散により減少するため
113)
，弱酸性次亜塩素酸水溶
液 処 理 し た ハ ク サ イ か ら 消 費 者 が 摂 取 す る ク ロ ロ ホ ル ム 量 は ,実 際 に は さ ら
に低くなると考えられる。
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し か し ，魚 介 類 な ど 腐 敗 に よ っ て 食 品 自 体 の pH が ア ル カ リ 性 に 変 化 す る も
のもあり
114)
,こ れ ら に 塩 素 殺 菌 を 用 い る 場 合 ,ク ロ ロ ホ ル ム の 発 生 に よ る 摂
取リスクは高いといえる
115,116)
。ま た , 塩 素 に よ る 消 毒 副 生 成 物 は ，他 に も 染
色 体 異 常 あ る い は 形 質 転 換 誘 発 性 が 高 い ハ ロ 酢 酸 類 ， ま た TO X に 分 類 さ れ る
未 知 の 消 毒 副 生 成 物 が 50 ％ 以 上 存 在 す る
117)
。 そ の た め ,弱 酸 性 域 で 低 濃 度
かつ短時間で漬物衛生規範と同等の殺菌効果を有する弱酸性次亜塩素酸水溶
液は，さらなるリスク低減に有用であると考える。
6.4
まとめ
漬物原料であるハクサイについて弱酸性次亜塩素酸水溶液での殺菌効果お
よび残存するクロロホルム量の検討を行った。ハクサイの最外葉や褐変部は
一般生菌や大腸菌群の汚染リスクが高かった。弱酸性次亜塩素酸水溶液を用
い て 撹 拌 洗 浄 を 行 う と 20 秒 間 と い う 短 時 間 で 漬 物 衛 生 規 範 に 推 奨 さ れ た 方
法と同等の殺菌効果を得ることができ，またクロロホルムの生成量も抑制さ
れた。よって弱酸性次亜塩素酸水溶液は，ハクサイの洗浄殺菌において作業
効率を高めることができ，かつ有害な消毒副生成物の生成も抑えることがで
きることから，有用性が高いことが示された。
第 7章
弱酸性次亜塩素酸水溶液を鶏への飲水に用いた場合の殺菌効果,
生産性および安全性への影響
5.1
はじめに
養鶏場では同種の動物を高密度飼育することから，感染症のリスクが非常
に高い。また，鳥インフルエンザや家禽コレラ等，家畜伝染病予防法で特定
伝染病に指定された感染症が発生した場合，多くの鶏に感染して死亡するだ
けでなく，感染を食い止めるために同鶏舎・農場内の鶏の淘汰や発生農場か
ら 半 径 10 km 圏 内 の 農 場 で の 家 禽 の 移 動 制 限 な ど が 行 わ れ る た め ， そ の 経 済
的な損失も莫大である
17)
。こ れ ま で 感 染 症 は 飼 育 時 に 予 防 的 に 抗 生 物 質 を 投
与することで抑制してきたが，過剰の抗生物質投与による薬剤耐性微生物の
産生が指摘されており
21-22)
，そ の 使 用 量 の 削 減 が 求 め ら れ て い る 。そ の た め ，
感染症防御の手法は，鶏舎内の衛生管理を徹底することで，病気の発生およ
び蔓延を防止する方向に転換しつつある。
鶏 舎 内 の 衛 生 管 理 の 中 で 重 要 な 項 目 の １ つ と し て ,飲 用 水 の 清 浄 性 の 確 保
があげられる。鶏舎内では複数の鶏が共用する飲水器が汎用されており，鳥
インフルエンザ，大腸菌症，ニューカッスル病等の感染症に感染した鶏の鼻
汁や唾液中に含まれる細菌やウイルスが給水器内に混入した場合，飲水を介
して感染が拡大することが指摘されている
118-119)
。そのため，農林水産省の
高病原性鳥インフルエンザに関する特定家畜伝染病防疫指針の中でも「給水
用 の 水 は ，飲 用 に 適 し た も の か 消 毒 し た も の を 用 い る 」と 規 定 さ れ て い る
17)
。
本研究では，飲用水消毒の資材として弱酸性次亜塩素酸水溶液の検討を行
った。弱酸性次亜塩素酸水溶液は殺菌効果が高く，かつ抗菌スペクトルが広
いため，鶏の感染症の原因となる微生物に対する殺菌・ウイルス不活化効果
を有している。また，鶏舎内洗浄や卵殻表面の洗浄でも使用の検討が進めら
れており
120)
，高い殺菌効果を有することが報告されている。
本章では，養鶏現場における飲用水消毒資材としての弱酸性次亜塩素酸水
溶液の有効性について検討した。鶏舎内の給水システム内で弱酸性次亜塩素
酸水溶液を使用し，給水システム内の各計測ポイントにおける残留塩素濃度
および各種微生物の生菌数の測定を行った。また，生産現場での実用化のた
め に ,鶏 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 長 期 間 飲 水 さ せ る こ と に よ る 生 体 お よ
び生産成績へ及ぼす影響について確認しておく必要がある。既往の研究
121)
で は 有 効 塩 素 濃 度 50 ～ 400 ppm の 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液 を 28 日 間 採 卵
鶏 に 飲 水 さ せ た 場 合 , 400 ppm 以 下 の 濃 度 で あ れ ば 産 卵 率 な ど の 生 産 性 や 血 液
性状などの生理諸元に大きな影響を及ぼさないことが報告されているが，弱
酸性次亜塩素酸水溶液を長期間飲水させた場合については検討されていない。
そ こ で ， ブ ロ イ ラ ー 種 鶏 に 餌 付 け か ら 淘 汰 ま で (1～ 64 週 齢 ) ま で 弱 酸 性 次 亜
塩素酸水溶液を長期間飲水させた場合の生産成績および安全性について検討
を行った。
7.2． 材 料 お よ び 方 法
7.2.1
弱酸性次亜塩素酸水溶液の調製
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 調 製 は 3 .2.1と 同 様 の 方 法 で 有 効 塩 素 濃 度 50
ppm，pH 5.5～ 6 .5に 調 製 し た 。pHお よ び 有 効 塩 素 濃 度 も 3 .2.1と 同 一 の 方 法 で
測定した。
7.2.2
弱酸性次亜塩素酸水溶液の供給システム
飲 水 試 験 は 福 田 種 鶏 場 (本 社 岡 山 市 )の 鶏 舎 に て 行 っ た 。ブ ロ イ ラ ー 用 種 鶏
(雌 :白 色 プ リ マ ス ロ ッ ク 種 )の 雌 初 生 ヒ ナ 16440 羽 を 供 試 し た 。供 試 鶏 は 82 20
羽 ず つ 2 群 に 分 け ,対 照 区 と 試 験 区 に 割 り あ て ,そ れ ぞ れ 1190 m 2 の 鶏 舎 に 収
容し，平飼い飼育した。
Fig.7-1, Pic. 7-1 に 鶏 舎 内 へ の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 供 給 シ ス テ ム の 模
式図および実験風景を示す。試験区には弱酸性次亜塩素酸水溶液を，対照区
には水道水を飲水させた。供試水は各々一旦給水タンクに貯めたものを，配
管 を 通 じ て ベ ル 型 給 水 器 に 供 給 し ， 餌 付 け (1 週 齢 )か ら 淘 汰 (6 4 週 齢 )ま で 自
由 飲 水 で 給 与 し た 。な お ,餌 付 け か ら 1 週 間 (0 週 齢 )ま で は す べ て の ヒ ナ に 弱
酸性次亜塩素酸水溶液を飲水させ，１週齢時より試験を開始した。
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7.3
評価項目
7.3.1
残留塩素濃度
水中塩素における有効塩素は遊離塩素と結合塩素に大別される。遊離塩素
は殺菌効力が高い半面，反応性に富むため失活しやすく，結合塩素は他の有
機 物 と の 反 応 速 度 が 遅 く 殺 菌 効 力 が 低 い 反 面 ，持 続 性 が あ る
13）
。弱 酸 性 次 亜
塩素酸水溶液の有効塩素はすべて遊離塩素として存在しているが，有機物と
反応すると結合塩素に変化し，さらに反応が進むと失活して有効塩素濃度が
低下する。
本 試 験 で は ，5 5 週 齢 時 に 試 験 区 お よ び 対 照 区 の 給 水 タ ン ク 内 中 央 部 1 ヶ 所
(n=1)，給 水 器 の 流 入 口 2 ヶ 所 (n=2) お よ び 給 水 器 内 部 5 ヶ 所 (n= 5)か ら 飲 用 水
を 採 取 し た 。遊 離 塩 素 濃 度 は DPD 法 残 留 塩 素 測 定 器（ (株 )SIB ATA）を 用 い て
DPD 法 に て 測 定 し ，総 塩 素 濃 度 は 残 留 塩 素 比 色 測 定 器 (ア ド バ ン テ ッ ク 東 洋 株
式 会 社 )を 用 い て KI 法 に て 測 定 し た 。 結 合 塩 素 濃 度 は 総 塩 素 濃 度 か ら 遊 離 塩
素濃度を差し引いて算出した。
7.3.2
生菌数の測定
生菌数は，一般生菌，真菌，ブドウ球菌，サルモネラ属菌，大腸菌群の 5
種 を 測 定 し た 。7.3.1 で 採 取 し た 水 を 滅 菌 生 理 食 塩 水 を 用 い て 適 宜 10 倍 段 階
希 釈 し た 後 ， そ れ ぞ れ 下 記 の 各 種 培 地 に 平 板 塗 抹 し ， 3 7 ℃ ， 48 時 間 培 養 し
て生菌数を算出した。使用培地は，一般生菌数では標準寒天培地（日水製薬
株 式 会 社 ），真 菌 数 で は ポ テ ト デ キ ス ト ロ ー ス 寒 天 培 地 (日 水 製 薬 株 式 会 社 ) ，
ブ ド ウ 球 菌 数 で は マ ン ニ ッ ト 食 塩 寒 天 培 地 (日 水 製 薬 株 式 会 社 )， サ ル モ ネ ラ
属 菌 数 で は ブ リ リ ア ン ト グ リ ー ン 寒 天 培 地 (BECTON DIC KINSON )， 大 腸 菌 群 数
で は デ ゾ キ シ コ レ ー ト 寒 天 培 地 (ME RCK) と し た 。 統 計 解 析 は S tudent's-t 検
定で試験区と対照区間で有意差の検定を行なった。
7.3.3
育成率および生存率ならびに産卵率の算出
