日大歯学 , Nihon Univ Dent J, 89, 131-138, 2015 子宮筋腫組織を用いた新たな癌の 野 本 翔 浸潤モデルの確立 太 日本大学大学院歯学研究科歯学専攻 （指導：大木秀郎 教授，小宮山一雄 教授，岩瀬孝志 専任講師） 要 旨： ヒ ト 子 宮 筋 腫 か ら 作 製 し た myoma disk で 3 次 元 器 官 培 養 シ ス テ ム を 確 立 し， 口 腔 癌 の epithelialmesenchymal transition（EMT）について検討した。ヒト口腔癌由来の HSC-3 細胞および Ca9-22 細胞，Ca9-22 細 胞の secretory leukocyte protease inhibitor 遺伝子を欠失させた NUSD-1 細胞を，myoma disk 上で 3，7 および 14 日間培養した。癌細胞の浸潤・増殖および EMT を組織学的に評価した。また，matrix metalloproteinase（MMP） の発現を RT-PCR と gelatin zymography で調べた。HSC-3 細胞，Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞は，培養 3 日 目で myoma 上に単層の上皮として観察された。しかし，HSC-3 細胞および Ca9-22 細胞は培養 7 日目で小集団を 形成し，myoma 内への浸潤を認めた。浸潤細胞は，keratin および vimentin 陽性を示し，活性型 MMP-2 および MMP-9 の産生を認めた。一方，NUSD-1 細胞は，myoma disk 内への浸潤は示さず，MMP-2 の産生を認めなかった。 その結果，口腔癌浸潤に EMT および MMP の関与が，また myoma disk を用いた 3 次元器官培養モデルが，浸潤・ 増殖およびメカニズム解明に有用であることが示唆された。 キーワード： 浸潤モデル，口腔癌，子宮筋腫，マトリックスメタロプロテアーゼ，EMT 緒 の細胞成分が欠落している。また，多くの腫瘍胞巣では 言 線維芽細胞が間質中で最も多い割合を占め，これらは myofibroblast としての性格を示し，cancer associated 腫瘍の浸潤および転移機構を解明するため，現在まで にさまざまな および fibroblast（CAF）と呼ばれる。CAF は ECM をはじめ， で実験モデルの作 製および病理組織学的検索が行われてきた 1-8） protease，growth factor，chemokine などを産生して 。その結果， 腫瘍の浸潤・増殖に多大な影響を与えている 12, 13）。 腫瘍細胞の浸潤・増殖時における形態学的変化に始まり， 腫瘍細胞へのマクロファージや NK 細胞などの細胞性免 本研究では，CAF と同様に myofibroblast が存在する 疫による抗腫瘍反応や，α -SMA や TNF などのサイトカ ヒト子宮筋腫の組織片を用いて，再現性があり，よりヒ イン発現による腫瘍浸潤に対する防御作用などについ トの生体内の環境に近い 3 次元器官培養モデルを作製し て，組織学的検討が行われ報告されている 9, 10） て口腔癌細胞の浸潤・増殖およびその機構を検討した。 。 口 腔 癌 の 浸 潤・ 増 殖 を 評 価 の す る た め に epithelial- 実験モデルでは，腫瘍細胞をヌードマウスに移植し，腫 瘍形成能や転移の動態などが検討されている。その結果， mesenchymal transition（EMT）14-18） お よ び matrix 腫瘍の増殖および浸潤は，腫瘍細胞自身の性状によるだ metalloproteinase（MMP）の 発 現 を 免 疫 組 織 化 学， けでなく，線維芽細胞および extracellular matrix（ECM） RT-PCR および gelatin zymography により検討した。 など微小環境の影響を受けていることが示された 8）。一 方， 材料および方法 実験モデルでは，Alt-Holland らはヒトの腫 瘍環境を再現すべく，腫瘍細胞の 2 次元培養モデルに変 1. 