448kHz の電気刺激によって促進されるヒト間葉系幹細胞の増殖

448kHz の電気刺激によって促進されるヒト間葉系幹細胞の増殖
( ELECTRIC STIMULATION AT 448 kHZ PROMOTES PROLIFERATION OF HUMAN MESENCHYMAL STEM CELLS)
HERNÁNDEZ-BULE, PAÍNO CL, TRILLO MA, ÚBEDA A. CELL PHYSIOL BIOCHEM 2014; 34:1741-1755
（承認済み要約。原著論文は http://www.karger.com/Article/FullText/366375 で閲覧可能。）
はじめに
材料および方法
前駆細胞は、組織の再生で重要な役割を果たす。増
殖後、新しい細胞は組織本来の機能を取り戻す。間
葉系幹細胞（MSC）は損傷修復の増殖期に関わる重
要な細胞集団であり、ほぼすべての成体組織に存在
する。
細胞培養
脂肪由来幹細胞は、4名の健康なドナー（年齢65歳、
69歳の男性2名、29歳、35歳の女性2名）の皮下脂肪
サンプルから分離した。第3～8継代のADSCを実験
に使用した。
従来、電気的または電磁気的刺激を利用した理学療
法は、美容医学でも同様に使用され、傷害または変
性組織病変の再生に満足すべき結果を出してきた
(1-7)。
これらの療法のうち、容量性／抵抗性電移法（CRET）
は、400kHz – 450kHzの高周波領域の電流を用いる
非侵襲性の電熱治療である。最近のin vitroの結果は、
温熱性の電流密度で適用したCRETがヒト癌細胞で
細胞傷害性を引き起こし、こうした温熱効果が、標
的とする腫瘍組織への金属微小粒子注入により増
強される(8)ことを示している。細胞レベルでは、
CRETの効果は温熱効果に限定されない。非温熱性
（非加熱）量のCRETの刺激は、培養ヒト腫瘍細胞株
で増殖抑制および細胞傷害反応を誘発しうるが、初
代培養ヒト末梢血単核細胞では誘発しない(9-13)。
これらの実験結果は、CRET医学療法の効果が、温度
上昇のみによるのでなく、電気的刺激自体への直接
的な細胞反応にもよるという従来の根拠を裏付け
るものと解釈することができる。組織の再生に関し
て、CRETセラピーは、現在、リハビリテーションや
スポーツ医学の分野で筋肉、骨、靱帯、腱の損傷の
治療に利用されている(14-16)。CRETによる損傷回
復の促進は、抗炎症プロセス、鎮痛、筋機能回復
(17-20)と共に損傷を受けた領域の拡大の全般的な
縮小に関わっている。
CRET曝露
CRET電流への細胞曝露（図1参照）は、448kHz、
50μA/mm2の非温熱性の電流密度の5分間パルスを4
時間毎に計48時間であった。こうした曝露パラメー
タは、我々のグループの以前の研究(9-13)で細胞増
殖に影響することが検証されている。培養細胞はイ
ンキュベーター中で増殖させ、常にモニターした。
疑似曝露用に、コントロールのペトリ皿に装着した
一対の電極も電流発生装置に接続したが、通電はし
なかった。
図1. 2個の電極間に流れる448kHzの電流へのin vitro 曝露。
電極ギャップ間（曝露／疑似曝露領域で、1065mm2）のペト
リ皿表面の電流密度は均一。拒絶された細胞はペトリ皿から
本研究の目的は、細胞増殖の促進が、非温熱性の電
流密度の CRET に誘発された組織の再生に関わる現
象の一つであるかどうかを、MSC の一種である脂肪
由来幹細胞（ADSC）で調べることである。
かき取り、処理終了後直ちに廃棄した。
間葉系特性評価のための分化アッセイ
採取したADSCの多分化能を評価するために、細胞を
脂肪生成培地、軟骨形成培地または骨形成培地中で
培養した。それぞれの分化培地中での培養15日目に、
ADSCを脂肪、軟骨または骨分化評価のため固定した。
分化評価と同じ手順を、ADSCの多分化能がCRET曝
露の影響を受けるかどうかについての検討に応用
した。
細胞増殖の評価
細胞増殖に対するCRETの効果は、XTT比色アッセイ、
および5-ブロモデオキシウリジン（BrdU）取込みの
免疫蛍光検出によるDNA合成の定量化により確認
した。
細胞周期分析
細胞周期に対する通電の潜在的な効果は、第 3 およ
び 4 継代の培養細胞を使用したフローサイトメトリ
ーで評価した。細胞周期の S および G2 期にある細