試験区ならびに対照区の鶏の斃死数ならびに淘汰数を 1 週間ごと調査し，
試 験 開 始 (1 週 齢 時 ) か ら 24 週 齢 時 ま で の 育 成 率 並 び に 24 週 齢 か ら 淘 汰 (64
週 齢 時 )ま で の 生 存 率 を 以 下 の 式 で 算 出 し た 。 な お ， 24 週 齢 時 に 試 験 区 な ら
び に 対 照 区 の 鶏 の 生 存 羽 数 が 同 数 に な る よ う 調 整 し ，生 存 率 は 24 週 齢 時 の 生
存羽数を母数 として 同様に算出し た。統 計解析は，1 週 間毎に 値を求め，χ 2
検定を行ない比較した。
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
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斃死数 + 淘汰数
週齢時生存羽数
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産 卵 率 は ， 2 4 週 齢 時 か ら 64 週 齢 時 ま で の 1 週 間 毎 の 平 均 値 か ら ヘ ン デ イ
産卵率
122)
を算出した。なお，同種鶏場で同月に餌付けした過去 4 年分のヘ
ンデイ産卵率についても算出して平均値を求めた。統計解析は，1 週間毎の
平 均 値 を 角 変 換 し た 後 ， 10 週 毎 に Studen t's－ t 検 定 で 有 意 差 の 検 定 を 行 な
った。
7.3.4
臓器重量・血液性状・組織学的検査
臓 器 重 量 ・ 血 液 性 状 ・ 組 織 学 的 検 査 は 1 ，7，20 ，64 週 齢 時 に 試 験 区 ，対 照
区 か ら 各 々 6 羽 の 鶏 を 無 作 為 に 選 び , 体 重 測 定 後 ，採 血 お よ び 解 剖 を 行 い ，臓
器 重 量 12 項 目 お よ び 血 液 性 状 3 1 項 目 の 測 定 を 行 っ た 。 測 定 項 目 の 詳 細 は
Table 7- 1 に 示 す 。 有 意 差 の 検 定 は S tud ent's－ t 検 定 に よ り 行 っ た 。 組 織
学的検査は，腎臓および肝臓の一部をブアン固定した後，ヘマトシキリン・
エオジン染色を行い観察した。
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結果および考察
7.4.1
残留塩素濃度および生菌数
鶏 舎 内 で 採 取 し た 各 計 測 ポ イ ン ト (Fig.7- 1) の 水 の 残 留 塩 素 濃 度 の 平 均 値
を Fig.7-2 に 示 す 。 試 験 区 の 給 水 タ ン ク 内 の 残 留 塩 素 は す べ て 遊 離 塩 素 と し
て 存 在 し ，遊 離 塩 素 濃 度 は 50.0 pp m で あ っ た 。給 水 器 の 流 入 口 で は 遊 離 塩 素
濃 度 は 30.5 p pm に 低 下 し ， 結 合 塩 素 濃 度 は 12.0 ppm と な っ た 。 さ ら に ， 給
水 器 内 で は 遊 離 塩 素 濃 度 は 1.1 pp m に 低 下 し ， 結 合 塩 素 濃 度 は 1 3.5 ppm と な
っ た 。 一 方 ， 対 照 区 で は 給 水 タ ン ク 内 は 遊 離 塩 素 濃 度 が 0.07 ppm， 結 合 塩 素
濃 度 が 0.2 pp m で あ っ た 。 し か し ， 給 水 器 の 流 入 口 な ら び に 給 水 器 内 部 に お
いては遊離塩素，結合塩素とも検出されなかった。
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給 水 シ ス テ ム 内 の 各 計 測 ポ イ ン ト で 検 出 さ れ た 生 菌 数 を Fig .7-3 に 示 す 。
一般生菌数は試験区の給水タンクでは検出限界以下であったが，給水器内で
は 1.3×10 3 CFU/m L と な り ，給 水 シ ス テ ム の 下 流 ほ ど 菌 数 が 増 加 し た 。一 方 ，
対 照 区 で は 給 水 タ ン ク 内 2.7×10 3 CFU/mL か ら 給 水 器 内 4.4×10 6 CFU/mL の 値
となり，下流ほど著しい菌数の増加が認められ，給水器内の菌数は試験区で
は有意に低い値を示した。真菌数は試験区の給水タンクでは検出限界以下で
あ っ た が 給 水 器 内 で は 増 加 が 認 め ら れ た 。 対 照 区 で は 給 水 タ ン ク 1.1×10 3
CFU/mL か ら 給 水 器 内 8.6×10 2 C FU/mL と な り ， 増 加 は ほ と ん ど 認 め ら れ な い
ものの試験区よりも有意に高い値であった。ブドウ球菌数は，試験区では給
水 タ ン ク が 検 出 限 界 以 下 ，給 水 器 内 1. 2×10 3 CFU/mL，こ れ に 対 し て 対 照 区 で
は 給 水 タ ン ク 内 1 .8× 10 3 CFU /mL， 給 水 器 内 3.3×10 6 C FU/mL と な り ， 一 般 生
菌数の場合と同様に試験区が対照区より有意に低い値となった。グラム陰性
菌であるサルモネラ属菌ならびに大腸菌群の数は，試験区では給水タンク，
給 水 器 流 入 口 ， 給 水 器 内 が い ず れ も 検 出 限 界 以 下 (<10 CFU/mL )で あ っ た の に
対 し て ，対 照 区 は 給 水 シ ス テ ム の 下 流 ほ ど 増 加 し ，給 水 器 内 で は 各 々 2.3×10 5
CFU/mL， 2. 2×10 4 CFU /mL で あ っ た 。 こ の よ う に ， 試 験 区 の 生 菌 数 は ， 対 照 区
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塩素系消毒剤は，有機物と容易に反応して遊離塩素が結合塩素に変化し，
また還元されて残留塩素濃度が低下して殺菌効力が低下する
35-38)
。試 験 区 で
は給水タンク内の残留塩素はすべて遊離塩素であったが，給水システムの下
流 ほ ど 残 留 塩 素 は 低 下 し ， 給 水 器 内 で は 給 水 タ ン ク の 29.2 % と な り ， 残 留 塩
素 濃 度 の 92.5 %が 結 合 塩 素 と し て 存 在 し て い た 。 一 方 ， 対 照 区 の 給 水 タ ン ク
内では水道水に含まれる残留塩素が検出されたが，給水器内部までは残留塩
素濃度が維持できないことが明らかとなった。これらの残留塩素濃度の低下
は，給水システム内の汚れや，鶏舎内の糞や埃などの有機物が混入したこと
によるものと考えられ，配管内や給水器の洗浄が重要である。
給水システム内の生菌数を調査した結果，試験区においては給水タンク内
には各菌種とも生菌数は検出限界以下となり，給水システムの下流ほど生菌
数が増加する傾向が認められた。試験区での大腸菌群数およびサルモネラ属
菌数はすべての地点において検出限界以下であったことから，弱酸性次亜塩
素酸水溶液はグラム陰性菌に対して特に殺菌効果が高いことが示された。養
鶏業界ではサルモネラ菌による鶏卵の汚染や緑膿菌症，大腸菌症などグラム
陰性菌が原因となって発生する疾病が多くあることから
123)
，これらの衛生
管理にも有効性が高いことが明らかとなった。一方，対照区の給水タンク内
には残留塩素が検出されているにもかかわらず，大腸菌群を除く各種生菌が
検出された。対照区でも給水システムの下流ほど生菌数が増加する傾向が認
められ，ブドウ球菌を含めたグラム陽性菌が増殖した可能性が示唆された。
現在，鶏舎内での飲水には水道水を使うことが推奨されているが，給水シス
テム内では鶏舎内の粉塵や汚れの混入から飲用水中で微生物が増殖し，衛生
管理が不十分となることが示唆された。
また，養鶏農家ごとに給水器の種類や配管内の汚染度が異なるため，有効
塩素濃度の低下の度合も異なることが考えられる。本実験では給水タンク内
の 有 効 塩 素 濃 度 を 50 ppm に 設 定 し た が ， 有 効 塩 素 濃 度 や pH を 確 認 し ， 給 水
システム内での有効塩素濃度の低下を加味した上で供給する水の有効塩素濃
度を設定する必要があると考えられる。
7.4.2
育成率および生存率ならびに産卵率
Fig.7-4 に 各 週 齢 に お け る 育 成 率 お よ び 生 存 率 を 示 す 。 最 も 育 成 率 の 差 が
大きかったのは餌付け 2 週齢時で，試験区並びに対照区の育成率は各々
99.6 ％ ， 98.8 ％ と な り ， 0.8 ポ イ ン ト の 差 が 認 め ら れ た 。 そ の 後 ， 2 4 週 齢
ま で 全 期 間 を 通 し て 試 験 区 が 有 意 に 高 か っ た 。生 存 率 は ，25～ 27 週 齢 時 は 試
験 区 が 有 意 に 高 い 値 を 示 し た が ，そ の 後 は 64 週 齢 時 ま で 有 意 な 差 は 認 め ら れ
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24～ 64 週 齢 時 の 1 0 週 毎 の 産 卵 率 の 平 均 値 を Table 7-2 に 示 す 。 試 験 区 と
対照区および過去 4 年分の産卵率の値と比較したところ，対照区との比較で
は 35～ 54 週 齢 時 に ， 過 去 ４ 年 分 の 産 卵 率 と の 比 較 で は 35～ 44 週 齢 時 に 有 意
に 低 い 傾 向 が 認 め ら れ た が (p<0.05 )， 全 期 間 を 通 し た 産 卵 率 に は 有 意 差 は 認
められなかった。
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弱酸性次亜塩素酸水溶液を長期間にわたって飲水させた場合の安全性並び
に生産性に及ぼす影響については今まで検討されていないが，次亜塩素酸ナ