細胞株および培養 えて，腫瘍細胞を皮膚結合組織細胞上で培養して浸潤能 本研究にはヒト舌扁平上皮癌由来細胞株（HSC-3），ヒ を観察する 3 次元培養モデルを作製した 11）。さらに，線 ト歯肉扁平上皮癌由来細胞株（Ca9-22）および Ca9-22 細 維芽細胞を混入したⅠ型コラーゲンゲル上に腫瘍細胞を 胞の secretory leukocyte protease inhibitor（SLPI）発現 播種し，ヒトの間葉組織の mimic とした 3 次元の器官モ を欠失させた NUSD-1 細胞 19, デルが作製されて腫瘍の初期浸潤の検討が行われ の培養には，100 unit/ml ペニシリンと 0.1 mg/ml スト た 4, 6, 10）。腫瘍間質では，線維芽細胞は，腫瘍胞巣の形成， レプトマイシンを含む 10% FCS 加 RPMI-1640 培地を用 腫瘍の進展や制御に深く関与している。しかし，線維芽 いた。細胞は，通法に従って 5% CO2，37℃の環境で培 細胞を埋め込んだコラーゲンゲルでは，腫瘍微小環境を 養した。 充分に再現しているとはいえず，腫瘍胞巣でみられる他 （受付：平成 27 年 1 月 29 日） 〒 101 8310 東京都千代田区神田駿河台 1 8 13 131 20） を用いた。これらの細胞 2. 間反応させた。各ステップ間では，切片を PBS で 10 分 Myoma disk 調整 間，3 回洗浄した。発色にはジアミノベンジジンを用いた。 器官培養に用いる子宮筋腫組織片は，聖母病院産科（東 京都新宿区）で治療のため手術により摘出され，供与さ 発色後，ヘマトキシリンで核染色を施し，マリノールに れた。なお，本研究は日本大学医学部の倫理委員会の許 て封入した。 可（倫許 23-25）を得ている。 4. Gelatin zymography 法 3 次元器官培養システムの概略を第 1 図に示す。3 次 Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞を FCS 非添加 RPMI- 元器官培養に用いる myoma disk は子宮筋腫組織を生検 1640 培地で一晩培養した後，培養上清を 2000 rpm で 5 ト レ パ ン（KAI）で 直 径 8 mm に く り 抜 き， 作 製 し た。 分間遠心した。得られた培養上清と loading buffer（0.125 Myoma disk は 10% DMSO 加 RPMI-1640 培 地 に 浸 漬 M Tris-HCl buffer pH6.8, 4% SDS, 10% sucrose, 0.01% し，使用するまで−70℃で凍結保存した。 bromophenol blue; BPB） を同体積で混合し，1.0% gelatin 加 10% acrylamide gel を用いて電気泳動を行った。 は じ め に myoma disk を 37℃ の 温 浴 で 解 凍 後，10% FCS 加 RPMI-1640 培地に 1 時間，室温で浸漬した。次 泳動後，ゲルを 50 mM Tris-HCl buffer，pH7.4, 2.5% い で，myoma disk を ト ラ ン ス ウ ェ ル イ ン サ ー ト Triton X-100, 5 mM CaCl2, 1 mM ZnCl2 で 1 時間洗浄し （Corning）に 入 れ， 培 養 癌 細 胞 を 10% FCS 加 RPMI- て SDS を除去した。再びゲルを蒸留水で洗浄した後，反 5 4 応 溶 液（50 mM Tris-HCl buffer pH7.4, 5 mM CaCl2, 個）を myoma disk 上に播種した。一晩 CO2 インキュベー 1 mM ZnCl2）中で 37℃，一晩反応させた。反応後，ゲル タ ー 内 で myoma disk に 細 胞 を 付 着 さ せ た。 次 い で を 0.5% coomassie brilliant blue G250 で染色後，脱色 1640 培地で 7×10 個 /ml に調整し，その 50μl（3.5×10 myoma disk を取り出し，12 ウェルプレート内に置いた を行い写真撮影した。 