2013年
度
修 士 論 文
ウシ 体 外 成 熟 培 養 に お け るプ ロジ ェス テ ロ ン
添 加 が 胚 発 生 に及 ぼ す 影 響
瀦
θo`ofμ08θ
β'θ■・oηθsu
.pplementotゴoηof
maturationmediumonthedevelopmentof
■VM-IVF引70ゐ07ゴ
21231011庄
指 導教員
η θ θ皿 加70β
司 圭 佑
家 畜繁 殖 学
教授
堂地
修
動物生 殖学
教授
今井
敬
酪 農 学 園 大 学 大 学 院 酪 農 学研 究 科
目
第1章
緒
第II章
ウ シIVMに
次
論
.1
お け る プ ロ ジ ェ ス テ ロ ン 添 加 が 卵 子 成 熟
お よ び 胚 発 生 に 及 ぼ す 影 響
第1節
緒
言
・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ …5
第2節
材 料 お よび 方 法
・
第3節
結
果
.16
第4節
考
察
.21
第5節
要
約
.27
.g
29
○
32
33
40
・
●
●
●
○
●
●
●
.
●
■
O
●
●
●
o
●
o
●
・
●
●
●
●
●
●
○
●
.
●
●
●
●
○
●
・
●
o
引用 文 献
●
英文要約
●
●
辞
謝
括
総
第 皿章
第1章
緒
論
哺 乳 類 の 卵 母 細 胞 は 卵 巣 内 で は 第 一 減 数 分 裂 前 期 の 複 糸 期
で 分 裂 を 停 止 し て お り、 体 外 培 養 に よ り第 一 減 数 分 裂 中期 へ
と 成 熟 を 再 開 す る[32]。
た
ま た 、直 径2∼6mmの
ウ シ 卵 母 細 胞 は す べ て 卵 核 胞 期(以
Vesicle;GV)に
あ る こ と が 知 ら れ て い る[32]。
に お け る 体 外 成 熟 培 養(以
下IVM)は
卵 胞 か ら採 取 し
下Germinal
ウ シ 体 外 受 精
、未 成 熟 卵 子 が 受 精 可 能
な 成 熟 卵 子 へ と変 化 す る た め に 必 要 不 可 欠 な 培 養 で あ る 。
成 熟 卵 子 と は 、 卵 母 細 胞 が 第 一 極 体 を 放 出 す る こ と に よ り
一 次 卵 母 細 胞 か ら 二 次 卵 母 細 胞 へ と発 育 し た も の を 指 し、 卵
母 細 胞 の 細 胞 質 の 成 熟 と 卵 丘 細 胞 の 膨 化 を 伴 う必 要 が あ る 。
ウ シIVMで
は 卵 胞 刺 激 ホ ル モ
StimulatingHormone;FSH)を
FSHが
ン(以
下Follicle
培 養 液 に 添 加 す る 場 合 が 多 く 、
核 成 熟 を 促 進 さ せ 、 卵 丘 細 胞 か ら の ビ ア ル ロ ン 酸 分 泌
を 刺 激 し、 卵 丘 細 胞 の 膨 化 促 進 お よ び 卵 丘 細 胞 の 増 殖 や ス テ
ロ イ ド産 生 を 促 進 し て い る[2]。
LHやhCGと
は ヒ トIVMへ
ま た ヒ ト で は 、FSH以
外 に も
い っ た ホ ル モ ン を 添 加 す る 場 合 が 多 い が 、近 年 で
のhCG添
加 は 効 果 の な い こ と が 示 さ れ て い る[7]。
1
ヒ
ト や ブ タ のIVMで
は 、 卵 丘 細 胞 卵 子 複 合 体(以
Cumulus-oocytecomp!exes;COCs)のLHレ
誘 導 後 にLHを
う に 、FSHやLHの
セ プ タ ー をFSHで
添 加 し 卵 子 成 熟 を 促 進 さ せ る[1、13]。
こ の よ
組 み 合 わ せ 、添 加 す る タ イ ミ ン グ お よ び 添
加 期 間 の 検 討 が 進 ん で い る[2]。
そ れ で も な お 、多 く の 哺 乳 動
物 の 卵 子 は 、 体 外 成 熟 、 体 外 受 精 お よ び 体 外 発 生(以
IVM-IVF-IVC)を
下
行 う と種 に よ っ て 段 階 が 異 な る が 、 あ る決 ま
っ た 段 階 で 発 生 が 停 止 す る 現 象 が 起 き る た め[6、30]、
室 で もIVC後
下
の 胚 盤 胞 発 生 率 は20∼30%と
当 研 究
低 く 、培 養 方 法 に
つ い て は 更 に 検 討 が 必 要 で あ る。 胚 盤 胞 発 生 率 の 向 上 に は 卵
母 細 胞 の 成 熟 が 大 き く 関 与 し て お り、 卵 母 細 胞 の 成 熟 に は 卵
丘 細 胞 の 有 無 が 重 要 で あ る 。 卵 丘 細 胞 は 卵 母 細 胞 と ギ ャ ッ プ
結 合 を 介 し 、 栄 養 供 給 な ど の 細 胞 間 の 連 絡 を 保 っ て い る こ と
か ら 双 方 は 密 接 な 関 係 が あ る[24]。
胚 発 生 率 を 改 善 す る 一 つ
の 手 段 と し て 、 卵 母 細 胞 の 培 養 法 を 改 善 す る 必 要 が あ る と考
え られ る 。
近 年 、 ブ タ 卵 子 の 体 外 受 精 で は 成 熟 培 養 液 へ の プ ロ ジ ェ ス
テ ロ ン(黄
体 ホ ル モ ン 、 以 下Progesterone;P4)を
含 む 数
種 類 の ホ ル モ ン 添 加 が 成 熟 率 お よ び 胚 盤 胞 発 生 率 の 改 善 に 有
効 で あ る と 報 告 さ れ て い る[13]。
2
宮 田[17、18]は
ウ シ 卵 子 の
成 熟 培 養 液 にP4を
添 加 す る と 受 精 後 の 胚 発 生 が 向 上 し た と
報 告 し て い る 。 ウ シ 発 情 期 に け る 血 中P4濃
来P4の
濃 度 上 昇 に 伴 い 、LH(黄
LuteinizingHormone;LH)サ
体 形 成 ホ ル モ ン 、 以 下
ー ジ 開 始 か ら4∼5時
し く 上 昇 し 、6∼10時
ー ジ 開 始24∼30時
度 は 穎 粒 層 細 胞 由
間 後 に 最 高 値 と な る[9]。
間 後 に 著
そ し てLHサ
間 後 に 排 卵 が 起 き る 。 さ ら に 、卵 丘 細 胞 に
は プ ロ ゲ ス チ ン 膜 レ セ プ タ ー が 発 現 し て い る こ と[20]、
び 川 島[13]や
宮 田[17、18]の
研 究 報 告 か ら 、P4は
お よ
哺 乳 類 の 排
卵 周 期 に お け る 卵 子 成 熟 に 大 き く 関 わ っ て い る こ とが 推 察 さ
れ る 。 こ れ ら の こ と か ら 、 ウ シ お よ び ブ タ のIVMに
お け るP4
添 加 は 卵 子 成 熟 お よ び 受 精 後 の 胚 発 生 の 向 上 に 効 果 が あ る と
考 え ら れ る 。 し か し 、 ブ タ 体 外 受 精 で は 生 体 内 に お け るP4が
分 泌 す る 時 期 を 検 討 した 上 で 添 加 して い る の に 対 し、 ウ シ 体
外 受 精[17、18]で
は 、 分 泌 時 期 と は 無 関 係 にP4を
添 加 して
い る た め 、 内 分 泌 学 的 に 最 適 で は な い 可 能 性 が 考 え られ る。
こ れ ら の こ と か ら 、 ウ シIVMで
もP4の
添 加 時 期 を 検 討 し た 上
で 添 加 す る こ と に よ り、 従 来 の 培 養 方 法 よ り も 高 い 胚 発 生 率
を 得 られ る 可 能 性 が あ る 。
本 研 究 で は ウ シIVMの
上 を 目 的 と し 、COCsを
改 善 に よ る 体 外 受 精 胚 の 発 生 率 の 向
用 い て 、IVMに
3
お け るP4の