トリウム水溶液を採卵鶏に飲水させた場合の結果が報告されている
121)
。こ
の 報 告 に よ る と ， 有 効 塩 素 濃 度 50 ～ 400 ppm の 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム を 28
日 間 給 水 し ， 4 00 pp m 以 下 の 濃 度 で あ れ ば 産 卵 率 な ど の 生 産 性 や 血 液 性 状 な
どの生理面に大きな影響を及ぼさないことが明らかにされている。本試験で
用 い た 飲 用 水 は 給 水 タ ン ク 内 で の 有 効 塩 素 濃 度 が 50 pp m で あ り ，さ ら に 高 い
有効塩素濃度での利用が効果的であることが示唆された。また，本試験での
結果，試験区の育成率は対照区に比べて有意に高く，特に餌付け初期に高い
ことが認められた。この理由として，餌付け初期はヒナの抵抗力が弱く弱酸
性次亜塩素酸水溶液の飲水効果が現れたものと考えられる。
産 卵 率 は ， 35～ 44 週 齢 時 に お い て ， 試 験 区 の 産 卵 率 が ， 対 照 区 ， 過 去 4 年
分平均およびチャンキー種鶏成績目標値
124)
よりも有意に低かったが，その
後増加し，全期間を通しての試験区の産卵率の推移は過去 4 年分の産卵率お
よびチャンキー種鶏の週齢別産卵率の成績目標値との間にも差は認められな
かった。この産卵率の一時的な低下の原因については不明であるが，引き続
き検討したい。
7.4.3
臓器重量・血液性状・組織学的検査
Table5-3 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 飲 水 さ せ た 場 合 の 生 体 重 お よ び 臓
器重量を示す。生体重については飼育期間を通して有意差は認められなかっ
た 。 臓 器 重 量 に つ い て は ， 1 週 目 の 卵 巣 ， 7 週 目 の 肝 臓 お よ び 卵 巣 ， 64 周 目
の 脾 臓 お よ び 輸 卵 管 で 試 験 区 と 対 照 区 で 有 意 差 が 認 め ら れ た 。 Table 7-4 に
血 液 性 状 を 示 す 。1 週 目 の ク レ ア チ ニ ン ，2 4 週 目 の ヘ マ ト ク リ ッ ト 値 ，64 週
目のアミラーゼおよびナトリウムで有意差が認められた。
臓器重量，血液性状ともに一部の項目で有意差が認められたものの，いず
れの有意差も一時的なものであり，全期間を通して試験区および対照区の間
に目立った違いは認められず，弱酸性次亜塩素酸水溶液の飲水による影響は
認められなかった
125-127)
。
組織学的検査については，組織学的変化を観察しやすい臓器として排泄器
官 で あ る 肝 臓 お よ び 腎 臓 に 着 目 し ， 評 価 を 行 っ た 。 Fig .7-5 に 7， 24， 64 週
齢時における弱酸性次亜塩素酸水溶液および水道水を飲水させた場合の肝臓
および腎臓の組織写真を示す。肝臓は肝細胞内に空胞をわずかに認めたもの
の試験区対照区ともに同様の所見であった。腎臓は尿細管，糸球体構造とも
に両区とも異常は認められなかった
125-126)
。
以上の結果より，弱酸性次亜塩素酸水溶液を長期間飲水することによる鶏
に対する悪影響は認められず，飲水資材として利用が可能であることが明ら
かとなった。しかし，育成率および生存率の結果からは，餌付け初期に斃死
率を抑える効果が認められていることから，抵抗性の弱い育雛期や感染症が
発生する時期など，期間を限定した飲水を行うことでも生産性の向上および
感染症の抑制が期待できる。また，飲水だけでなく，鶏舎内の噴霧や洗浄な
ども併用することにより，総合的に鶏舎内の衛生環境を改善し，感染症の拡
大防止や生産成績の向上に貢献することが可能であることが示唆された。
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まとめ
弱酸性次亜塩素酸水溶液を鶏への長期間飲用水に利用した結果，給水シス
テム内の生菌数を低く抑えることが可能であり，特にグラム陰性菌に対する
殺菌効果が高かった。また，生産性については餌付け初期の育成率に向上が
見られ，生存率および産卵率は水道水を飲水させた場合と同等であった。各
成長段階における組織重量・血液生化学値および組織学的検査においても異
常は認められなかった。以上の結果より，弱酸性次亜塩素酸水溶液は殺菌効
果が高くかつ安全性の高い飲水資材であることが明らかとなり，特に餌付け
初期に適用することで生産性が向上することが示唆された。
第 8章
弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による種卵消毒への適用
8.1
はじめに
我が国におけるブロイラー鶏および採卵鶏の生産システムにおいては，種
鶏 場 に て 種 鶏 が 産 卵 し た 種 卵 (受 精 卵 )を 孵 化 さ せ て 得 ら れ た 雛 を ， 各 生 産 農
家に供給して育成することで鶏肉や鶏卵を得ている。そのため，種鶏場から
の安定した雛の供給は，国内の鶏肉・鶏卵の安定供給および生産性に非常に
重要であると言える。その一環として，種鶏場では種卵の孵化率の向上，衛
生対策の徹底の観点からふ卵衛生対策指針および鶏卵のサルモネラ総合対策
指針に基づき，卵殻表面を消毒することが推奨されている
128-129）
。
種卵消毒の方法としては消毒薬に直接種卵を浸漬して殺菌するディッピン
グ法および消毒ガスを充満させた室内で種卵を殺菌する燻蒸法が行われてい
るが，殺菌効果，コストおよび操作性に優れていることから，パラホルムア
ルデヒドやホルマリンを用いたホルマリン燻蒸が多く行われている
27-29）
。し
かしホルマリンは，発癌性があるため，作業者への健康被害が懸念されてお
り ，（ 社 ） 日 本 産 業 衛 生 学 会 は 2Ａ ( 人 間 に 対 し て 発 癌 性 が あ る と 考 え ら れ る
物 質 )に 定 め て い る
31-32)
。ま た ，2007 年 に は 労 働 安 全 衛 生 法 の 改 正 に よ っ て ，
ホルムアルデヒドは第 3 類物質から第 2 類物質に引き上げられ，発生源の密
閉化や局所排気装置などの発散抑制措置の設置や定期的な作業環境測定が義
務付けられた
33)
。こ の た め ，近 年 ホ ル マ リ ン 燻 蒸 に 替 わ る 人 体 や 環 境 に 安 全
でかつ殺菌効果の高い種卵の消毒法の開発が求められている
130-132)
。
そこで，ホルマリン燻蒸の代替殺菌法として弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴
霧による種卵消毒の検討を行った。弱酸性次亜塩素酸水溶液は殺菌効果が高
く，抗菌スペクトルが広いとともに，空間に噴霧粒子を充満させることで空
気中の浮遊菌や付着菌の殺菌も可能であることから
133-136)
，種卵の卵殻表面
についても消毒効果が期待される。
本章では弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による付着菌への殺菌効果を基礎
的に検討するとともに，実際に種卵消毒に弱酸性次亜塩素酸水溶液を適用し
た場合の卵殻表面の殺菌効果および孵化率について，従来のホルマリン燻蒸
法と比較した。
8.2
材料および方法
8.2.1
弱酸性次亜塩素酸水溶液の調製
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 調 製 は 3 .2.1と 同 様 の 方 法 で 有 効 塩 素 濃 度 30 ～
200 ppm， pH 5. 8～ 6.2 に 調 製 し た 。 p Hお よ び 有 効 塩 素 濃 度 も 3.2 .1と 同 一 の 方
法で測定した。なお，弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧条件については有効塩
素 濃 度 ， 噴 霧 量 お よ び 噴 霧 時 間 よ り 単 位 容 積 あ た り の 濃 度 時 間 積 (mg/m 3 ・ h)
を求め，評価した。
8.2.2
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 に よ る 付 着 S.aureus に 対 す る 殺 菌
試験
供 試 微 生 物 は Staphylococus aureus FDA209 P（ 以 下 S.aureus と 略 す ） を
用 い た 。実 験 に あ た っ て は ，Plate-Co unt-Ag ar(MERCK)に S.aureus を 塗 布 し ，
37℃ で 24 時 間 培 養 し た 後 ，コ ロ ニ ー を 平 板 か ら 採 取 し 滅 菌 精 製 水 に 懸 濁 し た
ものを菌懸濁液とした。
Fig.8-1 に 本 実 験 で 使 用 し た 実 験 用 ブ ー ス （ 容 積 0 .3 m 3 ） を 示 す 。 菌 懸 濁
液 を 直 径 9 0 mm の 滅 菌 ガ ラ ス シ ャ ー レ 上 に 10 7 CFU/pl ate と な る よ う 薄 く 塗
布し風乾させたものをビニールブース内の 5 地点に設置した。ビニールブー
ス 内 で 有 効 塩 素 濃 度 3 0～ 200 ppm の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 超 音 波 式 噴 霧
装 置 MicroFog ger300 （（ 株 ） エ イ チ ･エ ス ･ピ ー ）） を 用 い て 一 定 時 間 噴 霧 を
行 っ た 。 な お ， Micro Fogger300 の 噴 霧 量 は 50 mL/h で あ っ た 。
殺 菌 効 果 の 評 価 に 当 た っ て は 噴 霧 前 後 の ガ ラ ス シ ャ ー レ 表 面 の S.aureus
を 標 準 寒 天 ス タ ン プ 培 地 (日 水 製 薬 )に て 採 取 し ， 37 ℃ ， 48 時 間 培 養 し た 後
