1.8MB - Sigma

シグマアルドリッチ独自の
固相抽出のノウハウを伝授します！
© 2015 Sigma-Aldrich Co. LLC. All rights reserved.
固相抽出カラム（前処理）が必要な理由
matrix
・
analyte
膨大な量のマトリクスに含まれる、微量な分析対象物を測定するために
「前処理」という工程が必要
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固相抽出（Solid Phase Extraction）とは？
・液液抽出の代替手法
・液体クロマトグラフィーの一種
固相抽出カラムで、
膨大なマトリクスから分析対象物を・・・
 精製する
 濃縮する
→マトリクスを保持させ除去する
→分析対象物を保持させる
コンディショニング
サンプルロード
分析対象物溶出
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本日の内容
• コンディショニングの目的
- チャネリングの予防
- 充填剤間・フリッツの気泡を抜く
- 充填剤の活性化
• 自然落下を快適に使いこなすテクニック
- 通液速度と回収率の関係
- ディスポーサブルライナーの活用
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コンディショニングの目的
固相抽出カラムの性能を最大限に発揮するには？
→「コンディショニング」をしっかりと行うことが大切
・固相抽出カラムの洗浄
→ブランク低減
・チャネリングの予防
→充填剤と溶媒をしっかり接触させる
・充填剤間・フリッツの気泡を抜く
→通液速度の安定化
・充填剤（順相系）の活性化
→保持挙動の安定化
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コンディショニングの目的
-チャネリングの予防
固相抽出： C18
1g/6mL
左：コンディショニング無し
右：アセトニトリル5mL、
水5mL×2回でコンディショニング
チャネリング
サンプル：
アズレンスルホン酸ナトリウム水溶液
40mg/mLを2滴(うがい薬）を添加
コンデイショニング
無し
洗浄：水 5mL
コンデイショニング
有り
サンプルが均一なバンドを形成しないと、
適切なクロマトグラフィーが行えない
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コンディショニングの目的
-充填剤間・フリッツの気泡を抜く
カーボンの固相抽出カラムにヘキサンを流した
→通液速度・・・・・0.9mL/min
気泡が存在したので除去した
→通液速度・・・・・2.3mL/min
気泡除去により、通液速度は約2.5倍に
気泡
気泡の存在で通液速度が大幅に異なった。
この実験ではカラム出口付近に気泡があったため除去できたが、
充填剤間やフリッツ中の気泡は、どう対処するか？
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コンディショニングの目的
-充填剤間・フリッツの気泡を抜く
• 気泡を除去して、通液速度を安定化させる
• 固相抽出カラムごとの通液速度のバラツキを無くす
• 充填剤と溶媒・サンプルの接触効率を向上させ、負荷量を最大化する
ユニークな気泡の除去方法をご紹介します。
バキュームマニホールドが使用できる環境を
ご用意ください。
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コンディショニングの目的
-充填剤間・フリッツの気泡抜き
②コンディショニング溶媒を
固相抽出カラムに入れる
①必要な本数の固相抽出カラムを
バキュームマニホールドの
付属ラックにセットする
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コンディショニングの目的
-充填剤間・フリッツの気泡抜き
③付属ラックごと真空槽に入れる
④減圧する
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コンディショニングの目的
-充填剤間・フリッツの気泡を抜く
⑤減圧する
およそ30秒～1分間
細かい気泡が上昇
下部からも気泡が抜ける
充填剤とフリッツ中の気泡が、ほぼ完全に除去できる
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コンディショニングの目的
-充填剤間・フリッツの気泡を抜く
各コンディショニング方法による比較
固相抽出カラム：C18 1g/6mL
A
B
自然落下による通液速度比較
C
アセトニトリル 5mL通液時間
コンディショニング方法
Tube#1
Tube#2
A:マニホールド気泡除去
4m19s
4m17s
B:吸引法
3m51s
5m02s
C:加圧法
4m47s
5m06s
5ｍLアセトニトリルを用い、3つの方法でコンディショニングした後、
5ｍLアセトニトリルを自然落下で通液させその時間を測定
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均一である
ばらつきがある
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
シリカゲル 1g/6mL（同一ロットで保管条件が異なる２本を比較）
ヘキサン
3mL
ヘキサン
3mL追加
コンディショニング: n-ヘキサン 3mL
↓
サンプル: 200µL アズレン 2mg/mLヘキサン溶液
↓
溶出：n-ヘキサン 3mL × 2回
順相系充填剤では、活性度の違いが保持挙動に表れやすい
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
一般的な順相系固相抽出の
コンディショニング
ヘキサン
水
順相系ではヘキサンを流しても水分は除去できず、活性度は上がらない
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
順相系充填剤（シリカ・アルミナ・フロリジルなど）の
活性度を高く一定にするには？
・従来法
充填剤を130℃のオーブンで一晩乾燥させる
→カートリッジ充填されているカラムは、加熱不可能
→充填剤のみを乾燥させて、使用前にカートリッジへ充填する
・代替案
アセトン通液後、ヘキサンで平衡化する
第21回農薬残留分析研究会 1998年シリカゲルカラムの前処理効果
（財団法人残留農薬研究所、杉本、島村、小林、加藤）でも、一定した
活性度と固相抽出由来の妨害物質の低減化が可能との報告あり。
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
改良した順相系固相抽出の
コンディショニング
アセトン
ヘキサン
水
アセトンで水を除去することで、活性度を高く一定にする
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
水分測定
アセトンを流し溶出液を分画捕集した。
溶出液中の水分量をKarl Fisher水分測定
装置（電量法）で測定。
アセトン洗浄によるカラム中の水分除去
100,000
Mositure Content (ppm) in eluate
Ag ION 750mg/6mL
90,000
Alumina N 2g/6mL
80,000
DSC-NH2 1g/6mL
DSC-SAX 1g/6mL
70,000
DSC-SCX 1g/6mL
PSA 1g/6mL
60,000
LC-Florisil/LC-Si = 1g/1g/6mL
