IC16001 IC-MSによるメタボロミクスにおける有機酸

Application Note IC16001
IC-MSによるメタボロミクスにおける有機酸と
糖リン酸の分析
サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
キーワード
分析条件
イオンクロマトグラフィー、
IC-MS、質量分析計、メタボロミクス、有機酸、糖リン
イオンクロマトグラフ分析条件
酸、
解糖系
装置：
Thermo ScientificTM DionexTM
ICS-5000＋ RFICTM system
IC-MS
アミノ酸、糖、糖リン酸、有機酸、脂質類などの低分子量代謝物を網羅的に解析す
るメタボロミクスでは GC-MS、LC-MS、CE-MSなどが主な分析手法として用
分離カラム：
ガードカラム：
IC16001
いられています。
Application Note
はじめに
Thermo Scientific Dionex IonPacTM
AS11 -HC-4 µm（2×50 mm）
Thermo Scientific Dionex IonPac
AG11 -HC-4 µm（2×250 mm）
イオン交換カラムはアミノ酸、糖、糖リン酸、有機酸などのイオン性成分の分離
カラム温度：
30℃
に適していますが、電気伝導度検出器はイオンの選択性に乏しく、導電率を有さ
溶離液：
水酸化カリウム溶離液
溶離液ジェネレーターにより調製
ない化合物は検出が困難です。またイオンクロマトグラフィーでは溶離液に塩
時間（分）
を含む水溶液を使用するため、質量分析計との接続は難しいとされてきました。
このアプリケーションノートでは、
サプレッサー方式のイオンクロマトグラフ
IC-MS
−7 .0
1 .0
0 .0
1 .0
1 .0
1 .0
75 .0
100 .0
80 .0
100 .0
（IC）と質量分析計（MS）を直接接続した IC-MS により、
メタボロミクスのター
Dionex ICS-5000+ RFICTM system
ゲットの一部である有機酸と糖リン酸を分析する手法について紹介します。 Dionex IonPac AS11-HC-4µm
(2 x 50mm)
Dionex IonPac AG11-HC-4µm
(2 x 250mm)
30
GC-MS LC-MS CE-MS
イオンクロマトグラフと質量分析計の接続
ICと MSを接続する際に留意しなければならない点があります。
溶離液流量：
KOH
(
(mmol/L)
サプレッサー：
-7.0
1.0
MS
IC-MS
れ、問題が生じることがありますが、本法の
では溶離液に 0.0
1.0
1.0
1.0
含まれる塩をサプレッサーで除去することにより、溶離液を純 75.0 100.0
80.0
100.0
! 水に変換します。
" # $ % & ' ( ) このため、
* + , - 高濃度の塩を安定して除去すること
. / 0 1 2 3
0.20 mL/min. 注入量：
Dionex
AERS-500,
2mm
MS
MS
高濃度の不揮発性の塩を含む溶媒を MS
IC) に導入すると MSが汚
IC-MS
ができる高交換容量のサプレッサーの使用が必須となります。
IC-MS
25 µL
検出器：
また MSでのイオン化効率を上げるために、MSに導入する手前
図1に IC-MSシステムのフロー図を示します。
ESI
SIM
400
2.0 kV
2
N2
85psi
0 .20 mL/min
Thermo Scientific Dionex AERS 500、
2 mm
エクスターナルモード
25 µL
電気伝導度検出器
Thermo Scientific MSQ PlusTM 質量分析計
MSQ Plus
MS
MS
でアセトニトリルやメタノールなどの有機溶媒を添加する必要
MS
ICがあります。
1. IC-MS
質量分析計条件
0.2 mL/min.