生菌数を測定した。5 地点の生菌数の平均値を求め，噴霧前の生菌数に対す
る噴霧後の生菌数の割合を残存率として評価した。
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8.2.3
弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による卵殻表面の一般生菌に対す
る殺菌試験
種卵はチャンキー純系種のものを用いた。実験にあたっては，鶏舎より採
取 し た 種 卵 の 卵 殻 表 面 を 滅 菌 綿 棒 で ふ き 取 り ， 標 準 寒 天 培 地 で 37 ℃ ， 24 時
間培養し，出現したコロニーを平板からランダムに採取し生理食塩水に懸濁
したものを菌懸濁液とした。種卵を菌懸濁液に浸漬した後，風乾させたもの
を試験卵として実験に供した。
実 験 用 ブ ー ス （ 容 積 0 .3 m 3 ） 内 の 5 地 点 に 試 験 卵 を 設 置 し た 。 有 効 塩 素 濃
度 30～ 200p pm の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 噴 霧 装 置 MicroFogg er600((株 )エ
イ チ ･ エ ス ･ ピ ー ）） を 用 い て 一 定 時 間 噴 霧 を 行 っ た 。 な お ， Mic roFogger600
の 噴 霧 量 は 80 mL/h で あ っ た 。
殺菌効果の評価に当たっては，噴霧前後の試験卵の表面を滅菌綿棒を用い
て卵全周をふき取ったものを滅菌生理食塩水に懸濁し，適宜滅菌生理食塩水
で 10 倍 希 釈 し た も の を 標 準 寒 天 培 地 に 平 板 塗 抹 し た 。 3 7 ℃ ， 4 8 時 間 培 養 し
た後生菌数を測定し，5 地点の生菌数の平均値を求め，噴霧前の生菌数に対
する噴霧後の生菌数の割合を残存率として評価した。
8.2.4
種鶏場における弱酸性次亜塩素酸水溶液噴霧による種卵消毒
実 用 試 験 は 種 鶏 場 の 種 卵 燻 蒸 室 に て 行 っ た 。Fig.6-2，Pic.6-1 に 燻 蒸 室 内
の 配 置 図 お よ び 写 真 を 示 す 。 容 積 24 m 3 の 燻 蒸 室 に 168～ 184 8 個 の 種 卵 を 詰
め た ワ ゴ ン ，攪 拌 扇 4 台 お よ び ポ ー タ ブ ル 式 噴 霧 装 置 (( 株 )エ イ チ・エ ス・ピ
ー製
Trans F ogger) 2 台 を 設 置 し た 。 噴 霧 は 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 (有 効
塩 素 濃 度 200 p pm，pH 6.0～ 6.5)を 噴 霧 量 57 0 mL/ｈ の 条 件 で 90 分 間 行 っ た 。
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殺菌効果の評価にあたっては，噴霧開始前および噴霧開始後のワゴンから
種 卵 を 10 個 ず つ 採 取 し ，滅 菌 綿 棒 を 用 い て 卵 全 周 を ふ き 取 っ た も の を 滅 菌 生
理 食 塩 水 に 懸 濁 し ，適 宜 滅 菌 生 理 食 塩 水 で 1 0 倍 希 釈 し た も の を 標 準 寒 天 培 地
に 平 板 塗 抹 し ， 37 ℃ ， 48 時 間 培 養 し た 後 生 菌 数 を 測 定 し ， 噴 霧 前 の 生 菌 数
に対する噴霧後の生菌数の割合を算出した。また，消毒した種卵の孵化率に
ついても検討を行った。
対 照 と し て ， 同 燻 蒸 室 で パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 10 g/m 3 の 条 件 で ホ ル マ リ
ン 燻 蒸 を 20 分 間 行 っ た 後 ， 70 分 換 気 を 行 い ， 殺 菌 効 果 お よ び 孵 化 率 に つ い
て比較した。
8.3
結果および考察
8.3.1
弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 に よ る S.aureus お よ び 卵 殻 表 面 の
一般生菌に対する殺菌効果
Fig.8-3 に WAHS を 噴 霧 し た 場 合 に お け る ガ ラ ス シ ャ ー レ 表 面 の S.aureus
の 残 存 率 を 示 す 。 噴 霧 前 の 生 菌 数 は 1.2× 10 2 ～ 3.0×10 3 CF U で あ っ た 。 滅 菌
蒸 留 水 を 噴 霧 し た 場 合 の 残 存 率 は 41.5% で あ っ た が ， 有 効 塩 素 の 濃 度 時 間 積
が 増 加 す る と と も に 残 存 率 は 減 少 し ，濃 度 時 間 積 4.5mg/ m 3 ･h 以 上 の 条 件 で は
残 存 率 は 0.69 %， 0.3 3 ％ と 高 い 殺 菌 効 果 が 認 め ら れ た 。
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Fig.8-4 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 噴 霧 し た 場 合 に お け る 卵 殻 表 面 の 一
般 生 菌 の 残 存 率 を 示 す 。 噴 霧 前 の 一 般 生 菌 数 は 2.9×10 2 ～ 1.7 ×10 5 CFU/卵 1
個であった。卵殻表面の一般生菌数の残存率は濃度時間積が増加するととも
に 減 少 し ， 濃 度 時 間 積 6.4mg/m 3 ･h の 条 件 で は 残 存 率 は 0.2 ％ と な り ， 卵 殻
表面に付着した一般生菌に対しても高い殺菌効果が認められた。
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以上の実験により，弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧はガラス表面に塗布し
た S.aureus お よ び 卵 殻 表 面 に 存 在 す る 一 般 生 菌 に 対 し て 高 い 消 毒 効 果 を 有
することが明らかとなった。これは消毒対象物の表面に弱酸性次亜塩素酸水
溶液の噴霧粒子が付着することにより消毒効果を発揮したと考えられる。一
般 的 に ， 卵 殻 表 面 の 菌 相 に つ い て は Lactobacillus ， Streptococcus ，
Enterobacteriaceae な ど が 卵 殻 汚 染 の 主 力 菌 と し て 報 告 さ れ て い る が
137)
，
本 実 験 で 用 い た S.aureus も 乾 燥 に 強 い た め 卵 殻 表 面 で の 寿 命 が 長 く ，か つ 食
中毒の原因菌であることから留意が必要な菌種とされている。本実験では弱
酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 に よ り S.aureus お よ び 卵 殻 表 面 菌 に 対 し て 消
毒効果を有しており，これら卵殻汚染の原因菌に対しても効果があることが
示唆された。
安 定 し た 殺 菌 効 果 を 得 る た め の 噴 霧 条 件 は ，ガ ラ ス シ ャ ー レ 上 の S.aureus
で は 濃 度 時 間 積 4.5 mg/m 3 ･h 以 上 ， 卵 殻 表 面 の 一 般 生 菌 で は 濃 度 時 間 積 6. 0
mg/m 3 ･ h 以 上 で あ り ， 卵 殻 表 面 の 方 が 高 い 値 と な っ た 。 こ れ は ， 硬 質 な 非 孔
質のガラスと比較して，卵殻表面は気孔などの細孔を有していることから，
噴霧粒子が一般生菌に接触しにくい構造であるためと考えられる。また，本
試験で用いた鶏卵は有機物が付着していない物を使用したが，実際の種卵は
卵殻表面に土や糞などの有機物が付着していることが想定されることから，
実 試 験 に お い て は ， 濃 度 時 間 積 6.0 mg/m 3 ･h 以 上 で 噴 霧 す る 必 要 が あ る と 考
えられた。
8.3.2
種鶏場における弱酸性次亜塩素酸水の噴霧による種卵消毒効果お
よび孵化率
Table.8-1 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 噴 霧 お よ び 対 照 と し て ホ ル マ リ ン 燻
蒸した場合の種卵の除菌率および孵化率を示す。処理前の種卵表面の一般生
菌 数 は 卵 1 個 あ た り 1 .0×10 3 ～ 2.7×10 5 CF U で あ っ た 。 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水
溶液噴霧およびホルマリン燻蒸を行った場合の卵殻表面の除菌率は，各々平
均 99.83 %， 99.73 % ， 標 準 偏 差 は 各 々 0.1 %， 0.27 % で ， ほ ぼ 同 等 で あ っ た 。
対 熟 孵 化 率 （ 孵 化 数 ／ (全 種 卵 数 － 無 精 卵 数 ） ×100 ） は 弱 酸 瀬 次 亜 塩 素 酸 水
溶 液 噴 霧 お よ び ホ ル マ リ ン 燻 蒸 を 行 っ た 場 合 ， 各 々 95. 0 %， 9 2.6 %で あ り ，
同等の孵化率を示した。また，標準偏差は弱酸性次亜塩素酸水溶液噴霧およ
び ホ ル マ リ ン 燻 蒸 が 各 々 1.0 %， 4. 2 %で あ り ， 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 噴
霧した系はばらつきが小さい傾向が認められた。
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以 上 の 結 果 よ り ，濃 度 時 間 積 7.1 m g/m 3 ･1 .5h の 条 件 で 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水