適 切 な 添 加 濃
度 に つ い て 検 討 す る た め 、培 養 液 内 に 各 種 濃 度 のP4を
IVM後
添 加 し、
の 卵 子 成 熟 率 、体 外 受 精 後 の 胚 発 生 率 お よ び 作 出 し た 胚
を 用 い て 細 胞 数 を 調 査 し た 。
4
第II章
ウシ体 外 成 熟 培 養 に お け る プ ロジ ェス テ ロ ン添加 が
卵 子 成 熟 お よび胚 発 生 に及 ぼ す 影 響
第1節
IVMの
緒
言
至 適 培 養 条 件 を 設 定 す る こ と は 体 外 受 精 技 術 の 課 題
の 一 つ で あ る[34]。
ヒ トに 限 ら ず 、 大 型 家 畜 に お い て も 体 外
成 熟 した 卵 子 の 受 精 後 の 発 生 能 は 体 内 成 熟 卵 と 比 較 し て 低 い
の が 現 状 で あ る[34]。
そ の 原 因 と し て 、直 径1cm以
上 に 発 育 す
る ヒ トや 大 型 家 畜 の 卵 胞 は 器 官 培 養 が 困 難 な た め 、 体 外 培 養
系 に お い てCOCsを
回 収 して 培 養 し て も 、 英 膜 や 穎 粒 膜 細 胞 の
分 泌 機 能 が 欠 け て い る こ と が 挙 げ られ る。 ま た 、 体 外 培 養 に
用 い る 卵 子 は 、 卵 胞 発 育
・成 熟 が 誘 導 さ れ る 以 前 の 発 育 途 上
の 卵 胞 腔 か ら 回 収 し て い る た め 、 卵 子 自身 や 卵 丘 細 胞 の 成 熟
準 備 が 完 了 して い な い こ と も 考 え られ る 。 排 卵 期 に は 、 卵 胞
内 の 内 分 泌 環 境 の 変 化 や そ れ に 伴 う卵 丘 細 胞 の 機 能 的 変 化 が
生 じ る こ と か ら 、 こ れ ら を 体 外 で 誘 導 す る 必 要 が あ る と され
て い る[35]。
排 卵 前 未 成 熟 卵 子 は 卵 胞 内 で 成 熟 、 発 育 す る こ
と か ら未 成 熟 卵 子 に と っ て 生 理 的 な 体 液 は 卵 胞 液 だ と 考 え ら
れ る。 こ れ ま で の 研 究 か ら卵 胞 液 に は 、 減 数 分 裂 活 性 化 ス テ
5
ロ ー ル[16]、
ミ ッ ド カ イ ン[11]お
よ び レ プ チ ン[4]と
い っ た 細
胞 質 の 成 熟 促 進 活 性 を 示 す 物 質 が 含 ま れ て い る こ と が 報 告 さ
れ て い る 。 こ れ ら の こ と か ら 、IVM用
の 培 養 液 も 卵 胞 液 組 成 に
近 づ け る こ と で そ の 成 績 が 向 上 す る 可 能 性 が あ る と 考 え ら れ
る[2]。
近 年 、 ウ シ 生 体 内 を モ デ ル と し たIVMへ
の 物 質 添 加 の 様 々 な
試 み が 行 わ れ て お り 、そ の 一 つ に ホ ル モ ン 添 加 が 挙 げ ら れ る 。
添 加 す る ホ ル モ ン の 組 み 合 わ せ 、 添 加 時 期 お よ び 添 加 期 間 の
検 討 が 行 わ れ て い る[2]。
LHレ
セ プ タ ー をFSHで
ヒ ト や ブ タ 卵 子 のIVMの
誘 導 後 、LHを
際 、COCsの
添 加 す る 段 階 的 な 培 養 法 が
試 み ら れ 、 胚 盤 胞 発 生 率 向 上 が 認 め ら れ て い る[1、13]。
た 、 筆 者[27]の
加
実 験 で は 、IVM開
し た 培 地 に 卵 子 を 移
こ ろ 、10時
間 目 に 添 加
始5時
減 数 分 裂 を 開 始
し た 区 に 比 べ 胚 盤 胞 発 生 率 が 有 意 に 低
曝 さ れ る 時 間 が 長 か っ た た め
さ せ る 成 熟 促 進 因 子(以
MaturationPromotingFactor)の
divisioncycle25ボ
ゼ)の
酵 素 活 性[20]を
添
し換 え 体 外 受 精 後 の 胚 発 生 を 調 べ た と
か っ た 。 こ の 理 由 はCOCsがP4に
にP4が
間 目 にlug/mlのP4を
ま
下MPF;
活 性 化 を 起 こ すcell
ス フ ァ タ ー ゼ(以
失 活 さ せ る と い
ネ ズ ミ な ど の 小 動 物 のCOCsの
下Cdc25ホ
う報 告 か ら 説 明 で き る 。
培 養 に お い て はP4の
6
ス フ ァ タ ー
添 加 が 卵 子
の 成 熟 を 促 進 さ せ る が 、 ウ シ な ど の 大 動 物 の 場 合 は 阻 害 作 用
を 示 す[23]。
し た が っ て 、P4{度
に は 至 適 範 囲 が あ り 、 濃 度
が 高 く て も 低 く て も 卵 子 の 成 熟 能 は 低 下 す る と 考 え ら れ 、 添
加 濃 度 の 設 定 は ホ ル モ ン を 添 加 す る 上 で 重 要 で あ る と 考 え ら
れ る 。
ウ シ 生 体 内 で は 、LHサ
る 。 血 中P4濃
し 、6∼10時
度 はLHサ
LHサ
ー ジ 開 始 か ら4∼5時
間 後 に 最 高 値 と な る[9]。
よ そ0.79ng/mlで
1.1ng/mlと
ー ジ 開 始24∼30時
あ り 、LHサ
間 後 に 排 卵 す
間 後 に 著 し く 上 昇
発 情 期 のP4平
ー ジ 開 始6∼10時
間 後 は お よ そ
平 均 値 に 比 べ 高 い 値 で あ る 。 卵 子 成 熟 を 誘 起 す る
ー ジ の 開 始 に 伴
うP4濃
度 上 昇 は 、P4が
卵 子 成 熟 と 密 接 な
関 係 に あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。 性 ス テ ロ イ
あ るP4は
均 値 は お
ド ホ ル モ ン で
穎 粒 層 細 胞 に お い て 、 コ レ ス テ ロ ー ル か ら 共 通 的 な
中 間 体 ス テ ロ イ
ド で あ る プ レ グ ネ ノ ロ ン を 経 て 生 合 成 さ れ る
[8](図1-1)。
し た が っ て 、 コ レ ス テ ロ ー ル か ら プ レ グ ネ ノ
ロ ン に な り 、 プ レ グ ネ ノ ロ ン はP4あ
る い は17一
レ グ ネ ノ ロ ン に 代 謝 さ れ る 。P4はC17水
17α
α ヒ ド ロ キ シ プ
酸 化 酵 素 に よ っ て
一ヒ ド ロ キ シ プ ロ ジ ェ ス テ ロ ン と な り 、次 にC17-20リ
ゼ に よ り ア ン
酵 素(以
ド ロ ス テ ン ジ オ ン に 、そ の 後17β
下17βHSD)に
トス テ ロ ン に チ
よ っ て テ ス
ト ク ロ ー ムP-450ア
7
ア ー
一水 酸 基 脱 水 素
トス テ ロ ン と な る 。 テ ス
ロ マ タ ー ゼ(以
下
P-450arom)が
働 き エ ス ト ラ ジ オ ー ル17β
テ ン ジ オ ン にP-450aromが
ト ロ ジ ェ ン;E2)と
と な る 。ア ン ド ロ ス
作 用 す る と エ ス ト ロ ン(以
な る 。E2は
下
排 卵 を 引 き 起 こ すLHサ
起 因 と な る と 共 に 、穎 粒 層 細 胞 のFSHお
よ びLHの
ー ジ の
受 容 体 を つ く
り 、 穎 粒 層 細 胞 の 分 裂 を 刺 激 し 卵 胞 の 発 育 を 促 す[29]。
わ ち 、P4は
す な
各 ス テ ロ イ ドホ ル モ ン の 前 駆 物 質 で あ り、 これ ら
の ス テ ロ イ ド ホ ル モ ン は 卵 胞 成 熟 、排 卵 を 誘 起 す るFSHお
LHの