ステンレス製グリッド上の無コーティングナイロンメッ 5. RT-PCR 法 シュ上へ移した。プレート内は myoma disk の基部が浸 1） 培養細胞から RNA の抽出 るまで培地を注入し，CO2 インキュベーター内で培養し RNA は RNeasy（Qiagen）を用いて通法に従って抽出 した。すなわち，培養細胞を PBS で洗浄した後，350μl た。培養の期間中，培地を 3 日目ごとに交換した。 3. の細胞溶解液を加え，シリンジと注射針で DNA を機械 組織学的および免疫組織化学的検索 培養 3，7 および 14 日目に myoma disk を，10% 中性 的に切断した。次いで，同量の 70% エタノールを加え， 緩衝ホルマリンで固定し，パラフィンに包埋した。連続 RNeasy column に入れて 10,000 rpm で 1 分間遠心した。 切片を 5μm の厚さで作製して組織学的検索に供した。 添付の buffer で column を 3 回洗浄した後，30μl の蒸留 組織学的検索には H-E 染色を施し，免疫組織化学的検索 水 で RNA を 溶 出 し た。 得 ら れ た RNA は 使 用 時 ま には抗 cytokeratin AE1/AE3（DAKO），抗 vimentin（ニ で−80℃で保存した。 チレイバイオサイエンス）の各一次抗体を用いた。切片 2） RT-PCR 法 を脱パラフィン後，0.3% H2O2 加メタノールで 30 分間反 上記で得られた RNA 1μg を，65℃で 5 分間加熱した 応させて内因性ペルオキシダーゼ活性を阻止した。続い 後，5 分 間 静 置 し， こ れ に RNase inhibitor（Takara） て，切片を 0.01 M クエン酸バッファー（pH6.0）中で 98℃ 1 u n i t，10× R T b u f f e r 1 μl，25 m M d N T P 2 μl， または 121℃で 20 分間加熱して抗原を賦活化した。非特 random primer および RAV-2 reverse transcriptase 異的反応のブロッキングは，切片に 10% 正常ブタ血清 / 0.5 U を含む混合液に加え，滅菌蒸留水で 10μl に調整し， PBS を加え，30 分間反応を行った。次いで，一次抗体を 42℃で 1 時間反応させた。その後，94℃で 5 分間加熱し 切片に加え，室温で 60 分間あるいは 4℃で一晩反応させ て反応を停止し，cDNA を得た。得られた cDNA 溶液 た。二次抗体は EnVision（DAKO）を用い，室温で 60 分 1μl に 対 し て，10×PCR buffer 10μl，sense お よ び 第 1 図 口腔癌器官培養システムの概略 132 子宮筋腫組織を用いた癌の浸潤モデル Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞は，myoma disk 培養 antisense primer 100 pmol，2.5 mM dNTP 16μl および Taq DNA polymerase（Takara）2.5 units を加え，滅菌 3 日目には，disk 表層に連続する一層の細胞が生着してい 蒸留水で 100μl に調整した後，サーマルサイクラーを用 た （第 2 図 A, D）。Myoma disk 培養 7 日目には，Ca9-22 い増幅した。PCR は denature：94℃ 1 分間，annealing： 細胞は disk 表層にほぼ連続して配列するようになり，一部 55℃または 60℃ 2 分間，extension：72℃ 3 分間のサイ で 2 ∼ 6 層程度の細胞の重層化がみられた （第 2 図 B，E） 。 ク ル を 25 ま た は 35 回 行 っ た。PCR-product は，1.6% しかし，上皮表層が口腔粘膜のような錯角化や正角化を agarose gel（Bio-Rad）で電気泳動を行い，エチジウムブ 示すような像は認めなかった。また，重層化部に顆粒細 ロマイドで染色後，写真撮影した。 胞も出現していなかった。