溶液の噴霧は，現行のホルマリン燻蒸とほぼ同等の消毒効果あることが明ら
かとなった。また対熟孵化率についてもホルマリン燻蒸と同等であり，弱酸
性次亜塩素酸水溶液噴霧による種卵に対する悪影響は認められなかった。対
熟孵化率は一般的に貯卵日数が長くなると低下する傾向が見られるが
138)
，
貯卵日数の違いによる対熟孵化率の違いも見られず，安定した孵化率が得ら
れている。
一方，実用化に当たっての課題として，弱酸性次亜塩素酸水溶液は噴霧粒
子が水滴状態の場合に殺菌効果があることより，種卵の配置やトレイの形状
および攪拌方法などにより，消毒効果にばらつきが生じる可能性がある。殺
菌 の ば ら つ き を 現 場 で 簡 易 に 判 定 す る た め ， Pic.8-2 に 示 す 模 擬 鶏 卵 表 面 に
ヨウ化カリウムでんぷん溶液を付着乾燥させた殺菌インジケーターを考案し，
これをトレイの各場所に設置した。噴霧粒子が接触した箇所は無色から紫色
に変色するため，表面の色の変化によって噴霧粒子の到達の程度を確認でき
るため，噴霧粒子を全体に効率よく接触させる噴霧条件および撹拌方法の確
認が可能となった。
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ま た ，種 卵 表 面 が 糞 や 泥 な ど で 汚 染 さ れ て い た 場 合 は 噴 霧 粒 子 が 接 触 せ ず ，
また接触しても有機物によって速やかに有効塩素が失活し十分な消毒効果が
得られない可能性があるため，泥や糞などで汚染された汚卵は種卵として用
いないことが必要である。
8.4
まとめ
鶏の種卵消毒に，ホルマリン燻蒸の代替法として弱酸性次亜塩素酸水溶液
の噴霧を検討した結果，卵殻表面の殺菌効果および対熟孵化率は現行のホル
マリン燻蒸と同等の効果を得ることができた。したがって，弱酸性次亜塩素
酸水溶液は新たな種卵消毒法として有用性が高いことが示唆された。
第 9章
総括
本研究では，食品および畜産分野で弱酸性次亜塩素酸水溶液の適用を目的
とし，その基礎的検討および実使用条件での効果検証を行った。弱酸性次亜
塩 素 酸 水 溶 液 は ， 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム に 塩 酸 を 希 釈 混 合 し て ， pH を 5.5 ～
6.5 の 弱 酸 性 に 調 製 し た も の で あ る 。 弱 酸 性 に 調 整 す る こ と に よ り ， 水 中 の
分 子 形 の 次 亜 塩 素 酸 ( HClO)の 割 合 を 増 加 さ せ ， 殺 菌 効 果 の 向 上 を 期 待 し た 。
また，生体や環境に対する安全性が高いことも確認されていることから，食
品，畜産分野での適用に適している。
第 3 章 で は ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 基 礎 的 な 殺 菌 効 果 を 確 認 す る た め ，
各種微生物の標準株および臨床分離株に対する殺菌，殺カビおよびウイルス
不 活 化 効 果 の 検 討 を 行 っ た 。ま た ，pH を 調 整 し た こ と に よ る 殺 菌 効 果 の 増 強
を 確 認 す る た め ，各 p H に お け る 殺 菌 効 果 の 違 い に つ い て も 検 討 し た 。そ の 結
果 ，有 効 塩 素 濃 度 50 p pm の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は 本 試 験 で 供 し た す べ て
の 標 準 株 の 細 菌 ，カ ビ お よ び ウ イ ル ス を 15 秒 ～ 600 秒 で 検 出 限 界 以 下 と す る
高い殺菌・不活化効果が認められた。また本試験で用いた臨床分離株はすべ
て 15 秒 以 内 に 殺 菌 が 可 能 で あ っ た 。さ ら に ， B.subtilis ,
B.cereus お よ び
A.niger で は ， 弱 酸 性 域 で あ る pH 5 ， 6 の 条 件 で 殺 菌 に 要 す る 時 間 が 短 く ，
水中の次亜塩素酸の存在比が多いほど最短殺菌時間は短くなり，その決定係
数 (r 2 )は 0 .95～ 0.99 と 高 い 相 関 が 認 め ら れ た 。こ れ に よ り 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ
ウムを弱酸性に調整することにより殺菌・ウイルス不活化効果が向上するこ
とが確認された。
第 4 章では，弱酸性次亜塩素酸水溶液の殺菌効果をさらに詳細に検証する
ため，微生物の中でも特に消毒剤耐性が強い芽胞菌での検証を行った。院内
感 染 お よ び 食 中 毒 の 原 因 菌 で あ る B.cereus， 耐 熱 性 好 酸 性 菌 ( TAB)の 一 種 で
果 汁 飲 料 の 変 敗 の 原 因 と な る A.acidoterrestris お よ び 院 内 感 染 菌 で あ り 偽
膜 性 大 腸 炎 の 原 因 菌 で あ る C.diffcile を 用 い て 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の
有効な接触時間および有効塩素濃度の探索を行った。また，実際の使用現場
を想定し，各芽胞をステンレス鋼，プラスチックおよび布などの各種部材に
付着させた場合の殺菌効果についても検討した。その結果，本試験で用いた
3 種の芽胞菌に対して弱酸性次亜塩素酸水溶液は高い殺菌効果を示し，特に
B.cereus お よ び C.diffcile は A.acidoterrestris と 比 較 し て 短 時 間 で 殺 菌
が 可 能 で あ っ た 。ま た ，芽 胞 菌 に 対 す る 対 数 生 残 率（ S）は 有 効 塩 素 濃 度 (ppm)
と 時 間 (min)の 積 に 対 数 近 似 し た 。ま た ，濃 度 時 間 積 (CT 値 )は pH が 弱 酸 性 域
で低い値となり，弱酸性域では殺菌効果が向上することが確認された。この
傾向はポリエチレン，ステンレス鋼および布に芽胞を付着させた場合にも同
様であった。これにより，弱酸性次亜塩素酸水溶液は食品および医療等の現
場において食中毒や院内感染の原因となる芽胞菌に対して有効性の高い殺菌
資材であることが示された。
第 5 章では
実際に弱酸性次亜塩素酸水溶液を食品分野で使用することを
想定し，カット野菜工場での生野菜の殺菌効果について検討を行った。本章
では特に，カット野菜の材料として，殺菌が特に困難なキュウリおよびアオ
ネギの洗浄殺菌について検討した。弱酸性次亜塩素酸水溶液で洗浄殺菌する
ことによりキュウリおよびアオネギの一般生菌数は有意に減少し，1 桁程度
の低下が認められた。さらに，殺菌効果を増大させるため，食品用の界面活
性剤の添加を検討した。まず，界面活性剤 2 種を添加した場合の弱酸性次亜
塩素酸水溶液の液性の変化を確認したところ，表面張力が低下して濡れ性の
向 上 が 確 認 で き た 。ま た ，添 加 後 2 4 時 間 は 有 効 塩 素 濃 度 お よ び pH の 変 化 は
認められず，安定性も高いことがわかった。界面活性剤添加弱酸性次亜塩素
酸 水 溶 液 は 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 単 独 よ り も 1～ 2 桁 高 い 殺 菌 効 果 が 得 ら れ ，一
般生菌数は有意に低下した。これにより，弱酸性次亜塩素酸水溶液はカット
野菜製造工程において有用性が高く，界面活性剤を添加することでさらに高
い殺菌効果が得られることが明らかとなった。
第 6 章では弱酸性次亜塩素酸水溶液を漬物製造ラインに適用することを目
的とし，実際の食品用洗浄機での洗浄条件と同条件でハクサイの殺菌試験を
行 い ， 漬 物 衛 生 規 範 の 殺 菌 条 件 (次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 100 pp m で 10 分 ま た
は 200 ppm で 5 分 )で の 殺 菌 効 果 と の 比 較 を 行 っ た 。ま た ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸
水溶液で食材を洗浄殺菌した場合のトリハロメタン類の発生および食品への
残存を確認するため，トリハロメタンの一種であるクロロホルム量の測定も
行った。弱酸性次亜塩素酸水溶液でハクサイを撹拌洗浄することによって，
20 秒 間 と い う 短 時 間 で 一 般 生 菌 数 を 5.6 l ogCFU/g か ら 3.7 log CFU/g ま で 減
少 さ せ る こ と が で き ， そ の 効 果 は 200 pp m の 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム で 洗 浄 殺
菌 し た 場 合 と 同 等 で あ っ た 。ま た ，漬 物 衛 生 規 範 に 推 奨 さ れ た 方 法 (次 亜 塩 素
酸 ナ ト リ ウ ム 100 ppm 10 分 浸 漬 ま た は 200 ppm 5 分 浸 漬 )と も 同 等 の 殺 菌 効
果 を 得 る こ と が で き た 。ま た 洗 浄 後 に ハ ク サ イ に 残 存 す る ク ロ ロ ホ ル ム 量 も ，
次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム を 用 い た 場 合 の 約 2 2 %で あ り ， 水 道 水 で 洗 浄 し た 場 合
とほぼ同等であった。よって弱酸性次亜塩素酸水溶液は，ハクサイの洗浄殺
菌において作業効率を高め，かつ有害な消毒副生成物の生成も抑えることが