エ ス
受 容 体 形 成 に 関 与 す るE2を
よ び
生 成 す る 。 こ の こ と か ら 、P4
は 卵 子 成 熟 に お い て 重 要 な 間 接 的 役 割 を 担 っ て い る 。
体 外 培 養 に お い て も 、P4はFSH受
考 え ら れ る[35]。
例 え ば 、IVM培
容 体 形 成 に 携 わ っ て い る と
養 液 へ のP4添
加 に よ り減 数 分
裂 停 止 を 解 除 す る こ と が 、 幼 若 ラ ッ トを 用 い た 実 験 か ら 実 証
さ れ て い る[19]。
るP4は
こ の こ とか ら、 体 内 お よ び 体 外 培 養 に お け
卵 子 成 熟 に 間 接 的 お よび 直 接 的 に 作 用 して い る とい え
る。
本 実 験 で は 、 体 内 の 血 中P4濃
発 情 開 始10時
10時
度 が 上 昇 し、 最 高 値 に 達 す る
間 目 にP4添
間 目 を 照 ら し 合 わ せ 、IVM由
加 培 地 に 移 し 換 え 、IVM培
来 卵 子 をIVM開
地 へ のP4添
始 後
加 が 卵 子
成 熟 、 受 精 後 の 胚 発 生 お よ び 胚 の 品 質 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て
検 討 した 。
8
第2節
1.卵
材 料 お よび 方 法
子 の 回 収
食 肉 処 理 場 由 来 で 採 取 し た ウ シ 卵 巣 を パ ウ チ パ ッ ク に 入 れ
実 験 室 に 持 ち 帰 っ た 。 卵 管 間 膜 お よ び 脂 肪 を 除 去 し 、 滅 菌 生
理 食 塩 水 で 数 回 洗 浄
液 を 滅 菌 紙 で 除 去
着
し た5mlシ
し た 後 、 卵 巣 表 面 の 余 分 な 水 分 お よ び 血
し た 。COCsの
採 取 に は 、18Gの
リ ン ジ を 用 い 、3%子
Gibco、16170-078)を
添 加
し た 後 、 直 径2∼6mmの
採 取 後 のCOCsはD-PBSで
胞 が1層
2卵
子)を
以 上 付 着
少 量 吸 引 し シ リ ン ジ 内 を
卵 胞 か らCOCsを
数 回 洗 浄
吸 引 採 卵
し た 。
し た 。供 試 卵 子 に は 卵 丘 細
し 、 細 胞 質 が 均 一 な 未 成 熟 卵 子(Grade1、
用 い た 。
採 取 し た 直 後 のCOCsは
刺 激 ホ ル モ
0.02AU/mlお
下CS;
し た 修 正 ダ ル ベ ッ コ リ ン 酸 緩 衝 液
(以 下D-PBs;Gibco、21300-025)を
洗 浄
ウ シ 血 清(以
注 射 針 を 装
ン(以
、D-PBSで3回
洗 浄
ン
ト リ ンR10、
下FSH;ア
よ び5%CSを
添 加
TCM-199;Gibco、12340-030)で2回
川 崎 三 鷹)
し た へ ペ ス 緩 衝TCM-199(以
洗 浄
9
し た の ち 、 卵 胞
し た 。
下
2.体
外 成 熟 培 養
IVMに
は 前 述 し た 体 外 成 熟 培 地 お よ び 同 様 の 培 地 にP4
(Sigma、P7556)を1お
P4添
よ び5ug/ml添
加 濃 度 別 に1ugお
て 計3区
よ び5ug区
ま たP4無
添 加 を 対 照 区 と し
ド ロ ッ プ を 作 製
カ ラ イ テ ス ク 、26114-75)で
ず つ 導 入
し38.5℃
無 添 加 のTCM-199で
よ び5ug区
はIVM開
始 後 最 初 の10時
間 目 に
ド ロ ッ プ か ら 取
加 し たTCM-199で2回
マ ル チ デ ィ ッ シ ュ(Nunc、179820)に
滴 下 し た も の に20個
ず つ 導 入
し 、 流 動 パ ラ フ ィ
気 の 気 相 条 件 下 で20時
培 養 し 、10時
よ び5ug/ml添
レ(Falcon、
覆 っ た も の にCOCsを20個
、5%CO2、95%空
養 し た 。 ま た 、1お
P4を1お
し た も の を 用 い た 。
を 設 け た 。 対 照 区 は プ ラ ス チ ッ ク シ ャ ー
1007)に100u1のTCM-199の
ン(ナ
加
間 培
間 はP4
り 出 し、
洗 浄 し た 後 、4well
同 液 を1wel1あ
た り700u!
し 、 同 様 の 気 相 条 件 下 で20時
問
目 ま で 培 養 を 行 な っ た 。
3.ア
セ トオ ル セ イ ン 染 色 法 に よ る 卵 子 の 核 相 検 査
IVM開
始20時
間 後 に 一 部 のCOCsは
製 し 核 相 検 査 を 行 な っ た 。COCsは
、ホ ー ル マ ウ ン ト 標 本 を 作
、D-PBSが2ml入
っ た ガ ラ ス
遠 沈 管 に 移 し 、ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で5分30秒
間 擁 搾 し卵 丘
細 胞 を 完 全 に 除 去 し た 後 、 カ ル ノ ア 液(酢
10
酸 とエ タ ノ ー ル を
1:3の
割 合 で 混 合 し た も の)を
固 定 後 、99.5%エ
(45%濃
タ ノ ー ル で 置 換 後 、1%酢
間 以 上 固 定 した 。
酸 オ ル セ イ ン溶 液
度 に 調 整 し た 酢 酸 溶 液 に オ ル セ イ ン0.02g/mlを
し た も の)で15∼30分
ー ル(酢
用 い て48時
間 染 色 した 。 染 色 後 、 ア セ トグ リセ ロ
酸 、 グ リ セ リ ン お よ び 超 純 水 を1:1:3の
し た も の)で
混 合
割 合 で 混 合
置 換 し、 生 物 顕 微 鏡 下 で 核 相 を 観 察 した 。 卵 子
の 核 相 の 判 断 基 準 は 、 核 の 赤 道 面 に 染 色 体 が 配 列 して い る も
の を 第 一 減 数 分 裂 中 期 卵 子(以
下MetaphaseI;MI)、
細
胞 質 の 両 極 へ 染 色 体 が 移 動 を 開 始 して い る も の を 第 一 減 数 分
裂 後 期 卵 子(以
下AnaphaseI;AI)、
細 胞 質 の 両 極 へ 染 色
体 移 動 が 完 了 し て い る も の を 第 一 減 数 分 裂 終 期 卵 子(以
TelophaseI;TI)お
下
よ び 細 胞 質 の 赤 道 面 に 半 減 した 染 色 体
が 配 列 し、 第 一 極 体 の 核 相 が 確 認 で き る も の を 第 二 減 数 分 裂
中 期 卵 子(以
4.体
1)精
下MetaphaseII;MII)と
した 。
外 受 精
子 の パ ー コ ー ル 洗 浄
体 外 受 精 に は ホ ル ス タ イ ン 種 種 雄 牛1頭
た 。 凍 結 精 液 は370Cの
温 湯 に30秒
解 後 の 精 子 はTakahashiら[28]の
の 凍 結 精 液 を 用 い
間 浸 漬 して 融 解 した 。 融
方 法 に 準 じ 、パ ー コ ー ル(GE
11
HealthcareBio-ScienceAB、17-0891-Ol)に
よ る 密 度 勾 配 法
に よ り 洗 浄 分 離 し た 。 パ ー コ ー ル 密 度 勾 配 法 は 、 ま ず90%パ
ー
コ ー ル 溶 液
を 調 製
し
、 っ い で90%パ
BrackettandOliphant[3]液(以
ー コ ー ル 溶 液 を 調 製
ー
下BO液)を
し た
加 え て45%パ
。 精 子 の パ ー コ ー ル 洗 浄 に は15ml
の プ ラ ス チ ッ ク 遠 沈 管(Corning、43079)を
に45%パ
ー コ ー ル 溶 液2mlを
90%パ