Ca9-22 細胞は数十個の小集団 を形成して，disk 深部へ浸潤増殖する像を多数認めた（第 本 研 究 に 用 い た 各 primer の シ ー ク エ ン ス お よ び 2 図 B）。Myoma disk 培養 14 日目には，Ca9-22 細胞の product size を第 1 表に示す。 disk 深部への浸潤は，表層から連続性あるいは不連続性 結 果 1. に 浸 潤・ 増 殖 像 が 観 察 さ れ た（ 第 2 図 C）。 一 方， NUSD-1 細胞は myoma disk 培養 7 日目には，Ca9-22 細 Myoma disk 器官培養モデルの組織学的所見 Myoma disk には，組織学的に錯綜する筋線維芽細胞 胞とは異なった組織所見を示した。NUSD-1 細胞は disk および筋細胞と，細胞周囲に太いコラーゲン線維や好酸 表層で 3 層から 7 層の重層を示し，一部で上皮突起のよ 性マトリックスの形成がみられた。しかし，生細胞はみ うに disk 内へ突出する像を認めたが，浸潤増殖する所見 られなかった。 は観察できなかった。また，NUSD-1 細胞は表層で粘膜 上皮のように細胞が扁平化する像をみたが，錯角化や正 角化は示さなかった。また，厚く重層化した部において 基底層の形成や棘細胞のような豊富な細胞質などはみら 第 1 表 本研究に使用した primer 配列 れなかった（第 2 図 E）。Myoma disk 培養 14 日目には， 両細胞ともに 7 日目とほぼ同様な挙動を示したが，時間 の経過とともに細胞層はより重層化がみられた（第 2 図 F）。なお，HSC-3 細胞は，Ca9-22 細胞とほぼ同様な浸 潤増殖像を示した（データ示さず）。 免 疫 組 織 化 学 に お い て，myoma disk へ 浸 潤 性 の Ca9-22 細胞と非浸潤性の NUSD-1 細胞は keratin 強陽性 を示し，扁平上皮癌細胞であることが確認できた（第 3 第 2 図 ヒト口腔癌器官培養システムを用いた Ca9-22 細胞と NUSD-1 細胞 矢印は disk 深部へ不連続性に浸潤する腫瘍細胞を示す。 133 図）。癌細胞が，既存の脈管腔を介して浸潤する可能性 bp として確認されたが，NUSD-1 細胞では認められな も 考 え ら れ た こ と か ら， 連 続 切 片 を 用 い た keratin と か っ た。 ま た，MMP-9 遺 伝 子 発 現 は Ca9-22 お よ び vimentin の免疫組織化学で検討した。その結果，keratin NUSD-1 細胞の両方で PCR 増幅産物 359 bp として認め 陽性細胞の周囲には vimentin 陽性像を認めないことか られた（第 6 図）。 ら，HSC-3 細胞は脈管腔を介さずに浸潤していることを MMP-2 の gelatin zymography では，RT-PCR 法によ 確認した（第 4 図）。また，一部の胞巣では，HSC-3 細胞 る解析と同様に，Ca9-22 細胞培養上清でサイズ 62 kDa 自身が上皮間葉転換の指標である vimentin 陽性と細胞 に MMP-2 活性バンドを認めたが，NUSD-1 細胞では活 形態が多角形ないし紡錘形を示していた（第 5 図）。 性 バ ン ド を 認 め な か っ た（ 第 7 図 ）。MMP-9 の 活 性 は 2. Ca9-22 細 胞 培 養 上 清 で 活 性 型 MMP-9 を 認 め た が， Ca9-22 細胞および NUSD-1 細胞における MMP の発現 NUSD-1 細胞では非活性型のみであった。 MMP-2 遺伝子発現は Ca9-22 細胞で PCR 増幅産物 368 第 3 図 培養 7 日目の Ca9-22 細胞と NUSD-1 細胞の HE 染色と keratin 染色 第 4 図 HSC-3 細胞の myoma disk 内浸潤細胞の免疫染色 Myoma disk 内に keratin 陽性細胞の浸潤を認めるが（矢印），同部位の浸潤細胞周囲には vimentin 陽性像を認めない（矢印）。 