明らかとなり，有用性が高いことが示された。
第 7 章では，畜産分野での適用の一例として，ブロイラー種鶏の飲水へ弱
酸性次亜塩素酸水溶液を利用した場合の飲水の殺菌効果および鶏に対する生
産 性 お よ び 安 全 性 へ の 影 響 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。飲 水 消 毒 に 50 ppm 弱 酸 性
次亜塩素酸水溶液を用いた場合，給水システム中の残留塩素濃度は，徐々に
低下する傾向にあった。しかし，給水器内の菌数を測定したところ，特に大
腸菌群数およびサルモネラ属菌などグラム陰性菌を検出限界以下となってお
り，給水器内まで高い殺菌効果を維持していた。生産性について育成率およ
び 生 存 率 な ら び に 産 卵 率 で 評 価 し た と こ ろ ，餌 付 け 直 後 の 育 成 率 が 向 上 し た 。
生存率ならびに産卵率については有意な差は認められなかった。鶏への安全
性について，臓器重量，血液性状および組織学的検査を行ったところ，弱酸
性次亜塩素酸水溶液の飲水による悪影響は認められなかった。以上の結果よ
り，弱酸性次亜塩素酸水溶液は飲水資材として利用が可能であることが明ら
かとなった。特に，感染症に対する抵抗性の弱い育雛期や感染症が発生する
時期など，期間を限定して飲水を行うことで効率よく生産性の向上および感
染症の抑制ができると考えられる。
第 8 章では，同じく畜産分野での適用の一例として，ブロイラー種鶏の種
卵 (受 精 卵 )消 毒 に 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 の 適 用 を 検 討 し た 。 弱 酸 性
次亜塩素酸水溶液の噴霧により種卵消毒を行った場合の卵殻表面の殺菌効果
および孵化率について検討を行い，現行のホルマリン燻蒸法との比較を行っ
た 。 そ の 結 果 ， 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 に よ る 除 菌 率 は 99.85 %と な
り ， ホ ル マ リ ン 燻 蒸 で の 除 菌 率 99 .75 % と 同 等 で あ っ た 。 除 菌 率 の ば ら つ き
は弱酸性次亜塩素酸水溶液噴霧のほうが小さく安定した除菌率が得られた。
孵 化 率 も 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 噴 霧 お よ び ホ ル マ リ ン 燻 蒸 で 各 々 94.6 % ，
92.9 %と 同 等 の 孵 化 率 が 維 持 で き た 。 こ れ ら の 結 果 よ り 種 卵 消 毒 に お い て 弱
酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧はホルマリン燻蒸の代替法として利用性が高い
ことが示された。
以 上 の 結 果 よ り ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 は 食 品 及 び 畜 産 の 分 野 に お い て ，
有用性が高いことが示された。今後の課題としては，現場で使用した場合の
腐食性や薬剤コスト，作業者の簡便性などをさらに向上させる必要があると
考えられる。より簡便かつ効率的に弱酸性次亜塩素酸水溶液を活用する方法
およびシステムの構築を進めていく所存である。
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辞
本 研 究 を 行 う に あ た り ,終 始 懇 切 な る ご 指 導 並 び に ご 鞭 撻 を た ま わ り ま し
た 島 根 大 学 生 物 資 源 科 学 部 教 授 ,佐 藤 利 夫 博 士 に 深 く 感 謝 い た し ま す 。
同 じ く ご 校 閲 の 労 を と っ て い た だ き ,有 益 な ご 助 言 を 賜 り ま し た 三 重 大 学
生 物 資 源 学 部 教 授 ,福 崎 智 司 博 士 ,鳥 取 大 学 農 学 部 教 授 ,猪 迫 耕 二 博 士 ,島 根 大
学 生 物 資 源 科 学 部 教 授 ,一 戸 俊 義 博 士 ,島 根 大 学 生 物 資 源 科 学 部 准 教 授 ,桑 原
智之博士に心よりお礼申し上げます。
株 式 会 社 エ イ チ ・ エ ス ・ ピ ー 取 締 役 開 発 部 長 ,山 下 光 治 氏 は , 筆 者 の 入 社 し
た 時 か ら の 上 司 で あ り ,研 究 全 般 お よ び 論 文 取 り ま と め に お い て ,懇 切 丁 寧 な
ご指導を賜りましたことを深く感謝いたします。また, 研究に協力して頂い
た 同 社 研 究 開 発 部 ,濱 本 裕 司 氏 ,安 田 悠 人 氏 ,三 宅 真 名 氏 ( 現 ㈱ め ん 楽 ),安 本 良
氏 (現 旭 化 成 ケ ミ カ ル ズ ㈱ )に は ,心 よ り 感 謝 い た し ま す 。
養 鶏 場 で の 飲 水 試 験 お よ び 種 卵 消 毒 の 試 験 の 際 に は ,㈱ 福 田 種 鶏 場 の 中 山
英 治 氏 ,藤 井 秀 家 氏 に , 試 験 場 の 提 供 お よ び 試 験 へ の 多 大 な る 協 力 を 頂 き ま
し た 。 佐 藤 勝 紀 博 士 ( 元 岡 山 大 学 農 学 部 ), 内 藤 一 郎 博 士 ( 岡 山 大 学 医 学 部 客 員
研 究 員 )に は 生 理 学 お よ び 組 織 学 的 見 地 か ら 試 験 協 力 お よ び 多 大 な る ご 指 導
並びにご鞭撻を賜りました。心より感謝いたします。
島 根 大 学 生 物 資 源 科 学 部 の 村 山 智 美 氏 ( 現 中 国 環 境 ㈱ ) お よ び Thinh Minh
Hong 氏 に は 殺 菌 の 基 礎 試 験 に お い て 試 験 協 力 お よ び デ ー タ 解 析 等 を し て 頂
きました。心より感謝いたします。
ま た ,研 究 の 遂 行 お よ び 論 文 執 筆 を 暖 か く 見 守 り ,応 援 し て 頂 い た 増 田 礎 氏
（㈱エイチ・エス・ピー代表取締役会長）をはじめとする株式会社エイチ・
エス・ピー社員の皆さんにも心より感謝いたします。
最 後 に ,私 の 研 究 生 活 を 応 援 し ,支 え て く れ た 先 輩 方 ,友 人 ,知 人 の 皆 様 ,そ
して私の家族に心から感謝いたします。
本 論 文 が 完 成 し た の も ,こ れ ら の 方 々 の ご 指 導 な ら び に ご 協 力 の 賜 物 で す 。
以 上 の 方 々 に ,心 よ り お 礼 を 申 し 上 げ ま す 。
Summary
We investigated the microbicidal effec t of weak acid hypochlorous
solution
(WAHS)
ag ainst
several
micr oorganisms
in vitro and its
disinfection effect in the fields of anim al husbandry a nd food production.
WAHS was prepa red by mixing NaClO and HC l in water, wi th the pH adjusted
to 5.5−6.5.
It is known that a f orm of chlorine can be changed to undi ssociated
hypochlorous acid (H ClO) by cont rolling the pH value s of a s o lution, and
that HClO is a more effective disinfec ta nt than ClO − . HClO ca n penetrate
the lipid bilaye r of the pl asma me mbrane faster than C lO − , b ecause bot h
ClO − and bacte rial s urfaces ar e negat ive ly charged . Moreo ver , HClO c an
attack the mic robial cell both extr acellu larly and intr acellu larly. This
leads to an enhanced bactericidal effect of HOCl as compared with that
of ClO − .
We confirmed t he saf ety of WAHS fo r conta ct with both o f the h uman body
and environ ment. Mo reover WAHS can be u sed as a n addit ive f or washing
foods and it i s appr opriate for us e in t he field of an imal h usbandry and
food producti on.
We investigated the microbicidal effec t of WAHS against bacteria,
viruses and fu ngi. In this test, we used 57 bacterial str ains (1 0 standard
strains and 47 clin ical isolates), t wo standard fungal st rains, and a
standard v iral strai n. Using WAHS with 5 0ppm of the availabl e chlorine ,
all the strai ns wer e killed with a con tact time of 10 to 3,600 s.