ー コ ー ル 溶 液2mlを
90%パ
ー コ ー ル 溶 液
精 液 を470u1重
層
コ ー ル 溶 液 に
用 い た 。 は じ め
入 れ 、 次 い で 遠 沈 管 の 底 部 に
入 れ 、45%パ
ー コ ー ル 溶 液 の 下 に
と な る よ う に 重 層 し 、 そ の 上 に 融 解 後 の
し た 。遠 心 分 離 は2000rpmで20分
間 行 な い 、
上 清 を ア ス ピ レ ー タ で 吸 引 し 除 去 し た の ち 、 精 子 懸 濁 液 よ り
精 子 沈 渣 を 得 た 。
2)精
子 の 受 精 能 獲 得 誘 起
体 外 受 精 に 使 用 し た 精 子 の 受 精 能 獲 得 誘 起 はBO液
た 方 法 で 行 っ た 。す な わ ち 、BO液
H1384)お
よ び4U/mlノ
ボ ヘ パ リ ン(持
加 し た 受 精 能 獲 得 誘 起 液6mlを
え 、 た だ ち に1800rpmで5分
に10mMヒ
を 用 い
ポ タ ウ リ ン(Sigma、
田 製 薬 、A138)を
添
パ ー コー ル 洗 浄 後 の 精 子 に加
間 の 遠 心 分 離 を行 な い 、 上 清 を
ア ス ピ レー タ で 吸 引 除 去 後 、 受 精 能 獲 得 精 子 を 得 た 。
12
3)精
子 濃 度 調 整
受 精 能 獲 得 誘 起 後 の 精 子 は 精 子 数 を
計 算 室 タ イ プ 、 エ ル マ)に
ト ー マ 血 球 計 算 盤(2
よ り 計 測 後 、 最 終 濃 度 が5×106/ml
に な る よ う に 、 ま ず10mMヒ
ポ タ ウ リ ン を 添 加
誘 起 液 で10×106/mlに
し 、BO液
ブ ミ ン(以
2倍 希 釈
調 製
下BSA;Sigma
に20mg/mlウ
、A4378)を
添 加
し た 受 精 能 獲 得
シ 血 清 ア ル
し た 精 子 希 釈 液 で
し 、 精 子 浮 遊 液 と し た 。
4)媒
精
精 子 浮 遊 液 を 用 い て60mmシ
ャ ー レ に1001の
ド ロ ッ プ を 作
製 し 、 流 動 パ ラ フ ィ ン で 覆 っ た も の を 体 外 受 精 培 地 と し た 。
IVM後
の 卵 子 はBO液
回 洗 浄
し た の ち 、
にBSA10mg/m1を
添 加
ド ロ ッ プ1個
あ た り20個
同 様 の 気 相 条 件 下 で18時
5.体
し た 卵 子 洗 浄 液 で3
ず つ 導 入 し 、IVMと
間 媒 精 を 行 な っ た 。
外 発 生 培 養
体 外 発 生 培 養 は 、5%CSを
添 加
し たCRlaa[22](以
を 用 い た 。 媒 精 が 終 了 し たCOCsはD-PBSを2ml入
沈 管 に 移
し 、ボ ル テ ッ ク ス ミ キ サ ー で2分30秒
完 全 に 除 去 し た 後 、CRlaaで3回
洗 浄 し 、60mmシ
13
下CRlaa)
れ た ガ ラ ス 遠
間 撹 拝
し精 子 を
ャ ー レ に 同 じ
CRlaaで100u1の
プ1個
ド ロ ッ プ を 作 製 し 、 各 試 験 区 そ れ ぞ れ
あ た り20個
ず つ 導 入 し 、38.5℃
気 相 条 件 下 でIVFを0日
IVF後3日
よ び4細
、5%CO2、5%02、90%N2の
目 ま で 培 養 し た 。
目 に 倒 立 顕 微 鏡 下 で 卵 子 を 観 察
胞 期 、5細
卵 割 率 は 、培 養
ま た 、7∼9日
培 養
と し て 、9日
し 、2細
胞 期 、3お
胞 期 以 上 に 発 育 し た 胚 の 割 合 を 調 査
し た 。
し た 全 卵 子 数 に 対 す る 卵 割 胚 数 の 割 合 と し た 。
目 に 胚 盤 胞 発 生 率 を 調 査
し た 。胚 盤 胞 発 生 率 は 、
し た 全 卵 子 数 に 対 す る 発 生 胚 盤 胞 数 の 割 合 と し た 。
6.蛍
光 二 重 染 色 法 に よ る 胚 盤 胞 の 細 胞 数 測 定
細 胞 数 の 測 定 に は7日
蛍 光 二 重 染 色 は 阪 谷
目 に 胚 盤 胞 以 上 に 発 育 し た 胚 を 用 い 、
ら の 方 法[24]を
用 い た 。 胚 は 、 リ ン 酸 緩
衝 液(以
下PBS(一);Gibco、14190)+5mg/mlBSA(Sigma、
A7030)で
軽 く 洗 浄
し た 後 、0.1mg/mlPropidiumiodide(Sigma、
P4170)に0.2%TritonX-100お
1分 間 、細 胞 質 が 少
99.5%エ
ド ロ ッ
よ びPBS(一)を
一 次 染 色 液 と し 、
し収 縮 す る ま で 染 色 液 に 浸 漬
し た 。次 い で 、
タ ノ ー ル とPBS(一)に25ug/mlbisBenzimide(Hoechst
33342;SIGMA、B2261)を
こ れ を 二 次 染 色 液
(Wako、075-00616)で
溶 解
と し3分
し た も の を9:1の
割 合 で 混 合 し 、
間 浸 漬 し た 。 浸 漬 後 、 グ リ セ リ ン
余 分 な 染 色 液 を 除 去 し 、 同 時 に 退 色 防
14
止 を 行 っ て 少 量 の グ リ セ リ ン と 共 に ス ラ イ ドガ ラ ス に 移 し 、
カ バ ー ガ ラ ス で 封 入 し た 。 そ の 後 、 蛍 光 顕 微 鏡 下 で 観 察 し蛍
光 フ ィ ル タ ー(波
撮 影 し た(図1-1)。
長460nm;青
使 用 して
撮 影 し た 画 像 は 画 像 処 理 ソ フ トlmageJ(ア
メ リ カ 国 立 衛 生 研 究 所)を
染 色 さ れ た 部 分)、
、 波 長560nm;赤)を
用 い て 胚 盤 胞 の 内 細 胞 塊 数(青
栄 養 膜 細 胞 数(赤
色 に
色 に 染 色 さ れ た 部 分)を
そ れ ぞ れ 測 定 し、 両 細 胞 数 の 合 計 を 総 細 胞 数 と し た 。
7.統
計 分 析
卵 子 成 熟 率 、 卵 割 率 お よ び 胚 盤 胞 発 生 率 の 統 計 処 理 は カ イ
ニ 乗 検 定 ま た はFisherの
直 接 確 率 法 を用 い て 行 な っ た 。
胚 盤 胞 の 細 胞 数 の 統 計 処 理 はt一 検 定 を 用 い て 行 な っ た 。
15
第3節
ウ シIVM培
のIVM20時
lug区
養 液 にP4を
結
無 添 加 、1お
果
よ び5ug/ml添
間 後 の 卵 子 成 熟 率 を 表1-1に
が 対 照 区 お よ び5ug区
示
加
し た と き
し た 。卵 子 成 熟 率 は 、
に 比 べ 有 意 に 高 く(P〈0.05)、5ug
区 は 対 照 区 と 差 が な か っ た 。
IVF後3日
1-2に
示
目 の 卵 割 率 お よ び7∼9日
目 の 胚 盤 胞 発 生 率 を 表
し た 。 卵 割 率 は 対 照 区 に 比 べlug区
0.01)、5μg区
が 有 意 に 高 く(P〈
は 対 照 区 と 差 が な か っ た 。 胚 盤 胞 発 生 率 は 、lug
区 お よ び5ug区
が 対 照 区 に 比 べ 有 意 に 高 か っ た(P〈0.01お
よ
びP〈0.05)。
IVF後7日
目 の 胚 盤 胞 の 細 胞 数 を 表1-3に
間 に も 差 は な か っ た 。
16
示 し た 。い ず れ の 区
﹄(ト .Qト)。。N
。(QO .。う①)O。っ
﹄の(O .oOト)。心。畑
ひこ
寸OCり
H薯
寸
(
胆 )容 - 卜 K 簾 怪
H<
一N
H日
、
一→
oF→
凶 b。量
凶 b
ρヨ
凶 匪、
較
凶 麟寵
17
(
8 .
