筋の記憶を司るエピジェネティクス制御機構の探索

（103）
第 30 回若手研究者のための健康科学研究助成成果報告書
2013 年度 pp.103∼108（2015.4）
筋の記憶を司るエピジェネティクス制御機構の探索
―筋は若年期の運動習慣を記憶しているのか？―
吉原利典＊
町田修一＊＊
後藤佐多良＊
柿木亮＊＊＊
THE EPIGENETIC MECHANISM OF MUSCLE MEMORY
Toshinori Yoshihara, Shuichi Machida, Sataro Goto,
and Ryo Kakigi
Key words: epigenetics, histone deacetylase, muscle memory, physical activity.
緒　言
生活習慣病の罹患率を高めることが指摘されてい
る。したがって、若年期における運動刺激・不活
トレーニングによって得られた効果は、その中
動刺激は、DNA 配列の変化を伴わない遺伝子情
止によって容易に失われるが、再びトレーニング
報として筋に記憶され、その後の筋の適応、すな
を開始すると速やかな応答が認められることがあ
わちトレーニング効果の獲得や筋肥大・筋萎縮の
る。実際、若年女性における30週間の脱トレーニ
生じやすさに多大な影響を与える可能性が高いと
ングは、過去20週間のレジスタンストレーニング
考えられる。しかし、若年期の運動経験の有無が
によって増加した筋力や筋線維横断面積を低下さ
エピジェネティックな遺伝子発現制御機構を介し
せるが、再びトレーニングを行うとわずか 6 週間
て骨格筋に記憶されているか否かはこれまで明ら
で同様の効果が得られる。このことから、骨格
かにされていない。
筋には適応する過程で運動刺激やトレーニング効
そこで本研究は、若年期の運動経験が筋内に記
果を何らかの形で筋内に記憶し、再び刺激が与え
憶されるか否かについて、ヒストン修飾によるエ
られた際に速やかに適応する仕組みが備わってい
ピジェネティクス制御機構から明らかにすること
ると考えられる。
を目的とした。
6）
近年、筋が運動刺激を記憶するメカニズムとし
て、生育環境や栄養などの環境要因によって
DNA 配列の変化を伴わない後天的なゲノム修飾
研究方法
Ａ．実験動物および飼育条件
（DNA のメチル化やヒストンのアセチル化など）
若齢（ 3 週齢）の雄性マウス104匹（日本エス
によるエピジェネティクス制御機構が注目されて
エルシー）を用い、 1 週間予備飼育した後、体重
いる。例えば、若年期における過剰なエネルギー
が等しくなるように以下の群に分けた。
の摂取はこれらの機構を介して成人期の肥満症や
＊
＊＊
＊＊＊
① コントロール群（SED，n = 39）： 4 （n =
順天堂大学スポーツ健康医科学研究所 Institute of Health and Sports Science & Medicine, Juntendo University, Chiba, Japan.
順天堂大学スポーツ健康科学研究科
Graduate School of Health and Sports Science, Juntendo University, Chiba, Japan.
順天堂大学医学部
School of Medicine, Juntendo University, Tokyo, Japan.