Bacillus subtilis , B. cereus a nd Aspergillus niger had a hig her
resistance to WAH S c ompared with that o f other bacteria and fungi. WAHS
was capable of killi ng these strains wit hin a short time at pH 5 and 6
than at pH 8. This i ndicated t hat th e ba ctericidal effects of WAHS are
higher und er we ak ac idic pH conditi ons, and the microbi cidal effects of
WAHS did not depend on the concentration of the available chlorine but
instead on th at of HClO.
We found that bact er ial spores had a hig h level of resista nc e against
WAHS.
The
bact eric idal
effects
of
W AHS
against
th ree
species
of
spore–forming bacte ria ( B. cereus , Alicyclobacillus acidoterrestris,
and
Clostridium difficile ) were inv estigated. These ba cteria are
known to be ha rmful i n the medical and foo d industries. We prep ared 10−200
ppm hypochlor ous so lutions, with the p H adjusted to 6−9. Further, we
facilitated a con ta ct of hypochlorou s solutions with th e spores and
measured the time -d ependent change i n the viable count of bacteria.
In addition , we eva luated the bacteri c idal effect s again s t the spo res
attached to p olyeth ylene, stainl ess st eel, and cott on fab ric.
The bacter icidal ef fect of WAHS of pH 6 was mo re eff ective than that
of pH 9. The l og sur vival rates a gainst spores were l og appr oximated by
the product of t he a vailable ch lorine c oncentration (ppm) and contact
time (min). CT value s for the solu tion o f pH 9 were 4. 1–8.1 t imes higher
compared w ith tho se of pH 6. These tenden cies were similar fo r the sp ores
attached to t he thr ee different materi als.
We considered app lyi ng the WAHS in the fi eld of food product i on. Major
concerns in th is fiel d include the degrada tion and deter iorati on of foods
and the outbreak of food poisoning with Norovirus and Escherichia coli
O157. Ther efore, it is very importa nt to control microo rgani sms in food
production. We evalu ated the use of WAHS in freshly cut vegetables and
a pickle prod uction line that do not u se heating du ring p rocessing.
We first evaluate d t he freshly cut vege t ables such as green long onion
and cucumb er. Th e t otal viabl e coun t o f
bact eria o n the surface of
green long onion an d cucumber was sign ificantly reduc ed f rom 5.4, 4.9
log CFU/g to 3 .8, 4 .1 log C FU/g b y was hing with WAHS (pH 6, 100ppm of
the
avail able
chlorine).
T wo
ty pes
of
noni onic
surfactant,
polyglycerol esters of fatty acids and a washing ag ent wi th su crose fatt y
acid esters, were a dded to WAHS (P-WAH S and S-WAHS, respe ctively) to
allow the contact o f bacteria on t he su rface of vegetabl es with WA HS.
P-WAHS and S -WAHS re mained uncha nged in term of pH a nd the c o ncentration
of free residual chlo rine for 24 h ours, a n d decrease d the surfa ce tension .
P-WAHS and S-WAHS de creased the viable c ount of bacteria by 1–2 orders
of magnitud e, as co mpared with that by WAHS.
The bacteric idal effect
of P-WAHS and S-WA HS were significant ly higher than tha t of WAHS.
Therefore, we s ugges t that this can be an effective disi nfect ion method
for the proce ssing shredded vege tables .
Furthermore, we tri e d to disin fect the Ch inese cabba ges on th e washing
line in pickl e manu facturing pla nts un der the same condit ions. The
purpose of th is stu dy was to try to qu ickly disinfe ctant the Chinese
cabbages used in pi ckles product ion by applying WAH S. The Chinese
cabbages were mixed w ith WAHS for 2 0 s, wi th an eradicat ion rat e of 98.6%.
The disinfectio n ef fect was equivale nt to the effects of t he accepted
code of hygienic pr a ctice for pickled v e getables (NaClO , 100 ppm for 10
min or 200 ppm for 5 min). The chlo roform production by the s ample after
treating with WAHS w as less than that wi th NaClO, and equiva lent to that
with tap water. The r efore, we suggest t h at WAHS is suitable for washing
the Chinese c abbage s in the proc ess of pickles prod uction .
Finally, we i nvestig ated the use o f WAHS on poultry fa rms in order to
evaluate the effect iveness of WA HS in the field of animal husbandry.
Antibiotics ar e rout inely used for di sea se prophylaxis i n po ultry farms,
and it is b ecoming i ncreasingly import a nt to control microo rganisms by
hygiene cont rol in t he farm to p revent d i seases such as avian influenza.
There has rec ently, been an incr eased focus on the disinf ection of
drinking water i n poultry farms to p revent a spread o f diseases.
Therefore, we ev alua ted the bacteric idal effect and produ cti vity of WAHS
in drinkin g wate r and the sa fety o f chick e ns. Broile r chic ks we re divided
equally into two gro ups, from 1–64 week s of age: the experim ental group
was given 50 ppm WA H S and the control g r oup was given tap w a ter. In the
experimental group, an adequate amount o f chlorine w as kept i n the water
supply bell s, fro m where the hens dran k water. The nu mber of bacteria
and fungi were evalua ted at three differen t points along the w a ter supply
system. Salmonella spp. and coliform bac teria were not detec ted at any
point in the w ater s upply, and a s mall n umber of other types of bacteria
and fungi wer e found , which were c ompara ble with thos e found in the tap
water supply. The vi ability of the exper imental group was si gnificantly
higher than t hat of the control g roup at 24 weeks of f eeding . There was
no significa nt diff e rence in t he egg-l ay ing rate b etween t he two groups,
and we could not ob serve any adv erse e ffects on org an wei ghts, blood
properties, or histo logical e xaminatio ns througho ut th e st ud y period in
either of the two gr oups.
Theref ore we suggest that WAHS is effective
in improving the r ate of chick matur ation and preventin g bacterial
spread.
Next, we investigat ed the viability o f spraying WAHS mi st as an
alternative t o forma ldehyde fumig ations in order to di sinfec t hatching
eggs. We sprayed WA HS mist in an experi mental boot h, and i t contacted
both the surfa ce of a glass Petri dish a nd egg shells. The s urvival rate
of Staphylococcus aureus on the su rfac e of the glass Petri dishes and
of bacteria o n the s urface of egg shells were both red uced t o <1％ with
WAHS mist.
In a pr actical tri al, 168 – 1848 hatchi ng eggs were spraye d
with WAHS mist for of 7.1 mg/m 3 for 1.5 h. The effects of d isinf e c t i o n
on the surfac e of e gg shells and on th e hatching of ferti le eggs were
approximately
e qual
to
those
treated
by
formaldehyde
fumigation.
Moreover, we sugges t that sprayi ng WA H S is a vi able opti on for the
disinfection
of
ha tching
eggs
as
an
alternative
to
f ormaldehyde
fumigations.
We found that WAHS had a high disinfec tion effect and was useful in
both the fields of a nimal husbandry a nd food production . In the future,
we would like to continue to promote the development and val idation of
a disinfectio n metho d according to the ch aracteristics of WAH S in several
fields.