O> 自)9槍 網 髄 裡 思 踵 中 建 曝 m
書
無串風稲"
一NOO
CつCつN
勲 醸 歩艶 関 息 礁 怪 串 民 簑 ロ
R腫 八 ロ ト K H 容 ロ
。
トゆ赴 翼 思 樵 塒 醸 怪 数 葦 お 心 .
一-一構
口薯
つ
(
ま)輔 卵 民熊 怪
cりo(N
C＼1ζ
Q(寸 .。っ寸)①コ
Q(﹃ トト)N一N
﹄(卜 .
寸卜)トON
。・ (O .ゆ oO ) O 。心 。心
司(O .
ゆ 。う)ト①
(
ま )蕪 圏雲卸巳瓜Q 皿 皿 oう
﹄(卜 .
ト寸)⑩目
(訳 )輔 躍 蜘 農
﹄ 、吋
(
ゆO.
O> 山)9槍 釈 髄 裡 息 胆 @ 建 蝋 鴎註
凶 b
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(一〇.
O> 山)9 槍 梱 髄 裡 慰 謹 ゆ 建 蝋 ⋮
寸トN
凶 b
。ヨ
凶麟籠
凶 旺、
較
寸①㏄
トトN
無 串風寵蓮
騨 譲 歩 逃 函 思 姻 潔 團 役 巨R臆 N ロト K H容 ロ。
ト ゆむ 興 思 測脚 醸 餐 ︽赴 ム 心 .
N-一懸
18
⑩ .
O 判 一 .。う
ト .
O 刊 ① 。N
QO .
O 刑 ① .N
輔 習型黒痙＼
無 塑累黎
N .QON 判 O .〇一H
oO .○っ 一刊 O .oう9
一 .σうc測 制 ゆ .oo9
無型累罐
寸 .NN 刑 寸 .寸卜
卜 .QO 制 ① .O σっ
① 。QO 刑 N .O 。っ
ゆ .① 。う
無慰鯉 累置
曽 o。 .。う 一 刑
① .σq一 刑 c苅 .⑩O
﹃ 雪 制 O.
$
無 型累墨 樵艦
凶 b
。量
網 嘩 糾 聴 刑埋 軒 降 ボ
寸N
凶 bDヨ
凶餐能
凶 旺較
QO N
寸N
無團掘趣
勲 醸 恒 廻 葭 思 無 理 黒 e 翌 蜘 團穿飛ロR臆 N ロ ト K H 容 ロ。
トゆ赴 翼 思 樵 些 簾 掻 ︽ 葦 お 心 .
。・∴ 艦
19
(
型 臣漁踏 測 猟 "祠Ψ穏
翼 刷叩田帳理 ⋮姻 伽階) 刷鴉劇團皿e 皿 皿 ト製 ㍉二捌・
嶽 O 邦 U心
燵 姻 珠 輔凹日 来 掴
.
Hーゴ凶
20
第4節
本 実 験 結 果 か らleg区
び 胚 盤 胞 発 生 率(P〈0,01)は
考
察
の 卵 子 成 熟 率(P〈0.05)、
卵 割 率 お よ
対 照 区 に 比 べ 有 意 に 高 か っ た 。宮
田[17]は
、本 研 究 と 同 様 のP4を
用 いIVM開
始0時
間 目 か らP4
をlug添
加 した 培 地 で 培 養 し 、 体 外 受 精 後 の 胚 発 生 を 調 べ た
と こ ろ 胚 盤 胞 発 生 率 が 高 か っ た と 報 告 し て い る 。 川 島 ら[13]
は ブ タ 体 外 成 熟 に お い て 、FSHを0∼10時
間 目 、 お よ びLHを
20∼40時
間 目 に 添 加 し た 区 に 比 べ 、FSH、E2を0∼10時
FSH、E2お
よ びP4を10∼20時
子(以
間 目 、LH、P4お
よび 上 皮 成 長 因
下EpidermalGrowthFactor;EGF)を20∼40時
に 添 加 し た 区 の 方 がIVF後
間 目 、
間 目
の 胚 盤 胞 発 生 率 が 有 意 に 高 か っ た
と 報 告 して い る。 本 研 究 と は 用 い た 動 物 お よ び 添 加 物 質 な ど
の 条 件 は 異 な る が 、 対 象 の 動 物 に お け る ホ ル モ ン や 成 長 因 子
の 体 内 分 泌 環 境 を モ デ ル に して 添 加 物 を 添 加 して い る とい っ
た 点 で は 共 通 し た 培 養 方 法 と い え る 。川 島 ら[13]お
究 の 結 果 か ら 、 卵 子 を 培 養 す る 際 、P4添
よ び 本 研
加 が ウシ 生 体 内 環 境
と適 合 して 卵 子 成 熟 の 促 進 と受 精 後 の 胚 発 生 に 影 響 して い る
こ と が 示 唆 さ れ た 。
21
卵 子 成 熟 期 の 卵 丘 細 胞 で は 、 コ レ ス テ ロ ー ル 合 成 に よ るP、
産 生 が 行 わ れ て い る[26]。
生 体 内 のP4産
生 機 序 と して 、卵 丘
細 胞 に お い て グ ル コ ー ス が 解 糖 系 に よ り変 換 さ れ た ピ ル ビ ン
酸 か ら 、 ペ ン トー ス リ ン 酸 系 に よ る グ ル タ ミ ン 酸 シ ン タ ー ゼ
(以 下NADPH)を
[26]。
補 因 子 と し て コ レ ス テ ロ ー ル が 生 産 され る
生 産 さ れ た コ レ ス テ ロ ー ル は 、 卵 丘 細 胞 に お け るP4合
成 に 用 い ら れ る[25、34]。Yamashitaら[33]は
ブ タ 卵 子 に お
け る コ レ ス テ ロ ー ル 合 成 に 関 与 す る 酵 素 を コ ー ドす る 遺 伝 子
発 現 を 検 出 し た 結 果 、 卵 丘 細 胞 で は 、FSHとLH依
存 的 に い ず
れ の 遺 伝 子 発 現 も 有 意 に 上 昇 す る と報 告 して い る。 さ ら に 、
マ ウ ス に お け る マ イ ク ロ ア レイ 解 析 に お い て も 、 コ レス テ ロ
ー ル 合 成 に 関 わ るHmgcr
、CYP51お
よ びDHCR14と
い っ た 遺 伝
子 発 現 が 卵 丘 細 胞 で 排 卵 期 に 上 昇 す る こ とが 報 告 され て い る
[10]。Yamashitaら[33]は
こ れ ら の 発 現 酵 素 の 役 割 を 追 求 す
る 目 的 で 、 数 種 類 の 酵 素 抑 制 剤 を 用 い た 実 験 を 行 っ た 結 果 、
ブ タ 卵 子 のP4合
成 量 の 有 意 な 低 下 と減 数 分 裂 再 開 の 遅 延 が
認 め ら れ 、 ま た 、 こ の 遺 伝 子 発 現 の 抑 制 は 培 地 中 へ のP4添
加
に よ り解 除 さ れ る こ と か ら 、 新 規 に 合 成 さ れ た コ レ ス テ ロ ー
ル はP4へ
と 変 換 さ れ 、卵 丘 細 胞 を オ ー トク ラ イ ン 的 に 刺 激 す
る こ とが 卵 子 の 成 熟 に 必 要 で あ る と報 告 し て い る。 さ ら に 、
22
卵 子 は 成 熟 過 程 に お い て 、 第 一 減 数 分 裂 前 期 で 卵 丘 細 胞 か ら
細 胞 質 に 分 泌 さ れ る 減 数 分 裂 再 開 抑 制 因 子 で あ る環 状 ア デ ノ
シ ン ー リ ン 酸(以
下cAMP)に
期 へ と 進 み 、cAMPの
よ り 、 分 裂 を 一 時 停 止 し てMI
分 泌 が 始 ま る と卵 丘 細 胞 の 膨 化 が 起 こ る
[5]。 卵 丘 細 胞 が 膨 化 し ギ ャ ッ プ 結 合 が 消 失 す る と 、卵 母 細 胞
内 のcAMPが
行 き 渡 ら な く な り 、減 数 分 裂 が 再 開 さ れ る 。 そ の
後 卵 子 の 核 の 成 熟 が 促 進 さ れ 、MH期
本 研 究 の 結 果 か らIVM開
始10時
よ り 、 穎 粒 層 細 胞 に お け るFSHの
へ と 成 熟 す る 。す な わ ち 、
間 目 にP4を
添 加 す る こ と に
受 容 体 を 発 現 さ せ 、FSHに
よ る 卵 子 成 熟 を 促 す こ と に な る の で は な い か と考 え ら れ た 。
本 研 究 の 結 果 か ら 、 品 質 の 良 い 未 成 熟 卵 子 はIVM開
10時
間 目 ま で はFSH添
加 培 養 液 で 培 養 し て 、 卵 子 をMI期
で 成 熟 さ せ 、 そ の 後 、P4を
添 加 し た 培 養 液 に 移 し20時
で 培 養 し 、 卵 丘 細 胞 を 膨 化 さ る 。IVM開
cAMPの
始 か ら
始 後5∼10時
ま
間 目 ま
問 目で