（104）
10）
、16（n = 8 ）
、28（n = 10）または40（n
に従って分析し、反応開始後 5 分から分光光度計
= 11）週齢時まで通常飼育。
を用いて吸光度の変化を測定した。
② トレーニング群（WR，n = 33）
：16（n =
Ｆ．ミオシン重鎖（MyHC）アイソフォーム組成
12）
、28（n = 10）および40（n = 11）週齢時
MyHC アイソフォームの分離は Sugiura & Mu-
まで、それぞれ12、24または36週間の自発走
rakami の方法 7）を改変した SDS-PAGE により分
トレーニングを実施。
離した。泳動後のゲルは coomassie brilliant blue 染
③ 若年・中年期トレーニング群（YMWR，n
= 21）
：16週齢までトレーニングを実施し、
色を施して蛋白質を可視化した。
Ｇ．統計処理
16∼28週齢時まで通常飼育した後（28週齢時
得られたデータは、すべて 4 週齢時（PRE）の
n = 10）
、28∼40週齢時までトレーニングを
平均値を 1 とした場合の発現率で示した（平均値
実施（40週齢時 n = 11）
。
±標準誤差）。統計学的分析は、各週齢について
④ 中年期トレーニング群（MWR，n = 11）：
対応のない t 検定または一元配置の分散分析を行
28週齢時まで通常飼育した後、28∼40週齢時
い、分散分析により有意差が認められた場合に
までトレーニングを実施。
は、Fischer 法による多重比較を行った。有意水
トレーニング群のマウス（②∼④）は、 4 また
準は危険率 5 ％未満とし、10％未満を傾向ありと
は28週齢から運動したいときに自由に回転ホイー
した。
ルにアクセスできる直径14.5 cm（幅 5 cm）の回
結　果
転式自発運動量測定装置で12∼36週間の自発走ト
Ａ．体重および腓腹筋相対筋重量
レーニングを行った。
なお、本研究のすべてのプロトコルは、順天堂
16週齢時の体重は、SED 群と比較して WR 群
大学の動物実験委員会の承認を得て行われた（承
で有意に低値を示した。また、40週齢時では、
認番号：H24-02）。
SED 群および MWR 群と比較して YMWR 群で有
Ｂ．骨格筋サンプリング
意に低値を示した。各週齢時において腓腹筋重量
各実験期間終了後（ 4 ，16，28または40週齢時）、
に群間で有意な差は認められなかった（データ未
マウスの体重を測定し、麻酔下で屠殺した後、両
記載）。
脚から下肢骨格筋を摘出し、左脚の腓腹筋を被検
筋として分析を行った。
Ｂ．ミオシン重鎖（MyHC）アイソフォーム組成
16週齢時のタイプ IId/x MyHC は SED 群と比較
Ｃ．ウェスタンブロット
して WR 群で有意に高値を示した（図 1 A）。ま
凍結されたマウスの腓腹筋を液体窒素存在下で
た、28週齢のタイプ IId/x MyHC は、WR 群と比
パウダーにし、Senf et al. の方法を改変した方
較して、YMWR 群で有意に低い値を示した。40
法により可溶性分画および核分画の蛋白質をそれ
週齢時には、中年期にのみトレーニングを行った
ぞれ抽出した。蛋白質は電気泳動により分離させ
MWR 群は WR 群と比較してタイプ IId/x MyHC
た後、メンブレンに転写し、抗原抗体反応を用い
が有意に低値を示した。また、SED 群と比較し
て検出した。
て WR 群のタイプ IId/x MyHC は増加、IIb MyHC
4）
Ｄ．遺伝子発現
は低下する傾向がみられた（P = 0.078）。
Okamoto et al. の方法に基づき、凍結されたマ
3）
Ｃ．CS 活性
ウスの腓腹筋の筋パウダーから総 RNA を抽出し
16週齢時において WR 群は SED 群と比較して
た。RNA（2000 ng）は逆転写反応を行った後、
有意に高い CS 活性を示したが、28週齢時では群
TaqMan Universal PCR Master Mix II（Applied Bio-
間に有意な差は認められなかった（図 1 B）。また、
systems）を用いて定量的 PCR 解析を行った。
40週齢時ではトレーニングにより CS 活性は高
Ｅ．Citrate Synthase（CS）活性（CS, EC 4.1.3.7）
クエン酸合成酵素活性の測定は、Srere の方法
5）
まったが、YMWR 群でのみ SED 群と比較して高
値を示す傾向が認められた（P = 0.067）。
（105）
4wks
PRE
16wks
SED
28wks
WR
SED
40wks
WR YMWR SED
4wks
WR YMWR MWR
SED
Type IId/x
16wks
SED
WR
28wks
SED
WR
40wks
YMWR
SED
WR
YMWR
MWR
Hsp72
Type IIb
＊
＊
P = 0.078
＊
＊
＊
＊
＊
＊
Hsp72（A.U.）
P = 0.078
＊
4wks
SED
16wks
SED
WR
28wks
SED
WR
40wks
YMWR
＊
YMWR
16wks
SED
WR
28wks
SED
WR
図 2 ．Hsp72
（A）
および SOD1
（B）
発現量
Fig.2．The expression of heat shock protein 72
（A）and superoxide dismutase （
1 B）.
The values are means SE. 16wks: unpaired t-test, 28 and
40wks: one-way ANOVA. * P < 0.05.