摘
要
本研究では，食品および畜産分野で弱酸性次亜塩素酸水溶液の適用を目的
とし，その基礎的検討および実使用条件での効果検証を行った。弱酸性次亜
塩 素 酸 水 溶 液 は ，次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム を 水 道 水 で 希 釈 し ，塩 酸 で pH を 5 .5
～ 6.5 の 弱 酸 性 に 調 製 し た も の で あ る 。 弱 酸 性 に 調 整 す る こ と に よ り ， 水 中
の 塩 素 の 形 態 が イ オ ン 型 の 次 亜 塩 素 酸 イ オ ン (OCl - ) か ら 分 子 形 の 次 亜 塩 素 酸
(HClO)に 変 化 す る 。 細 菌 の 形 質 膜 は イ オ ン や 低 分 子 量 分 子 の 透 過 を 妨 げ る た
め , 荷 電 を 持 つ 次 亜 塩 素 酸 イ オ ン (OCl - ) よ り も 荷 電 を 持 た な い 次 亜 塩 素 酸
(HClO) の ほ う が 細 菌 の 形 質 膜 に 対 す る 透 過 性 が 高 い 。 ゆ え に 次 亜 塩 素 酸
(HClO)は 受 動 拡 散 に よ っ て 微 生 物 の 細 胞 壁 と 形 質 膜 を 速 や か に 通 過 し ， 菌 体
の内部と外部の両面から酸化作用を与え，殺菌効果および速度が増大すると
いわれている。また，弱酸性次亜塩素酸水溶液は人体や環境に対する安全性
が高いことも確認されており，食品添加物としても使用できることから，食
品および畜産分野での適用に適している。
ま ず ，弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 基 礎 的 な 殺 菌 効 果 を 確 認 す る た め ，細 菌 ，
カビ，ウイルスの各種標準株および臨床分離株に対する殺菌，殺カビおよび
ウ イ ル ス 不 活 化 効 果 の 検 討 を 行 っ た 。そ の 結 果 ，有 効 塩 素 濃 度 50 ppm の 弱 酸
性次亜塩素酸水溶液は本試験で供したすべての標準株の細菌，カビおよびウ
イ ル ス を 15 秒 ～ 600 秒 で 検 出 限 界 以 下 と す る 高 い 殺 菌・不 活 化 効 果 が 認 め ら
れ た 。 B.subtilis ,
B.cereus お よ び A.niger は 有 効 塩 素 に 対 し て 抵 抗 性 が
高 か っ た が ， p H 5.0 ， 6.0 の 弱 酸 性 域 の 条 件 で 殺 菌 に 要 す る 時 間 が 短 縮 さ れ
た。
次に，有効塩素に対して高い抵抗性が認められた芽胞菌のうち，医療や食
品 分 野 で 問 題 と な っ て い る B.cereus， A.acidoterrestris お よ び C.diffcile
を 用 い て さ ら に 詳 細 に 検 討 を 行 っ た 。 有 効 塩 素 濃 度 10 ～ 200 p pm， pH 6 お よ
び 9 の 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 調 整 し て 各 種 芽 胞 液 に 接 触 さ せ ，そ の 生 菌 数 の 経
時的変化を測定した。また，芽胞をステンレス鋼，プラスチックおよび布な
ど の 各 種 部 材 に 付 着 さ せ た 場 合 の 殺 菌 効 果 に つ い て も 検 討 し た 。 pH 6 の 次 亜
塩 素 酸 水 溶 液 は pH 9 の 場 合 と 比 較 し て ，短 時 間 で 殺 菌 が 可 能 で あ っ た 。ま た ，
芽 胞 菌 に 対 す る 対 数 生 残 率（ S）は 有 効 塩 素 濃 度 (ppm)と 時 間 (m in)の 積 で あ る
濃 度 時 間 積 に 対 数 近 似 し ， そ の 値 は は pH が 弱 酸 性 域 で 低 い 値 と な っ た 。 こ
の傾向はポリエチレン，ステンレス鋼および布に付着した芽胞でも同様であ
った。
次に弱酸性次亜塩素酸水溶液の食品分野への適用について検討を行なった。
食品分野はノロウイルスや病原性大腸菌などによる集団食中毒や，食品の品
変敗および質劣化などの観点から，製造時における微生物管理が大きな課題
となっている。本研究では特に，製造中に加熱工程を持たないカット野菜や
漬物製造ラインでの弱酸性次亜塩素酸水溶液の使用を目指し，検討を行なっ
た。
まず，カット野菜の材料として，殺菌が困難なキュウリおよびアオネギを
用 い た 。 有 効 塩 素 濃 度 100 ppm の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 で 洗 浄 す る こ と に
よ っ て キ ュ ウ リ お よ び ア オ ネ ギ の 一 般 生 菌 数 は 5.4，4. 9 logCF U/g か ら 3.8，
4.1 logCFU/g に 有 意 に 減 少 し た 。 さ ら に 殺 菌 効 果 を 増 大 さ せ る 試 み と し て ，
界面活性剤の添加も検討した。弱酸性次亜塩素酸水溶液に 2 種の非イオン型
界 面 活 性 剤 を 添 加 し た と こ ろ ， pH お よ び 有 効 塩 素 濃 度 を 24 時 間 維 持 す る こ
とができ，表面張力の低下が確認された。また，殺菌効果も弱酸性次亜塩素
酸 水 溶 液 単 独 よ り も 1 ～ 2 桁 減 少 さ せ る こ と が で き ，殺 菌 が 困 難 な 野 菜 に 対 す
る殺菌方法として有用性が高いことが示された。
さらに，実際の漬物製造工場での適用を想定し，食品用洗浄機での殺菌条
件 に 即 し ， 漬 物 の 原 料 と な る ハ ク サ イ の 殺 菌 を 試 み た 。 50 pp m の 弱 酸 性 次 亜
塩 素 酸 水 溶 液 で 20 秒 間 撹 拌 洗 浄 を 行 な っ た 場 合 ， 漬 物 衛 生 規 範 の 殺 菌 条 件
(次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム 100 ppm で 1 0 分 ま た は 200 ppm で 5 分 ) で の 殺 菌 条 件
と同等の殺菌効果が得られた。また，発がん性物質として問題となるトリハ
ロメタンの一種であるクロロホルムの生成量は水道水と同程度であった。
最後に畜産分野への適用を目指し，養鶏場での弱酸性次亜塩素酸水溶液の
使用について検討を行った。養鶏分野では，農場の衛生管理を徹底すること
で鳥インフルエンザをはじめとする疾病の抑制を行い，かつ鶏肉および鶏卵
の食品としての微生物学的安全性を確保することが求められている。
まず，ブロイラー種鶏への飲水へ弱酸性次亜塩素酸水溶液を利用した場合
の，飲水の殺菌効果および鶏に対する生産性および安全性への影響について
水 道 水 と 比 較 し て 評 価 し た 。飲 水 殺 菌 に 5 0 ppm 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 を 用
いた場合，給水ライン中の残留塩素濃度は，徐々に低下するものの，給水器
内 で も 総 塩 素 濃 度 14. 6 ppm を 維 持 し て い た 。飲 水 中 の 生 菌 数 を 測 定 し た と こ
ろ，特に大腸菌群数およびサルモネラ属菌などグラム陰性菌を検出限界以下
となっており，水道水と比較して菌数を抑制できた。生産成績については，
餌 付 け 初 期 の 育 成 率 を 0.8 ％ 向 上 し た 。ま た ，飲 水 期 間 を 通 し て ，鶏 の 臓 器
重量，血液性状および組織学的検査において悪影響は認められなかった。
ブ ロ イ ラ ー 種 鶏 の 種 卵 (受 精 卵 ) 消 毒 へ の 弱 酸 性 次 亜 塩 素 酸 水 溶 液 の 噴 霧 の
適用を検討し，現行のホルマリン燻蒸法との比較を行った。弱酸性次亜塩素
酸水溶液の噴霧により種卵消毒を行った場合の卵殻表面の殺菌効果および孵
化率について検討を行った。弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧による除菌率は
99.85 %と な り ， ホ ル マ リ ン 燻 蒸 で の 除 菌 率 99.75 %と 同 等 で あ っ た 。 除 菌 率
のばらつきは弱酸性次亜塩素酸水溶液噴霧のほうが小さく安定した除菌率が
得られた。孵化率も弱酸性次亜塩素酸水溶液噴霧およびホルマリン燻蒸で
各 々 94.6 %， 9 2.9 % と 同 等 の 孵 化 率 で あ っ た 。 こ れ ら の 結 果 よ り 種 卵 消 毒 に
おいても弱酸性次亜塩素酸水溶液はホルマリン燻蒸の代替法として利用性が
高いことが示された。
本研究により，弱酸性次亜塩素酸水溶液は食品及び畜産の分野において，
衛生管理をする上で有用性が高いことが示された。今後は様々な分野におい
て弱酸性次亜塩素酸水溶液の持つ特性に応じた殺菌方法の開発およびその検
証を進めていきたい。
学位論文の基礎となる学術論文
1.
非イオン界面活性剤を添加した弱酸性次亜塩素酸水の野菜に対する殺菌
効果
小野朋子,
防菌防黴
三宅真名,
山下光治
200 5 年 6 月
第 33 巻
第 6号
pp.257-262
【第 5 章】
2.
弱酸性次亜塩素酸水の噴霧による種卵消毒に関する研究
小野朋子,
防菌防黴
三宅真名,
山下光治
200 6 年 8 月
第 34 巻
第 8号
pp.465-469
【第 8 章】
3.
弱酸性次亜塩素酸水を飲水消毒に用いた場合の殺菌効果およびブロイラ
ー育成率と産卵率への影響
小野朋子,
一郎,
三宅真名,
安本良,
山下光治,
藤井秀家,
佐藤勝紀
日本家禽学会誌
200 7 年 11 月
第 44 巻
第 4号
J148- J153
【第 7 章】
4.
中山英治,
弱酸性次亜塩素酸水溶液の各種芽胞に対する殺菌効果
小野朋子,
防菌防黴
【第 4 章】
山下光治,
佐藤利夫
201 0 年 8 月
第 38 巻
第 8号
pp.509-514
内藤
5.
Microbic idal E ffect of Weak Acid H ypochlorous S olutio n on Various
Microorganism s
Tomoko Ono, K oji Ya mashita, Tomo mi Mur ayama, Toshio Sato
Biocontrol Sc ience
2012.9
V ol.17
No.3
p.129 -133
【第 3 章】
6.
弱酸性次亜塩素酸水溶液の白菜殺菌への適用
小野朋子,
山下光治,
防菌防黴学会誌
【第 6 章】
佐藤利夫
201 4 年 8 月
第 42 巻
第 6号
pp.28 9-293
参考論文
1.
非イオン界面活性剤添加弱酸性次亜塩素酸水溶液の噴霧によるニワトリ
種卵表面の消毒効果
小野朋子,
防菌防黴
三宅真名,
山下光治
200 6 年 9 月
第 34 巻
第 9号
pp.537-542

オキシダント濃度の経年変化（昼間の日最高 1時間値の年平均

技術提案の概要;pdf

グリシナール - 協和化学工業株式会社

転換畑における大豆のマンガン欠乏症について

漬物製造管理士・技能評価試験テキスト（1級・2級・3級）訂正点 謹んで ...

消防署への設置事例

食材の残留農薬分析情報 H27-第 2 号

放射光蛍光X線法による単一流体包有物の化学分析 -熱水鉱床研究への

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