［主な研究成果名］標的遺伝子をピンポイントに改変する普遍的な技術を

技術開発
［主な研究成果名］標的遺伝子をピンポイントに改変する普遍的な技術をイネで確立
［要　約］標的遺伝子のピンポイント改変を普遍的に行える技術を、高等植物で初めて確立し
た。ポジティブ・ネガティブ選抜法を利用したジーンターゲッティングの後に、動
く遺伝子（piggyBac トランスポゾン）を利用した足跡を残さないマーカー除去を行
うことで可能になった。
［キーワード］イネ、ジーンターゲッティング、piggyBac トランスポゾン
［担　当］生物研　農業生物先端ゲノム研究センター　ゲノム機能改変研究ユニット
［連　絡　先］029-838-8450
［背景・ねらい］
イネの遺伝子を改変した遺伝子に置き換える手法としては、ジーンターゲッティング法が確立して
いる。しかしこれまでは、改変された遺伝子を持つイネから選抜に用いたマーカー遺伝子を完全に除
去する方法がなかった。今回、足跡を残さない昆虫由来の動く遺伝子である「piggyBac（ピギーバック）」
を利用することで、マーカー遺伝子の完全な除去が可能になった。
［成果の内容・特徴］
1．ポジティブ・ネガティブ選抜を利用したジーンターゲッティングにより、アセト乳酸合成酵素（ALS）
遺伝子に除草剤（ビスピリバックナトリウム塩）耐性となるアミノ酸変異（2 点変異）と選抜マーカー
を導入し（図 1A：ステップ 1）、次に、piggyBac の転移によりマーカー遺伝子を除去して ALS 遺伝
子上に 2 点変異のみを残すことを試みた（図 1A：ステップ 2）。
2．イネ（品種：日本晴）のカルスに上記 1 のステップ 1 の処理を行い、ALS 遺伝子に目的の点変異と
選抜マーカー遺伝子が導入されたカルスを選抜した。これらのカルスに対してステップ 2 の処理を
行い、得られた 5 系統 100 個体の再分化植物において完全にマーカーが除去されたかについて検証
した。その結果、100 個体中 99 個体で piggyBac の転移によりマーカーが除去されていることが明
らかとなった（図 1B）。マーカー除去後の ALS 遺伝子の配列を解析したところ、piggyBac は足跡を
残さずに転移し、ジーンターゲッティングにより導入した 2 点変異のみが残されていることが確認
された。
3．上記 2 の再分化個体から得られた次世代の植物について、ALS 遺伝子の転写レベルと除草剤耐性能
を評価した。ALS 遺伝子の転写レベルを、制限酵素処理により野生型 ALS と 2 点変異を持つ改変型
ALS 遺伝子を区別して解析したところ（図 2A）、改変型 ALS 遺伝子座からの転写産物も確認された。
（図 2B）。一方、改変型 ALS 遺伝子を持つ個体は、野生型 ALS 遺伝子を持つ個体に比べて明らかな
除草剤耐性能を有することが示された（図 2C）。
4．ジーンターゲッティングと piggyBac によるマーカー除去により、ALS 遺伝子以外の複数の遺伝子の
ピンポイント改変に成功している。
［成果の活用上の留意点、波及効果、今後の展望等］
1．ALS に 2 点変異を持つ再分化個体から得られた次世代では、piggyBac の転移酵素を発現させるベク
ターを持たない、完全なマーカーフリー個体を得ることができた。この植物は、アミノ酸置換を付
与するための変異以外には余計な配列を含まないことから、突然変異育種で得られた植物と同等と
見なすことができると考えられる。
2．piggyBac は、イネだけでなく様々な植物種で機能すると考えられる。そこで、様々な植物種において、
高効率なポジティブ・ネガティブ選抜を利用したジーンターゲッティング系を確立することで、植
物種を問わず標的遺伝子のピンポイント改変が可能となる。
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［具体的データ］
図 1　ジーンターゲッティングと piggyBac による、マーカー除去を利用した ALS 遺伝子への点変異の導入
（A）実験のストラテジー。ステップ 1：ポジティブ・ネガティブ選抜を利用したジーンターゲッティングに
より、ALS 遺伝子に除草剤耐性を付与する点変異（星印）とポジティブ選抜マーカー（水色の矢印）を導入。
ステップ 2：ジーンターゲッティングが起こったカルスに piggyBac 転移酵素の発現カセットを導入し、
piggyBac の転移によりマーカーを除去。（B）再分化個体におけるマーカー除去効率。
図 2　次世代の解析
（A）ALS 遺伝子の模式図。PCR 産物（プ
ライマー；矢印）を MfeI 処理すること
で、野生型と改変型 ALS 遺伝子の転写
産物を区別した。（B）野生型および改
変型 ALS 遺伝子をヘテロあるいはホモ
で持つ次世代における転写レベルの解
析。（C）除草剤耐性能の評価。
［その他］
研究課題名：ジーンターゲッティングによる有用形質導入システムの開発
中期計画課題コード：1-21
研究期間：2012 ～ 2014 年度
研究担当者：横井彩子、遠藤真咲、大槻並枝、雑賀啓明、土岐精一
発表論文等：
1）Nishizawa-Yokoi A, Endo M, Ohtsuki N, Saika H, Toki S（2015）Precision genome editing in plants via gene
targeting and piggyBac-mediated marker excision The Plant Journal 81（1）：160-168
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