培養容器コーティング方法 - Sigma

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じっけんレシピ
細胞培養に必要な試薬など（培地以外）
細胞継代の際に使用する細胞剥離試薬と器具
＜トリプシン処理の一般的な方法＞
1. 培養シャーレやフラスコから培地を除去します。
2. 培地中の血清の影響をなくすために、PBS（－）で洗浄する。
3. 0.1～0.25％のトリプシン-EDTA 溶液を加え、全体にいきわたらせる。その後溶液を吸引し、37℃のインキュベータに
数分から 10 分ほど放置します。（細胞により放置時間は異なります。）
4. 顕微鏡で細胞を確認後、血清入りの培地を加え、ピペッティングにより細胞を分散させ、細胞を剥がします。
5. 細胞数を計算盤にて測定し、細胞の継代や保存に使用します。
製品名
製品番号
トリプシン-EDTA 溶液
T4049
形状
溶液
製品説明
25%のトリプシン、 2.5 g トリプシンと 0.2 g EDTA • 4Na
フェノールレッド含有、ろ過滅菌済み
（Trypsin-EDTA solution）
DPBS（－）
D5652
粉末
（ダルベッコリン酸緩衝生理
D8537
溶液（ｘ1）
食塩水、Dulbecco’s
D1408
溶液（ｘ10）
カルシウム、マグネシウム不含
Phosphate Buffered Saline）
＜血球計算盤＞
製品名
製品番号
製品説明
血球計算盤
Z359629
計測箇所が 2 箇所あります
血球計算盤カバーガラス取替用
Z375357
26 mm x 20 mm x 0.5 mm
カウンター
Z169021
製品番号：Z359629
製品名：Bright-Line™ 血球計算盤
計測方法につきましては、こちらをご参照ください。
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じっけんレシピ
＜トリプシン（酵素）を用いないで細胞を剥離する方法＞
細胞表面タンパク質の認識に依存する研究において有用です。強く接着した細胞には不向きです。
1.
全ての試薬を加温しておきます。
2.
培養容器から培地を除去します。
3.
PBS（－）などのカルシウム、マグネシウム不含バッファー溶液で洗浄します。
4.
下表の細胞剥離液を入れて（T-75 では 5ml）を加え、5～10 分間インキュベートします。
5.
培養容器を手の平で軽く叩いて細胞を剥離させ、培地を加えピペッティングを繰り返して細胞を剥がします。
製品名
細胞剥離液, 非酵素性 1×
製品番号
C1419
形状
溶液
製品説明
カルシウム、マグネシウム不含
滅菌済み
ハンクス塩
滅菌済み
PBS
滅菌済み
ハンクス塩
滅菌済み
PBS
昆虫細胞培養試験済み
細胞剥離液, 非酵素性 1×
C1544
溶液
カルシウム、マグネシウム不含
昆虫細胞培養試験済み
細胞剥離液, 非酵素性 1×
C5789
溶液
カルシウム、マグネシウム不含
細胞培養試験済み
細胞剥離液, 非酵素性 1×
C5914
溶液
カルシウム、マグネシウム不含
細胞培養試験済み
＜細胞凍結方法および融解方法＞
上記の「トリプシン処理の一般的な方法」を参照して行いますが、以下に T-75 フラスコの場合につい
て記載します。
1.
古い培地を取り除きます。
2.
DPBS（製品番号：D8537）5mlで洗浄する
3.
フラスコに温めたトリプシン溶液 4～5ml を加え、全体にいきわたらせる。その後溶液を吸引し、37℃のイン
キュベータに入れ、数分ごとに細胞を観察し細胞が丸くなったらフラスコを軽くたたき、プラスチック表面か
ら細胞を剥がします。（細胞により放置時間は異なります。
）
4.
血清入りの培地を 5ml加え、ピペットで勢いよく洗い流して、15mlの遠心チューブ（製品番号：CLS430055）
に集め、氷上に置きます。
5.
計測用のサンプルを一部取り、残りを 100ｘg で 5 分間遠心分離して、細胞をペレット状にします。その間に
細胞数を計測します。
6.
遠心分離後のチューブから上清を除き、最終濃度が 1～2ｘ106 細胞/ml となるように 10％の DMSO などの細
胞凍結保護剤含有する 10-20％血清入り培地に再浮遊させます。
7.