50,000
40,000
30,000
20,000
10,000
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Acetone Volume (mL)
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10
11
12
13
14
15
16
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
アセトンからヘキサンへの平衡化
アセトン-ヘキサン平衡化
アセトン洗浄後ヘキサンを流し、その溶出液
を分画捕集した。溶出液中のアセトン含有量
をHPLC-UVで測定。
Peak area of acetone in eluate
900,000
800,000
Ag ION 750mg/6mL
700,000
Alumina N 2g/6mL
DSC-NH2 1g/6mL
600,000
DSC-SAX 1g/6mL
500,000
DSC-SCX 1g/6mL
400,000
PSA 1g/6mL
300,000
200,000
100,000
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Hexane
Volume(mL)
Hexane Voume
(mL)
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45
50
55
60
65
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コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
90%
80%
Oil
Tube#1
#155
#10
#188
#202
70%
ヘキサン
コンディショニングのみ
#1
Biphenyl
#104
#3
#169
#209
Elution %
PCB異性体20成分を
Alumina N 1g/6mL で分画
#30
60%
#208
50%
#206
#54
#194
40%
#189
Tube#1とTube#2は
同一ロットで保管状況が異なる
#77
#37
30%
#126
20%
10%
0%
10
0%
0
1
2
3
4
5
6
8
9
10
11
12
13
Acetone
14
15
Elution Volume (mL)
#189
Biphenyl
80%
#1
#3
#10
#30
#194
70%
#188
#104
ヘキサン
コンディショニングのみ
#54
#126
50%
#77
#208
#169
#206
40%
Tube#2
#15
#37
#155
#202
#209
60%
Elution %
7
Hexane
Supelclean LC-Alumina-N
1g/6mL without acetone washing
90%
同一ロットだが、保管状況により
活性が変わったため
保持挙動にも影響があった。
#15
30%
20%
10%
0%
0
0
1
2
2
3
4
4
5
Hexane
6
6
7
8
8
Elution Volume (mL)
ヘキサン
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9
10
10
11
12
12
13
Acetone
14
14
15
溶出量(mL)
アセトン
19
コンディショニングの目的
-充填剤の活性化
90%
80%
Oil
Tube#1
#155
#10
#188
#202
70%
ヘキサン
コンディショニングのみ
#1
Biphenyl
#104
#3
#169
#209
Elution %
PCB異性体20成分を
Alumina N 1g/6mL で分画
#30
60%
#208
50%
#206
#54
#194
40%
#189
Tube#3は
アセトン-ヘキサンで
コンディショニング
#77
#37
30%
#126
20%
#15
10%
90%
0%
0
1
2
3
4
5
Hexane
6
80%
7
8
9
10
11
Elution Volume (mL)
12
13
Acetone
14
15
# 15
Oil
70%
#209
水分除去により活性が上がるため
保持は強くなる傾向にある
Elution %
60%
#77
#188
#202
#37
アセトン-ヘキサン
コンディショニング
#30
#155
50%
#208
Tube#3
#189
#104
#194
#1
40%
#126
# 10
#54
30%
#206
Biphenyl
#169
#3
20%
10%
0%
0
0
1
22
3
44
5
Hexane
6
6
7
8
8
Elution Volume (mL)
ヘキサン
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9
10 1 0
11
12 1 2 Acetone1 3 14 1 4
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溶出量(mL)
アセトン
20
自然落下を快適に使いこなすテクニック
固相抽出の使用における、様々な溶出方法
• 減圧吸引
- 迅速に作業できるが、液枯れの恐れあり
→液面監視が必要なため、多検体処理は困難
• 加圧方式
- この3つの中では最もデメリットが少ない。
→加圧させる専用器具が必要、多検体処理は困難
• 自然落下
- 最も簡便な方法で多検体処理も可能
- 気泡の影響により、溶媒の通液速度が安定しない
→マニホールドを使用した気泡除去で解決
- 溶出に時間がかかる
→ディスポーサブルライナーの使用で解決
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自然落下を快適に使いこなすテクニック
-通液速度と回収率の関係
回収率90%以上
Journal of Chromatography, 622 (1993) 53-60
通液速度は、1～2mL/min（約1～2滴/秒）程度が最適
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自然落下を快適に使いこなすテクニック
-ディスポーサブルラーナーを用いて通液速度アップ
ディスポーサブルライナーの活用
・マニホールドを使用した気泡除去後は
固相カラム毎の通液速度が均一になっている
・気泡除去後は、自然落下での溶出において
充填剤部の液枯れの心配がなく作業が容易
・さらに、ディスポーサブルライナーの接続で
通液速度をアップさせる
製品型番：57059
ディスポーサブルライナー
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自然落下を快適に使いこなすテクニック
-ディスポーサブルライナーを用いて通液速度アップ
ディスポーサブルライナーの長さと自然落下での通液速度
固相抽出カラム： Supelclean Sulfoxide 3g/6mL
Conditioning:
Acetone 5mL + 10mL → n-hexane 20mL
ディスポーサブルライナー(8cm)の接続で、通液速度は約2倍になった
ライナーの長さに比例して通液速度が変化するため調整も可能
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E-Mail: [email protected]
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