分 泌 を 途 絶 さ せ る こ と で 減 数 分 裂 を 再 開 さ せ 、MII期
ま で 成 熟 し た と 考 え ら れ た 。し た が っ て 、本 研 究 の 結 果 か ら 、
P4添
加 区 は 生 体 内 に お け る ホ ル モ ン 分 泌 に 近 い 環 境 を 体 外 で
も 再 現 し た こ と に よ り卵 子 成 熟 が 促 進 し 、 受 精 す る 確 率 が 高
く な り胚 発 生 へ と 反 映 し た と 推 察 さ れ た 。
IVM培
地 へ のP4添
加 に よ る 胚 盤 胞 の 内 細 胞 塊 数 、 栄 養 膜 細
23
胞 数 お よ び 総 細 胞 数 に 差 は な か っ た 。正 常 な 着 床 、受 胎 に は 、
胚 盤 胞 に 占 め る 内 細 胞 塊 の 割 合 、(総
が 重 要 で あ り[24]、
細 胞 数/内
細 胞 塊 数 比)
こ の 値 か ら胚 の 品 質 を あ る 程 度 判 断 す る
こ と が 可 能 と され て い る 。 一 般 に ウ シ 体 外 受 精 胚 に お け る総
細 胞 数/内
細 胞 塊 数 比 は7日
目 の 拡 張 胚 盤 胞 で2,5∼4、
総 細 胞 数 は 報 告 に よ り 差 は あ る も の の120前
[14、31]。
ま た
後 と され て い る
しか し 、 体 外 受 精 胚 や 核 移 植 胚 な どの 体 外 培 養 胚
で は 総 細 胞 数 お よ び 総 細 胞 数/内
細 胞 塊 数 比 が 大 き く異 な る
こ とが 多 く 、 こ れ ら の 値 に 近 け れ ば 体 外 培 養 胚 に お い て も 体
内 受 精 胚 に 近 い 品 質 と 判 定 し う る 根 拠 と な っ て い る[24]。
研 究 の 総 細 胞 数/内
細 胞 塊 数 比 は 対 照 区 、lug区
の そ れ ぞ れ で2.9、2.9お
よ び3.1で
本
お よ び5ug区
、全 て の 区 に お い て 上 記
の 範 囲 内 で あ る こ と か ら 、 本 研 究 の 胚 の 品 質 は 概 ね 良 好 で あ
っ た と 推 察 さ れ た 。 ま た 、 各 区 の 総 細 胞 数 は 対 照 区 、lug区
お よ び5ug区
の そ れ ぞ れ で108.5、103.0お
大 き な 差 が な い こ と が 示 さ れ 、IVMに
よ び110.6で
お け るP4添
あ り
加 は 胚 の 品
質 に 悪 影 響 を及 ぼ さ な い こ とが 示 唆 され た 。
以 上 よ り 、 ウ シIVMで
は 培 養 開 始10時
間 目 にP4をlug添
加 す る と卵 子 成 熟 率 、 卵 割 率 お よ び 胚 盤 発 生 胞 率 に お い て 高
い 値 を 得 ら れ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 ま た 、P4添
24
加 お よ び
無 添 加 のIVMを
行 い 、 体 外 受 精 後 に 得 られ た 胚 の 細 胞 数 に 差
は な か っ た 。
25
敏 " 駁 凶e 簾 怪 串 風 潟誌 ロ ト K H 容 ロQ
卜
OωO ■
5⊆O
.
N∴
区
♂〆
曳 甦 〆
25
①=
Φ=O
/
第5節
本 研 究 で は 、 ウ シIVM時
要
約
の 培 養 条 件 の 改 善 に よ る 体 外 受 精 胚
の 発 生 率 向 上 を 目 的 と し 、IVM培
地 へ のP4添
加 が 卵 子 成 熟 、 胚
発 生 お よ び 胚 の 品 質 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討
し た 。
実 験 に は 食 肉 処 理 場 由 来 卵 巣 か ら 採 取 し たCOCを
はTCM-199を
基 本 液
5ug/ml添
加
と し 、IVM開
し た 。P4添
を 設 け 、20時
よ び5ug区
間IVMを
よ び
ま たP4無
添
行 っ た 。そ の 後 、
間 媒 精 を 行 っ て 作 出 し た 体 外 受 精 卵 を 発 生 培 養 液 に
CRlaaを
5u1と
間 目 にP4を1お
加 濃 度 別 に1μ9お
加 を 対 照 区 と し て 計3区
18時
始10時
用 い 、IVM
用 い て 培 養
し た 。 な お 、 培 養 液 量 は 受 精 卵1個
し た 。 受 精 卵 の 培 養 は9日
日 目 に 卵 割 率 、 お よ び9日
間(媒
精 日 を0日
目)行
目 に
し た 。
が 対 照 区 に 比 べ 有 意 に 高 か く(P〈0.05)、
卵 割 率 は 対 照 区 に 比 べlug区(P〈0.01)お
よ び5ug区(P〈0.05)
が 有 意 に 高 か っ た 。胚 盤 胞 発 生 率 はlug区(P〈0.01)お
区(P〈0.05)が
い 、3
目 に お け る 胚 盤 胞 発 生 率 、7日
胚 盤 胞 以 上 に 発 育 し た 胚 を 用 い て 細 胞 数 を 測 定
卵 子 成 熟 率 はlug区
あ た り
対 照 区 に 比 べ 有 意 に 高 か っ た 。P4添
お け る 細 胞 数 の 差 は 認 め ら れ な か っ た 。
27
よ び5ug
加 の 有 無 に
以 上 の 結 果 よ り 、 ウ シIVMに
をlug添
お い てIVM開
始 後10時
間 目 にP、
加 す る と 卵 子 成 熟 率 、卵 割 率 お よ び 胚 盤 胞 発 生 率 に お
い て 高 い 値 を 得 られ る こ とが 明 ら か と な っ た 。
28
第 皿章
総
括
ウ シ 生 体 内 で は 、LHサ ー ジ 開 始24∼30時
血 中 プ ロ ジ ェ ス テ ロ ン(P4)濃
度 はLHサ
間 後 に 排 卵 す る。
ー ジ 開 始 か ら4∼5時
間 後 に 著 し く 上 昇 し 、6∼10時
間 後 に 最 高 値 と な る 。発 情 期 の
P4平 均 値 は お よ そ0.79ng/mlで
、LHサ
お よ そ1.1ng/mlと
起 す るLHサ
ー ジ 開 始6∼10時
間 後 は
平 均 値 に 比 べ 高 い 値 で あ る。 卵 子 成 熟 を誘
ー ジ の 開 始 に 伴 うP4濃
度 上 昇 は 、P4が
卵 子 成 熟 と
密 接 な 関 係 に あ る こ と を 示 し て い る。 本 研 究 で は 、 発 情 卵 胞
内 のP4濃
度 を 模 倣 し 、IVMを
問 目 にP4を
行 っ て い る 卵 子 をIVM開
始 後10時
添 加 した 培 地 に 移 し換 え 、 そ れ が 卵 子 成 熟 、 体 外
受 精 後 の 胚 発 生 お よ び 胚 の 品 質 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し
た 。
ウシ体 外 成 熟 培 養 に お け るプ ロ ジ ェ ス テ ロ ン添加 が
卵 子 成 熟 お よび 胚 発 生 に及 ぼ す影 響
本 研 究 で は 、体 外 成 熟 培 養 液 に0.02AU/ml卵
(FSH)お
よ び5%子
こ れ にP4を0、1お
ウ シ 血 清(CS)を
よ び5μg/ml添
添 加
加
29
胞 刺 激 ホ ル モ ン
し たTCM-199を
し た 培 地 でCOCsを
用 い 、
培 養
し 、
計3区
で 試 験 を 行 っ た 。IVM後20時
調 べ 、 媒 精 日 を0日
間 目 に お け る 卵 子 成 熟 率 を
と し て2、3日
目 に 卵 割 率 お よ び9日
け る 胚 盤 胞 発 生 率 を 調 べ た 。ま た7日
目に お
目に 胚 盤 胞 期 以 上 に 発 育
し た 胚 を 用 い 、胚 盤 胞 の 細 胞 数 を 測 定 し た 。 ウ シIVM培
P4を 無 添 加 、1お
よ び5pg/ml添
子 成 熟 率 を 表1-1に
加 し た と き のIVM20時