40wks
YMWR
SED
WR
YMWR
MWR
p-HDAC4/5/7（A.U.）
＊
SED
＊
16wks
SED
WR
PGC-1α mRNA（A.U.）
p-HDAC4/5/7
4wks
28wks
SED
WR
40wks
YMWR
SED
WR
YMWR
4wks
MWR
SED
16wks
SED
WR
28wks
SED
WR
40wks
YMWR
SED
WR
PGC-1α
＊
＊
PGC-1α protein（A.U.）
＊
SIRT1（A.U.）
MWR
P = 0.053
図 1 ．ミオシン重鎖アイソフォーム組成（A）およびクエ
ン酸合成酵素活性（B）
Fig.1．Myosin heavy chain isoform composition（A）and Citrate synthase
（CS）activity
（B）.
The values are means SE. 16wks: unpaired t-test, 28 and
40wks: one-way ANOVA. * P < 0.05.
SED
WR
SOD1
P = 0.067
4wks
SED
＊
＊
図 3 ．p-HDAC4/5/7
（A）, SIRT1（B）, PGC-1α mRNA（C）
および PGC-1α 蛋白質
（D）
発現量
Fig.3．p-HDAC4/5/7（A）, SIRT1（B）, PGC-1α mRNA（C）, and PGC-1α protein（D）expressions.
The values are means SE. 16wks: unpaired t-test, 28 and 40wks: one-way ANOVA. * P < 0.05.
YMWR
MWR
（106）
4wks
SED
16wks
SED
WR
28wks
40wks
SED WR YMWR SED WR YMWR MWR
Ac-Histone H3
p-HDAC4/5/7発現量と同様に、WR 群の SIRT1
発現量は16週齢時において SED 群と比較して有
意に高値を示した（図 3 B）。また、40週齢時にお
Histone H3
P = 0.083
＊
いて YMWR 群および MWR 群は、SED 群および
WR 群と比較して有意に低値を示した。
Ｆ． PGC-1α、Atrogin-1、Gadd45α mRNA お
よび蛋白質発現量
PGC-1α mRNA 発現量は、16、28および40週齢
のいずれの群においても有意な差は認められな
4wks
SED
16wks
SED
WR
28wks
40wks
SED WR YMWR SED WR YMWR MWR
H3
（K4me3）
Histone H3
かった（図 3 C）。16 および 28 週齢時において
PGC-1α 蛋白質発現量は SED 群と比較して WR 群
で有意に高値を示した（図 3 D）。また、40週齢
時の YMWR 群および MWR 群は、WR 群と比較
して有意に低値を示した。一方、Atrogin-1および
Gadd45α の mRNA および蛋白質発現量に群間で
有意な差は認められなかった（データ未記載）。
Ｇ．アセチル化ヒストン H3およびトリメチル
化リジン 4 発現量
図 4 ．アセチル化ヒストン H3
（A）およびトリメチル化リ
ジン 4（B）発現量
Fig.4．The expression of acetylated histone H3
（A）and histone
H3 trimethyl-lysine4
（B）.
The values are means SE. 16wks: unpaired t-test, 28 and
40wks: one-way ANOVA. * P < 0.05.