134 子宮筋腫組織を用いた癌の浸潤モデル 考 察 癌 は， わ が 国 の 死 亡 原 因 の 第 1 位 を 占 め る 疾 病 で あ る 21）。癌細胞には高い浸潤能および転移能があり，これ らは予後を決定する重要な因子となっている。癌細胞の 浸潤と転移についてこれまで数多くの研究が行われてき た 1-8, 10-18, 22） 。本研究では口腔癌の初期浸潤のメカニズム を明らかにするために，ヒト myoma 組織を母床とした 3 次元器官培養法を試みた。その結果，培養 3 日目には ヒト myoma disk 上で口腔癌細胞が生着し，培養 7 日目 には myoma 組織内へ浸潤・増殖する像がみられ，本実 験モデルが癌浸潤と転移のモデルとして有用であること が示された。 これまでに，腫瘍の転移・浸潤機構を検索する方法に は，基底膜成分をコートしたメンブレンを用いて癌細胞 を培養し，メンブレンを通過した細胞数から細胞浸潤能 を測る方法や 23），コラーゲンゲル上に癌細胞を播種し浸 潤・増殖を観察する方法が用いられてきた 4, 24）。 しかし，これらの方法で用いられる基質はラットなど の動物から分離精製された純粋なコラーゲンのみであ り，より正常組織に近い検索条件の必要性が求められて いた。また，cadaver の皮膚組織から線維芽細胞を分離 してコラーゲンゲルに埋め込んだ母床を用いて 3 次元培 養を行い，口腔癌の浸潤を検討した報告もある 7）。これ らは に近い環境での 3 次元的な細胞の挙動，分 化，治療薬の効果，細胞とマトリックスの相互作用を で検索する方法として用いられている。しかし，ヒ ト腫瘍の微小環境を再現しているとはいえず，より生体 に近い 3 次元器官培養モデルの開発が求められている。 Nurmenniemi ら 6）はこのような 3 次元器官培養法の欠 第 6 図 RT-PCR 法による MMP-2 および MMP-9 の発現 M：φx174 Ⅲ 1：NUSD-1 細胞 2：Ca9-22 細胞 3：HSC-3 細胞 点を補う方法として子宮筋腫の切除組織を用いた方法を 報告している。子宮筋腫は良性腫瘍であり，1 検体から 第 5 図 HSC-3 細胞の myoma disk 内浸潤細胞の免疫染色 Myoma disk 内に浸潤した少数の keratin 陽性 HSC-3 細胞に vimentin 陽性を認める（矢印）。 135 第 7 図 Gelatin zymograhy による MMP-2 の発現 Pro MMP-2 : 非活性型 MMP-2 (72 kDa) Act MMP-2 : 活性型 MMP-2 (62 kDa) Pro MMP-9 : 非活性型 MMP-2 (92 kDa) Act MMP-9 : 活性型 MMP-2 (83 kDa) M : marker 多くの培養用 disk が得られる。また，筋腫組織には平滑 浸潤する癌細胞では EMT が起きているものと考えられ 筋由来の腫瘍細胞の他，多量のⅠ，Ⅱ，ⅢおよびⅣ型コ た。これらの結果から，本 myoma disk モデルを用いて ラーゲン，ラミニン，α -SMA，vimentin やマクロファー 簡便に癌細胞の EMT を 3 次元的に捉えることができた ジが存在することから，悪性腫瘍の転移機構を解明する ことは意味深く，今後さらに詳細な検討が必要である。 癌の転移の初期過程は，胞巣を構成する細胞同士の結 方法として非常に有用な方法であると考えられる。しか しながら，本方法を用いた報告はほとんどなく，また， 合を解除することから始まる。E-cadherin は catenin と 実験条件の厳密性が求められる。 複合体を形成することで上皮細胞間接着の機能を果たし 今回の実験に用いた口腔癌細胞株 HSC-3 細胞および ている。本来，癌細胞間は E-cadherin などの働きにより Ca9-22 細胞は，myoma disk 上で多層化し，myoma 組 強固に結合しており，容易には解離しないが，E-cadherin 織内への浸潤を示した。この結果は，今後このモデルを または catenin に変化が起こると細胞接着能が低下し， 応用して癌浸潤の促進因子あるいは抑制因子の解明や， 癌細胞が解離すると報告されている 28）。