示 し た 。 卵 子 成 熟 率 は 、1μg区
比 べ 有 意 に 高 く(P〈0.05)、5ug区
IVF後3日
1-2に
目 の 卵 割 率 お よ び9日
間 後 の 卵
が 対 照 区 に
は 対 照 区 と差 が な か っ た 。
目 に お け る 胚 盤 胞 発 生 率 を 表
示 し た 。 卵 割 率 は 対 照 区 に 比 べlug区
0.01)、5ug区
養 液 に
が 有 意 に 高 く(P〈
は 対 照 区 と 差 が な か っ た 。 胚 盤 胞 発 生 率 は 、1μg
区 お よ び5ug区
が 対 照 区 に 比 べ 有 意 に 高 か っ た(P〈0.01お
びP<0.05)。IVF後7日
目 の 胚 盤 胞 の 細 胞 数 を 表1-3に
よ
示 し た 。
い ず れ の 区 間 に も 差 は 認 め られ な か っ た 。 以 上 の 結 果 よ り、
ウ シIVM培
地 へ10時
問 目 にP4をlug/ml添
加 す る と 、胚 の 品 質 に
は 影 響 を 及 ぼ さ な い も の の 、 卵 子 成 熟 率 、 卵 割 率 お よ び 胚 盤
胞 発 生 率 の 向 上 に 効 果 あ る こ と が 示 さ れ た 。
本 研 究 の 結 果 か ら 、 体 外 成 熟 培 養 液 にP4を
た 場 合 、P4無
添 加 し て 培 養 し
添 加 の 培 養 よ り も 有 意 に 高 い 卵 子 成 熟 率 お よび
胚 発 生 率 を 得 られ た こ と か ら 、 有 効 な 培 養 方 法 で あ る こ と が
示 さ れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、P4を
30
添 加 し たIVMは
今 後 の 体 外
受 精 技 術 に お い て ウ シ に 限 らず 、 他 種 の 家 畜 で も有 効 的 に 活
用 で き る培 養 方 法 と な る 可 能 性 が 考 え られ た 。
31
謝
辞
本 研 究 を 遂 行 す る に あ た り、 ウ シ 卵 巣 の 提 供 に ご協 力 い た
だ きま した北 海 道 畜 産 公 社 道 央 事 業 所 早 来 工 場 、 北海 道 早 来
食 肉 衛 生 検 査 所 、 な らび に 凍 結 精 液 の 提 供 に ご協 力 い た だ き
ま し た ジ ェ ネ テ ィ ク ス 北 海 道 の 方 々 に 心 よ り感 謝 申 し 上 げ ま
す 。 ま た 、 終 始 ご指 導 賜 りま し た 酪 農 学 園 大 学 大 学 院 家 畜 繁
殖学
堂地
修 教 授 、動 物 生 殖 工 学
今井
伝学
上 田純 治 教 授 な ら び に ご 協 力 い た だ き ま した 家 畜 繁 殖
学 ゼ ミ生 各 位 に 心 よ り感 謝 申 し上 げ ま す 。
32
敬教授、家畜遺
1)
Anderiesz
C, Ferraretti
recombinant
human
and murine
C. 2000.
gonadotrophins
oocyte
embryonic
A, Magli
meiosis,
development
Effect
on human,
bovine
fertilization
in
vitro.
of
and
Hum. Reprod.
15:1140-1148.
2)
51**
,
J01
Aa L A-R..
%7iur
3)
Craig
A' N..
B G, Oliphant
J,
nuclear
in
and
Modulation
Eyestone
{*Ahk
463-471.
a)t-;
1
Ti`).
Capacitation
Biol.
Reprod.
Leptin
maturation
protein
kinase
of Rabbit
12:260-274.
enhances
via
oocyte
the
pathway.
145:5355-5363.
of
cumulus-oocyte
6)
G. 1975.
cytoplasmic
N, Lawrence
maturation
.
Zhu H, Dyce PW. 2004.
Endocrinology
Dekel
gp
vitro.
mitogen-activated
5)
b g[]
A n.
Spermatosoa
4)
2011.
A
.
Brackett
It
cell
TS,
to
complex
Gilula
cell
communication
and the
by LH. Dev.
W H and First
NB, Beers
Biol.
regulation
in
the
of oocyte
86:356-362.
N L. 1986.
33
WH. 1981.
A study
of
the
8-
to
16-cell
developmental
cultured
7)
in
Ge HS,
Huang
chorionic
does
vitro.
XF,
block
Theriogenology
Zhang
improve
during
the
potential
patients
polycystic
with
Steril.
of
rate
r=P Iv
,
maturation
oocytes
syndrome.
from
Fertil.
{ :::
k.
2007.'3
.
EI=I
M
9)
. 3:73-74.
Hernandez
complexes
G I,
. 2007.m-
Gonzalez
during
Rh
AA-3
,5'. .
profiles
exhibit
immunelike
,
7X
expression
cells
human
and
immature
2:30-31.
cells
to
89:98-103.
8)
10)
152
in vitro
ovary
embryos
Exposure
maturation
developmental
bovine
25:
W. 2008.
gonadotoropin
not
in
R I,
of
cumulus
ovulation
a diverse
functional
Shimada
activities
multipotential?
cells
reveal
array
Mol.
M. 2006.
of
Gene
oocyte
that
neuronal
cumulus
: Are
and
these
Endocrinol.
20:1300-1321.
11)
Ikeda
S, Ichihara-Tanaka
K, Azuma T. 2000.
34
Effects
of
midkine
oocytes
12)
on
Reprod.
Ikeda
S,
Yamashita
porcine
for
Kitagawa
J.
Kawashima
vitro
maturation
of
deveropmental
bovine
competence,
63:1067-1074.
A for
oocytes.
in
subsequent
Biol.
vitamin
13)
during
M,
Imai
H.
cytoplamic
Reprod.
I,
cumulus
appropriate
Noma N,
M.2008.
cells
related
maturation
in
to
of
that
and
of
bovine
Nishibori
FSH and/or
genes
vivo
of
Sequential
expression
ovulation
roles
51:23-35.
T,
Y, Shimada
The
maturation
Dev.
Okazaki
2005.
in
M,
exposure
LH is
of
critical
steroidogenic
impact
vitro.
and
oocyte
Reproduction.
136:9-21.
14)
Koo DB,
Kang
YK,
Son
Park
H,
DS,
allocation
cells
Reprod.