16週齢時の WR 群におけるアセチル化ヒスト
ン H3発現量は、SED 群と比較して高値を示す傾
向がみられた（P = 0.083, 図 4 A）。また、40週齢
時では、SED 群および WR 群と比較して YMWR
群で有意に高値を示し、SED 群と比較して MWR
群で有意に高値を示した。トリメチル化リジン 4
Ｄ．熱ショック蛋白質72（Hsp72）およびスー
発現量は、40週齢時の YMWR 群で最も高値を示
パーオキシドジスムターゼ 1（SOD1）発現量
したが、群間で有意な差は認められなかった（図
16および28週齢時において WR 群の Hsp72発現
量は SED 群と比較して有意に高値を示した（図
2 A）
。また、28週齢時における YMWR 群は WR
4 B）。
考　察
群と比較して有意に低値を示した。40週齢時では、
本研究において若年期の自発走トレーニング
MWR 群は SED 群および YMWR 群と比較して有
は、ミトコンドリアの主要な調節因子である
意に高値を示した。
PGC-1α 発現量、そしてミトコンドリア活性の指
一方、40週齢時の MWR 群における SOD1発現
標となる CS 活性を増加させたことから、持久的
量は、YMWR 群と比較して高値を示す傾向が認
なトレーニングとして十分な運動刺激であったと
められた（P = 0.053）
（図 2 B）
。
考えられる。興味深いことに、28週齢から40週齢
Ｅ．p- ヒストン脱アセチル化酵素4/5/7
（HDAC
時までの中年期のトレーニングによる CS 活性の
4/5/7）
およびサーチュイン 1（SIRT1）発現量
増加は、若年期に運動経験がある YMWR 群での
16週齢時において WR 群の p-HDAC4/5/7発現
み高まる傾向が認められた。また、一般的に持久
量は SED 群と比較して有意に高値を示した（図
的なトレーニングでは、MyHC アイソフォームに
3 A）
。また、40週齢時において YMWR 群および
は IIb ⇒ IId/x ⇒ IIa ⇒ I へのタイプシフトが起こ
MWR 群は、SED 群および WR 群と比較して有意
り、酸化系の代謝能力の向上が認められることが
に低値を示した。
知られている。本研究においても若年期の運動経
（107）
験により MyHC アイソフォームは IIb/ ⇒ IId/x へ
考えられる。すなわち、若年期のトレーニングに
とシフトしたが、若年期以降トレーニングを中止
よる長期的なヒストン H3のアセチル化は、中年
すると IId/x は有意に低下した（データ未記載）。
期以降の骨格筋の代謝能力や MyHC アイソフ
しかし、若年期に運動経験を有する群では、タイ
ォームのタイプシフトを調節するうえで重要な役
プ IIb から IId/x への MyHC アイソフォームのシ
割を担っているのかもしれない。今後は、若年期
フトの程度が中年期のみトレーニングを行った群
のトレーニングによる長期的なヒストンのアセチ
と比較して大きい結果となった。このことは、若
ル化が、どの遺伝子プロモーター領域に特異的に
年期の運動経験は、その後運動を中止したとして
生じているのかについて明らかにする必要がある。
も、中年期におけるトレーニング効果の獲得に有
ところで、若年期の運動習慣は、ストレスに対
利に働く可能性を示している。
し誘導される Hsp72発現量を高めるが、その後運
HDAC4/5/7 はリン酸化されることで myocyte
動を継続させることによって低下していった。こ
enhancer factor-2（MEF2）から解離し、解離され
れは、長期間のトレーニングに対する適応による
た MEF2は PGC-1α のプロモーター領域に結合す
ものであり、若年期運動経験を有する YMWR 群
ることで PGC-1α 発現量が増加する。我々は若
においても同様の傾向が認められた。しかしなが
年期のトレーニングによる HDAC を介した
ら、中年期にのみトレーニングを行った MWR 群
MEF2の調節が、エピジェネティックな遺伝子情
では WR 群および若年期にも運動を経験してい
報として筋内に記憶され、中年期のトレーニング
る YMWR 群と比較して Hsp72発現量は高く、同
によるトレーニング効果の獲得に貢献していると
時に SOD1発現量から評価した酸化ストレスも
考えたが、PGC-1α の mRNA 発現量および蛋白質
MWR 群でのみ亢進していた。このことから、若
発現量には若年期の運動経験の影響は認められな
年期の運動習慣によって、ストレスに対する Hsp
かった。また、SIRT1は PGC-1α を脱アセチル化
の働きが筋に記憶されている可能性が考えられる
することによりその発現量を正に調節しており、
が、本研究では明らかではない。
2）
若年期のトレーニングで増加したものの、
HDAC4/5/7と同様の結果であった。つまり、少な