この作用を高め 治療応用への基礎的検討に役立つと考えられた。 る因子としては，TGF-βがよく知られている 12）。近年， 癌細胞が周囲組織への浸潤・増殖する際の癌細胞の生 乳癌由来の培養細胞や卵巣癌由来などの培養細胞を用い 物学的性状については，古くから検索されてきた。今日， て，SLPI に よ る 転 移 機 構 へ の 影 響 が 検 討 さ れ て い 組織の分化・成熟に関与する EMT の，癌細胞の増殖・ る 29-31）。Rosso ら 31）は乳癌由来 F3 II 細胞の培地に SLPI 転移への関与が注目されている 13-17, 25-27） を添加することで，同細胞の E-cadherin の発現低下や 。癌細胞が脱分 化し，間葉系の性質を得て遊走性を獲得した後に臓器へ β-catenin の核への移動などの局在変化を報告している。 転移すると，癌細胞が転移しない表現型へと変換して局 さらに卵巣癌由来 SKOV3 細胞や胃癌由来 SNU638 細胞 所へ定着すると考えられている。本研究で，myoma 組 の検索では，SLPI により MMP-2 および MMP-9 発現の 織 内 へ 浸 潤 す る 紡 錘 形 を 示 す 癌 細 胞 に keratin と 増加が報告され 29, vimentin の共発現をみたことから，本モデルにおいても 作用があることが知られている 32）。本検索で SLPI の発 136 30） ，EMT における TGF-βと同様な 子宮筋腫組織を用いた癌の浸潤モデル 3. 現を欠失した NUSD-1 細胞は，myoma の表層で重層し Ca9-22 細胞は，組織を破壊して myoma disk 内へ浸 潤した。 て myoma 内 へ の 浸 潤・ 増 殖 は 認 め な か っ た。 一 方， 4. SLPI を発現する Ca9-22 細胞や HSC-3 細胞では myoma Ca9-22 細 胞 の 浸 潤・ 増 殖 に は，MMP-2 と MMP-9 の関与が示唆された。 内への浸潤・増殖が認められ，これらの報告を裏付ける 以上の結果から，myoma disk を用いる 3 次元器官培 ものと考えられた。 養法は，口腔癌の浸潤・増殖のメカニズム解析に有用で ヒト口腔癌において，粘膜下結合組織に浸潤増殖する あることが示唆された。 ためには，上皮と結合組織との境界である基底膜を破壊 しなくてはならない 33）。基底膜は，Ⅳ型コラーゲンとラ 本研究遂行にあたり，格別たるご指導ご鞭撻を賜りました日本 大学歯学部口腔外科学講座の大木秀郎教授，同学部病理学講座の 小宮山一雄教授に謹んで心より感謝申し上げます。 また，本研究を通じ多大なるご協力と助言を賜りました本学部 病理学講座の岩瀬孝志専任講師を始め，同講座の皆様に深く感謝 いたします。 ミニンやヘパラン硫酸プロテオグリカンなどを基本構造 と し て い る。Sato ら 34） は 癌 の 浸 潤 増 殖 に 際 し て は， MMP-2 の他，MMP-9 および MMP-13 が活性化され，Ⅰ， Ⅱ，ⅢおよびⅣ型コラーゲン，ラミニン，フィブロネク チンなどの細胞外マトリックスなどの構成成分の破壊を す る こ と を 示 し た。 ま た， 臨 床 研 究 の 結 果 か ら も 本研究の一部は，JSPS 科研費 24593066 および日本大学歯学部 佐藤研究費（平成 25，26 年度）によってなされた。 MMP-2 の活性化と癌の浸潤・転移とが，正の相関を示 すことが認められている 35） 。 今回用いた myoma disk モデルにおいて，基底膜Ⅳ型 文 献 コラーゲンを分解するとされる MMP-2 と MMP-9 の関 1）Izumi K, Terashi H, Marcelo CL, Feinberg SE (2000) Development and characterization of a tissue-engineered human oral mucosa equivalent produced in a serum-free culture system. 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