細胞を凍結用バイアル（製品番号：CLS430661、CLS430659など）に分注し、凍結用容器（製品番号：C1562）
にバイアルを入れ、速度制御付きフリーザーがあれば－80℃までゆっくりと冷却し、－80℃で 1 晩放置し、
すみやかに液体窒素に入れて、保存する。
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じっけんレシピ
～細胞凍結保存液～
一般的には、最終濃度 5～10％のDMSO（製品番号：D2650を希釈）や最終濃度 5～20％のグリセロール（製品
番号：G2025を希釈）を使用します。
また、弊社から販売している調整済みの細胞凍結培地を下記に表にいたしましたのでご参照ください。
製品名
製品番号
製品説明
細胞凍結培地-グリセロール
C6039
血清を添加した MEM 培地に 10％グリセロール含有
細胞凍結培地-DMSO
C6164
血清を添加した MEM 培地に 10％DMSO 含有
細胞凍結培地-DMSO, 血清不含
C6295
メチルセルロース添加 MEM 培地に 8.7%の DMSO 含有
～使い捨てプラスチックピペット～
1ml（製品番号：CLS4485）、5ml（製品番号：CLS4487）、10ml（製品番号：CLS4488）、25ml（製品番号：CLS4489）
＜抗生物質＞
調整済みの溶液製品一覧
製品名
製品番号
製品説明
アラメチシン（Alamethicin）
A5361
5mg/ml の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
アンピシリン（Ampicillin）
A5354
100mg/ml の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
ブレフェルジン A（Brefeldin A）
B5936
10 mg/mL の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
カルベニシリン（Carbenicillin）
C1613
100 mg/mL のエタノールと水溶液、フィルター滅菌済み
シクロヘキシミド溶液
C4859
100 mg/mL の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
サイトカラシン D（Cytochalasin D）
C2618
5 mg/mL の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
サイトカラシン B
C2743
10 mg/mL の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
I3909
1 mM の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
P9620
10 mg/mL の水溶液フィルター滅菌済み
S0692
100 mg/mL の DMSO と水溶液、フィルター滅菌済み
S6942
1 mM の DMSO 溶液(100 μg/214 μL)、フィルター滅菌済み
トリコスタチン A（Trichostatin A）
T1952
5 mM の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
バリノマイシン（Valinomycin）
V3639
約 1 mg/mL の DMSO 溶液、フィルター滅菌済み
（Cycloheximide solution）
（Cytochalasin B ）
イオノマイシンカルシウム塩
（Ionomycin calcium salt）
ピューロマイシン
（Puromycin dihydrochloride）
スペクチノマイシン
（Spectinomycin）
スタウロスポリン溶液
（Staurosporine solution ）
その他の抗生物質はこちらをご参照ください。
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じっけんレシピ
細胞融解方法
1. 液体窒素からバイアルを取り出し、温浴中に浸しながら穏やかに攪拌し、細胞を完全に融解します。（約 1 分）
2. バイアルの内容物を 15～20ml の培地に加えた T-75 のフラスコなどに移し、インキュベートします。
大部分の細胞が接着した後（3～4 時間後）、培地を除去し新しい培地と交換します。
もし、凍結保護剤（DMSO など）に感受性のある細胞の場合には、15ml 遠心チューブに入れた新しい培地 10ml に融
解したバイアルの内容物を入れ、100ｘg で 5 分間遠心し、上清を除去後、細胞ペレットを新しい培地 15～20ml を加
えた T-75 のフラスコなどに移し、インキュベートします。
＜培養容器コーティング方法＞
用途や細胞によって最適な接着条件をお決めください。
1. ポリ-リシン（Poly-Lysine）5mg に滅菌水 50ml を加え、培養容器表面 25cm2 に対して溶液 1ml の割合で、無菌的に
コーティングします。容器を穏やかに揺らして、コーティングを均一にします。
2. 5 分後、吸引ろ過により溶液を除去し、滅菌水で洗浄後、2 時間以上乾燥させます。
ポリ-リシンは細胞膜上の陰イオンと培養容器表面上の接着因子が持つ表面陽イオンとの間の相互作用を促進しま
す。細胞によって Poly-Ｌ-lysine を消化してしまうものがあるので、その場合には Poly-D-lysine を使用します。
分子量は小さいと粘度がないから扱いやすい。分子量が大きいと粘度はあるので取り扱いにくいが、密度を高くでき
ます。
製品名
ポリ-D-リシン臭化水
製品番号
P7280
素酸塩（Poly-D-lysine
分子量
30,000
製品説明
アプリケーション
～粉状
上記参照
γ線滅菌済み
70,000
hydrobromide）
ポリ-D-リシン臭化水
P6407
素酸塩（Poly-D-lysine
70,000
～粉状
150,000