総　括
くとも若年期の運動経験による40週齢時の CS 活
本研究の結果、若年期の運動経験は、中年期に
性の亢進には、HDAC や SIRT1を介した PGC-1α
おいてミトコンドリア活性のマーカーである CS
の調節は関与している可能性は低いのではないか
活性の増加や MyHC アイソフォームのタイプ IIb
と考えられる。
から IId/x へのタイプシフトに貢献している可能
蛋白質のアセチル化、特にヒストンのアセチル
性が認められた。その背景として、若年期のト
化はエピジェネティックな遺伝子の発現を調節す
レーニングによってヒストン H3のアセチル化が
る核内の主要な翻訳後修飾であることは現在よく
亢進する傾向がみられ、その後の中年期の運動に
知られている。本研究では、トリメチル化リジン
おいても、若年期に運動経験を有することにより
4 の発現量に有意な変化は確認できなかったが、
顕著な亢進が認められた。このことから、長期的
ヒストン H3のアセチル化量は、若年期のトレー
なヒストン H3のアセチル化が“筋の記憶”とし
ニングによって増加する傾向がみられ、若年期に
て残され、そのことが中年期のトレーニング効果
運動経験を有する群ではその亢進が顕著であっ
の獲得に一部貢献している可能性が考えられる。
た。これまで、脳においてはヒストン H3のアセ
チル化亢進が記憶の再固定や想起の際に誘導さ
れ、記憶に密接にかかわっていることが示されて
いる1）。このことから、骨格筋が若年期の運動経
験を記憶するメカニズムとして、このヒストン
H3のアセチル化の亢進が関与している可能性が
謝　辞
本研究に助成いただきました公益財団法人明治安田厚
生事業団に深く感謝申し上げます。研究の遂行にあたり、
ご協力いただきました放送大学准教授の関根紀子先生な
らびに順天堂大学スポーツ健康科学研究科博士後期課程
（108）
の棗寿喜君、都築孝允君、高嶺由梨さんには厚く御礼申
し上げます。
4）Senf SM, Dodd SL, Judge AR（2010）
: FOXO signaling is
required for disuse muscle atrophy and is directly regulated
参考文献
1）Lubin FD, Sweatt JD（2007）
: The IkappaB kinase regulates chromatin structure during reconsolidation of conditioned fear memories. Neuron, 55, 942-957.
2）McGee SL, Hargreaves M（2010）: Histone modifications
by Hsp70. Am J Physiol Cell Physiol, 298, C38-C45.
5）Srere P（1969）
: Citrate synthase. Methods Enzymol, 13,
3-11.
6）Staron RS, Leonardi MJ, Karapondo DL, Malicky ES,
Falkel JE, Hagerman FC, Hikida RS,（1991）: Strength and
skeletal muscle adaptations in heavy-resistance-trained
and skeletal muscle metabolic gene expression. Clin Exp
women after detraining and retraining. J Appl Physiol, 70,
Pharmacol Physiol, 37, 392-396.
631-640.
3）Okamoto T, Torii S, Machida S（2011）: Differential gene
7）Sugiura T, Murakami N（1990）
: Separation of myosin
expression of muscle-specific ubiquitin ligase MAFbx/
heavy-chain isoforms in rat skeletal-muscles by gradient
Atrogin-1 and MuRF1 in response to immobilization-in-
sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel-electrophore-
duced atrophy of slow-twitch and fast-twitch muscles. J
sis. Biomed Res（Tokyo）
, 11, 87-91.
Physiol Sci, 61, 537-546.

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