15)
FAA
of
in bovine
Choi
Lee
inner
YH,
KK,
cell
nuclear
Park
Han
JS,
Kim HN,
YM. 2002.
mass
and
transfer
Aberrant
trophectoderm
blastocysts.
67:487-492.
-. 2010.
44-. 67-78.---1
4 fL ffi s--Ii.
.,5'.
35
it
.
Oh KB,
IN J.iblftM
Biol.
16)
MarroCL,GronddahlC,MurrayA.
2004.Meiosis‐activatingsterolpromotesthe
metaphaseItometaphaseIItransitionand
preimplantationdevelopmentalcompetenceofmouse
oocytesmaturinginvitro,Biol.Reprod.
70:1458-1464.
17)
宮
田
佳
苗.2008.成
添
加
が
ウ
シ
卵
及
ぼ
す
影
響.酪
子
熟
培
養
液
へ
の
プ
ロ
ジ
ェ
ス
テ
ロ
ン
の
成
熟
な
ら び
に
体
外
受
精
後
の
胚
発
生
に
農
学
園
大
学
大
酪
農
学
部
酪
農
学
科
卒
業
論
シ
体
外
受
精
に
お
け
る
成
熟
培
養
液
文.228-232.
18)
宮
田 佳
苗.2010,ウ
へ
の
プ
ロ
ジ
ェ
ス
テ
ロ
ン
添
加
が
胚
発
生
に
及
ぼ
す
影
響
.酪
農
学
園
大
学
大
学
院
酪
農
学
研
究
科
酪
農
学
専
攻
修
士
論
文.
殖
細
胞
の
12-13.
19)
MoriT,NishimotoN,KohdaH.1983.
Meiosis‐inhibihngeffectsinvivoofantiserumto
progesteroneoffolicularovainimmaturerats
treatedwithgonadotropins.Endocrinol:Jpn.
30:593-599.
20)
岡
田 益
吉,長
濱
嘉
孝,中
辻
36
憲
夫.1998.生
発
3-; IL .
21)
Qiu
HB,
KH.
2008.
530-540.
Lu SS,
Ji
involved
in
in
acids
and
developmental
23)
beta
(mPR-
expansion
of
of
Steroids.
First
is
pig
Effect
cleavage
bovine
that
73:1416-1423.
NL. 1994.
on
M, Mori
by
zygotes
14:49-56.
MU6
jt
,
T. 2007.
cumulus
hormone
Online.
g
receptor
cumulus
vitamines
quality
circulating
24)
M, Lu
of free
and
in
vitro.
J.
72:434-437.
C, Shimada
oocyte
Zhang
maturation
,
rate
Sci.
Sato
to
vitro
CF, Jr.
XM, Lu YQ,
progestin
complexes.
Rosenkrrans
Anim.
tILK. * T .
Song
related
cumulus-oocyte
amino
KL,
Membrane
a ) :A protein
22)
#
cell
profile.
U1
AfAMZ.
EJ oft
to
Assessment
of human
morphology
and
Reprod.
BioMed.
2010.
)---G
14
H ---111U
.
32 :
13-17.
25)
Shimada
M, Terada
progesterone
synthesis
T.
2002.
production
in
cumulus
and
cells
37
FSH and
LH induce
progesterone
: a requirement
receptor
for
meiotictesumptioninporcineoocytes
.Biol.Reprod.
8:612-618.
26)
島
田
森
27)
28)
昌
之,山
崇
英
下
編.卵
泰
尚.2011.卵
子
子
学,818-827.京
京
都.
庄
司
圭
佑.2011.ウ
ェ
ス
テ
ロ
ン
添
加
が
胚
発
生
に
酪
農 …学
部
酪
農
学
科
卒
業
論
文.18-26.
シ
体
外
成
及
熟
ぼ
す
と 初
期
胚
の
代
謝
機
構.
都
大
学
学
術
出
版
会.
培
影
養
響
に
お
.酪
け
る
農
学
プ
園
ロ
大
ジ
学
TakahasiY,HisinumaM,MatsuiM,TanakaH,Kanagawa
H.1996.Deveropmentofinvitromatured/fertilized
bovineembryosinachemicallydefined
medium:lnfluenceofoxigenconcentrationinthegas
atmosphere.J.Vet.Med.Sci
29)
30)
友
金
生
殖
戸
の
31)
津
胚
.58:897-902.
弘.2010.生
殖
学.30-34.朝
川
発
倉
清,佐
生
促
藤
進
因
菜
穂
の
書
ホ
ル
モ
店,東
形
VanSoonA,BoerjanML,BolsPEJ
大
藤
英
明
編.動
管
上
皮
細
タ
学
紀
要(農
卵
学)13:39-44
,VanrooseG,Lein
A,CorynM,deKruifA.1997.Timingofcompaction
andinnercellallocationinbovineembryos
38
物
京.
子.1997.ブ
子.山
ン.佐
胞
由
来
.
producedinvivoaftersuperovulation.Biol.Reprod.
57:1041-1049.
32)
山
室
匡
史.2010.ブ
るCyclinB蓄
命
33)
科
学
研
究
タ
卵
母
細
胞
の
減
数
分
裂
過
程
に
お
け
京
大
学
大
学
院
農
学
生
士
論
文.4.
ト 体
外
成
熟
都
大
量
の
制
御
機
構1.東
応
用
動
物
科
学
専
攻
崇
英.2011.ヒ
科
積
博
YamashitaY,NishiboriM,TeradaT.2005.
Gonadotoropin-induceddelta14-reductaseanddelta
7-reductasegeneexpressionincumuluscells
duringmeioticresumptionofporcineoocytes.
Endocrinology.146:186-194.
34)
YamashitaY,ShimadaM,OkazakiT.2003.Production
ofprogesteronefromdenovo‐synthesized
cholesterolincumuluscellsanditsphysiological
roleduringmeioticresumptionofporcineoocytes.
Biol.Reprod.68:1193-1198.
35)
吉
田
仁
秋,島
田
昌
之,森
の
実
施
理
論.森
崇
学
学
術
出
版
都.
会.京
英
編.卵
39
子
学.443-449.京
Summary
Effect
of progesterone
medium
supplementation
on the
development
bovine
The objective
of this
progesterone
(IVM)
to develop
complexes
could
into
The
were
with
at 38.5°C
group;
to the
to investigate
the
competence
in vitro.
collected
without
5% calf
serum
in CRlaa
with
co-culture,
containing
5% CO2, 5% 02 and
rates
of MII,
(CS)
by the
and
at 10 h after
group).
0.02
the
AU mL 1
P4 was
start
The matured
ml-1.
zygotes
90% N2 for 9 days
of the
COCs
After
were
were
18 h of
cultured
in an atmosphere
(fertilization,
and
blastocyst
test.
Each
40
a local
5 µg mL-1 of P4: 5 µg
5% CS at 38.5°C
chi-square
from
of 5% CO2 in air.
presumptive
cleavage
of ovarian
for 20 h in TCM-199
5 x 106 sperms
the
oocyte
Cumulus—oocyte
obtained
matured
P4: control
of bovine
by aspiration
were
IVM medium
whether
to in vitro-maturation
(1 gg mL-1 of P4: 1 µg group;
gamete
analyzed
was
in an atmosphere
inseminated
The
affect
COCs
supplemented
culture
study
(2 to 6 mm in diameter)
abattoir.
added
embryos
blastocysts
(COCs)
follicles
FSH,
of IVM-IVF-IVC
(P4) supplementation
medium
of maturation
day 0).
formation
set
of cell
of
were
numbers
(mean
rate
± SE) was
in the
than
that
group
control
control
in the
was
significantly
group.
However,
numbers
among
supplementation
developing
the
higher
there
the
t-test.
(P<
group.
1 µg
was
in bovine
than
Further,
and
than
In
medium
embryo
41
those
5 µg
that
(P<
in
give
cultured
1 jig
in the
blastocyst
group
the
were
control
difference
conclusion,
in cell
timely
rise
MII
0.05)
in the
the
no significant
groups.
IVM
rate
0.05)
group
The
lower
cleavage
(P < 0.05)
in
rates
The
higher
5 µg
in
unpaired
was significantly
1 gg group.
and
rate
by the
group
significantly
group
formation
analyzed
to
in vitro.
P4
high
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