γ線滅菌済み
＞3000,000
粉状
上記参照
hydrobromide）
ポリ-D-リシン臭化水
P7405
上記参照
γ線滅菌済み
素酸塩（Poly-D-lysine
hydrobromide）
ポリ-L-リシン臭化水
P4707
素酸塩（Poly-L-lysine
70,000
150,000
素酸塩（Poly-L-lysine
hydrobromide）
25cm2 に 0.1mg/ml を 0.5ml 使用するこ
フィルター滅菌済とを推奨します。
み
hydrobromide）
ポリ-L-リシン臭化水
～溶液状（0.01％）
P4832
150,000
3000,000
～溶液状（0.01％）
25cm2 に 0.1mg/ml を 0.5ml 使用するこ
フィルター滅菌済とを推奨します。
み
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＜細胞の溶解＞
製品名
製品番号
セルリティック™ M（CelLytic™ M） C2978
製品説明
哺乳動物の培養細胞から全タンパク質を効率よく抽出する
ために調製された独自の界面活性剤です。
106~107 個の浮遊細胞に 125 μL 使用します。
セルリティック™ MT
C3228
（CelLytic™ MT）
哺乳動物の組織からタンパク抽出を効率的に行うための試薬で
す。
組織 1g に対し CelLytic MT 20 mL を使用します。
RIPA バッファー（RIPA Buffer）
R0278
細胞溶解とタンパク質可溶化を行うことができます。
50mM トリス溶液 (pH 8.0, 150mM NaCl, 1.0%Igepal CA-630、
0.5%デオキシコ-ル酸ナトリウム, 0.1%SDS 含有)。
その他の細胞溶解試薬につきましては、こちらをご参照ください。
＜プロテアーゼインヒビター＞
製品名
プロテアーゼインヒビターカクテル
製品番号
P8340
（Protease Inhibitor Cocktail）
製品説明
DMSO 溶液、哺乳類組織用
セリン、システイン、アスパラギン酸、アミノペプチダ-ゼ
の阻害に対して広い特異性を有するプロテア-ゼインヒビタ
-混合液です。
プロテアーゼインヒビターカクテル
P2714
（Protease Inhibitor Cocktail）
粉状、一般用
セリン、システイン、およびメタロプロテア-ゼの阻害に対
して広い特異性を有する水溶性プロテアーゼインヒビター
の混合です。
プロテアーゼインヒビターカクテル
（Protease Inhibitor Cocktail）
P1860
DMSO 溶液、200 倍になるように培養液に添加する。
セリン、システイン、アスパラギン酸、アミノペプチダ-ゼの阻害
に対して広い特異性を有するプロテアーゼインヒビター混合液で
す。
その他のプロテアーゼインヒビターカクテルにつきましては、こちらをご参照ください。
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＜キット製品＞
製品名
細胞増殖測定キット, MTT 法
製品番号
CGD1
製品説明
生細胞を分光光学的に測定するキットです。
（Cell Growth Determination Kit,
MTT 溶液は全培養液量の 10%で加えるため、1 キットあたりの
MTT based）
可能な試験回数は、培養容器や培養液量によって異なります。
グルタミン・グルタミン酸定量キット
GLN1
L-グルタミンおよび L-グルタミン酸の酵素的定量用キット
です。
測定範囲は、L-グルタミン酸が 0.056~0.56 mM で、L-グルタ
ミンが 0.14~1.4 mM です。
TOX1
ミトコンドリアの脱水素酵素により、細胞生存率の分光光度
測定を行うために使用されます。
MTT を非水溶性有色ホルマザン誘導体に変換し、これを酸性
イソプロパノ-ルで可溶化させます。約 1000 回分
TOX2
ミトコンドリアの脱水素酵素により、細胞生存率の分光光度測定
を行うために使用されます。
XTT を水溶性で有色のホルマザン誘導体に変換します。約
1000 回分
TOX4
ニュ-トラルレッドは生細胞内に取り込まれ、リソソ-ムに蓄
積されます。この色素を抽出し、取り込み量を分光光学的に
定量します。
約 1000 回分
TOX6
色素は細胞タンパク質に結合し、塩基で可溶化されます。
565 nm の波長で測定します。約 1000 回分
TOX7
LDH が NAD+を還元すると、テトラゾリウム色素が可溶性の有
色ホルマザン誘導体に変換されます。
490 nm の波長で測定します。
TOX8
色素は生体内還元を受けると酸化型(青色)が減少し、それと同
時に蛍光性の中間体 ( 赤色 ) が増加します。
600 nm の波長で測定します。
（Glutamine and Glutamate
Determination Kit）
In vitro 毒性アッセイキット
（MTT ベース）
In Vitro Toxicology Assay Kit
In vitro 毒性アッセイキット
（XTT ベース）
In Vitro Toxicology Assay Kit
In Vitro 毒性アッセイキット
(ニュートラルレッドベース)
In Vitro Toxicology Assay Kit
In Vitro 毒性アッセイキット
(スルホローダミン B ベース)
In Vitro Toxicology Assay Kit
In vitro 毒性アッセイキット
(乳酸脱水素酵素ベース)
In Vitro Toxicology Assay Kit
In vitro 毒性アッセイキット
(レサズリンベース)
In Vitro Toxicology Assay Kit
キット製品の一覧は、こちらをご参照ください。
細胞培養に関する内容はアメリカのWEBサイトにて公開しております。どうぞ、ご参照いただきますようよろしくお願
い致します。
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