胞を評価するために、DNA ポリメラーゼ関連タンパ
ク質マーカーである増殖細胞核抗原（PCNA）(21)
を使用した。
結果
ADSCの脂肪分化、軟骨分化、骨分化
ADSC は、検討した 3 種の細胞系統（脂肪細胞、軟
骨細胞、骨細胞）への明確な分化パターンを示した
（図 2）。
図 3. 増殖アッセイ。
（A）第 2～8 継代の培養細胞中のビスベ
ンズイミド染色細胞核の蛍光顕微鏡による計数。データはそ
れぞれのコントロールサンプルに対して正規化している。
（B）
第 3～7 継代の培養細胞の細胞増殖についての XTT アッセイ。
*0.01 ≤ p ≤ 0.05； **0.001 ≤ p ≤ 0.01；***p < 0.001（スチュー
デントの t テスト）
。
図 2. 脂肪生成培地、軟骨形成培地、骨形成培地を添加した場合（Dif.）
、脂肪組織から分離した細胞は相応する細胞系統へ分化
したが、添加していない場合（ND）
、細胞は未分化のままであった。スケールバー=100μm。
CRET増殖
CRETの効果は培養細胞の継代に依存した。第3～5
継代で通電したADSCは、細胞数の統計的に有意な増
加を示し、第5継代で疑似曝露コントロールに対し
て25%まで増加した（図3A）
。XTT比色アッセイでは、
第3～5継代で通電した培養細胞でコントロールに
対して20%までの細胞数の増加が確認された（図
3B）
。
通電した群のBrdU陽性細胞の割合は、コントロール
に対して38%有意に増加した（p < 0.001）
。
数により裏付けられた。
細胞周期分析
細胞周期に対する CRET の効果については、第 3～5
継代では、S および G2/M 期の細胞の統計的に有意
な増加（コントロールに対してそれぞれ 21%、10%）
を伴い、G0/G1 期の細胞の割合の僅か 3%ではある
が統計的に有意な減少があった（図 4）。これらの
データは、CRET がコントロールに対して統計的に
有意な増加（35%）を誘発した陽性細胞の PCNA 計
図 4.異なる周期における細胞数に対する CRET の効果。
コントロール（100%）に対する率。*0.01 ≤ p ≤ 0.05。
CRET 処理後の ADSC の多分化能
相応する分化培地の存在下での曝露後 2 週間の培養
後、CRET 曝露サンプルの分化パターンにコントロ
ールのものとの有意な違いはなかった（図 5）。
図 5. CRET 処理後の ADSC の多分化能。CRET
または疑似曝露後、第 3～4 継代の培養細胞
を分化培地の存在下で 14 日間増殖させた。
（A）脂肪生成培地（上）
、軟骨形成培地（中）
、
骨形成培地（下）中で維持し、それぞれオイ
ルレッド、アルシアンブルー、アリザリンレ
ッドで染色したサンプルの代表的な顕微鏡画
像。スケールバー：100μm。（B）ADSC の分
化をコンピュータ支援画像解析での染色定量
化によって評価した。ヒストグラムは、CRET
曝露サンプルでの光学密度の平均±SEM が、
対応するコントロールでのものと有意な差が
なかったことを示している（p > 0.05）
。
結論
今回の結果は、容量性／抵抗性電移（CRET）セラピ
ーで使用する448kHzの電気的刺激への間欠的な曝
露が、S期、G2期、有糸分裂期の細胞の割合を高め、
ヒト間葉系幹細胞の増殖を促進することを示して
いる。今回の結果は、CRETの電気的処理が、その後
の脂肪、軟骨または骨分化のための幹細胞の多分化
能を損なわずに損傷領域に存在する静止状態の脂
肪由来幹細胞（ADSC）の増殖を活性化することで、
組織再生を促進する可能性を示している。これらの
データは、以前に発表された実験的根拠と共に、温
熱以外の分子および細胞機序が、組織の修復への利
用も含めたCRET治療の有効性にとって重要であり
得るという仮説を強く裏付ける。
つまり、まとめると、ここで発表した結果は、CRET
の電気的治療が、すでに増殖しつつある幹細胞の増
殖を刺激することで損傷の修復を促進または加速
する可能性を示唆している。この点から、様々な組
織の損傷および血管病変の回復に有効な補助療法
として、または一部の化学療法の副作用に敏感な患
者の治療の選択肢としてのCRETの適用の可能性を
提案することができる。CRETは抗炎症治療で有効で
ある可能性もある。
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