イオン化法：
ESI ネガティブモード
検出モード：
SIM
メイクアップ溶媒：アセトニトリル 0 .2 mL/min
プローブ温度：
400℃
ニードル電圧：
2 .0 kV
コーン電圧：
図2 に記載
ネブライザーガス： N2ガス 85 psi
図1 ： IC-MS システムのフロー図
KOH濃度（mmol/L）
2
2
標準液と試料の調製
（PEP）、β -ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドナトリウム
塩（NAD）、β -ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型
標準液
二カリウム塩（NADH）、D-グルコース -6 -リン酸一ナトリウム
NADと NADH以外の標準液は超純水、NADと NADHの標準液は
塩（G6 P）、D-フルクトース -6 -リン酸二ナトリウム塩（F6 P）
4図2
5に上記標準液の
6 7
SIMクロマトグラムを示します。
10 %アセトニトリル水溶液で調製を行いました。糖リン酸の標
準液は次の試薬より調製しました。
試料調製
アセチルコエンザイム Aナトリウム塩（Acetyl-CoA）、DL-グリ
IC-MS用のサンプルは、すりつぶした豚レバーから Bligh-Dyer
セルアルデヒド三リン酸溶液（GAP）、D-フルクトース 1、6 -ビ
抽出法と限外ろ過により調製しました。限外ろ過膜には
スリン酸三ナトリウム塩水和物（FBP）、アデノシン5′-三リン
Amicon Ultra-0 .5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10
酸二ナトリウム塩溶液（ATP）、ジヒドロキシアセトンリン酸二
membrane（Merk Millipore）を使用しました。
ナトリウム塩（DHAP）、D-（−）-3 -ホスホグリセリン酸二ナト
図3に Bligh-Dyer抽出法の概要を示します。
リウム塩（3PGA）、L-2-ホスホグリセリン酸二ナトリウム塩水
和物（2 PGA）、ホスホエノールピルビン酸一カリウム塩
6,000
100,000
Cone Voltage:
50V
SIM:178-180
70,000
Cone
Voltage:40V
SIM:86-88
-10,000
35,000
40,000
Cone Voltage:
40V
SIM:116-118
60,000
40
Cone Voltage:
40V
SIM:132-134
Cone Voltage:
50V
SIM:258-260
RT=27.89
Cone Voltage:
60V
SIM:72-74
-2,000
-10,000
Cone Voltage:
70V
SIM:258-260
14
Cone Voltage:
40V
SIM:144-146
5,
-5,000
-5,000
18,000
Cone Voltage:50V
SIM:88-90
Cone Voltage:
50V
Cone Voltage:
30V
SIM:114-116
SIM:807-809
Cone Voltage:
20V
SIM:130-132
-10,000
60,000
Cone Voltage:
50V
SIM:184-186
Cone Voltage:
60V
SIM:184-186
Cone Voltage:
50V
SIM:190-192
Cone Voltage:
60V
SIM:190-192
Cone Voltage:
50V
Cone Voltage:
40V
SIM:166-168
Cone Voltage:
40V
SIM:168-170
RT=
-10,000
Cone Voltage:
60V
SIM:663-665
SIM:661-663
Cone Voltage:
50V
SIM:168-170
Cone Voltage:
70V
SIM:338-340
Cone Voltage:
60V
SIM:505-507
:1 mg/L
図
IC-MS による標準液の
SIMクロマトグラム
2.2 ：
IC-MS
SIM
/
= 1/2 600 µL
/
= 1/2 600 µL
3
/
200 µL
200 µL
200 µL
200 µL
(
)
/
有機酸、糖リン酸、糖、無機イオン
(
)
有機酸、糖リン酸、糖、無機イオン
(
)
超純水+サンプル
180 µL
超純水+サンプル
3.
180 µL 抽出法の概要
図3 ： Bligh-Dyer
(
))
(
(
3.
F6P
2PGA,3PGA
G6P
µS/cm
F6P
2PGA,3PGA
G6P
µS/cm
PEP
PEP
-
(
FBP
DHAP, GAP
FBP
ATP
DHAP, GAP
ATP
)
(
)
SIM
37.13 - 2PGA
37.13 - 2PGA
37.13 - 3PGA
SIM
SIM:184-186
SIM:184-186
SIM:184-186
37.13 - 3PGA
62.37 - ATP
62.37 - ATP
39.60 –
51.87 - DHAP
51.87
- DHAP
51.92
- FBP
28.72 –
51.92 - FBP
28.72 –
SIM:190-192
SIM:168-170
SIM:168-170
SIM:338-340
SIM:338-340
SIM:114-116
SIM:114-116
SIM:258-260
27.70 - F6P
27.70 - F6P
27.14 - G6P
SIM:258-260
SIM:258-260
27.14 - G6P
51.86 - GAP
23.49 –
51.86 - GAP
23.49 –
41.28 –
27.26: -
11.21 –
SIM:184-186
SIM:505-507
SIM:505-507
SIM:190-192
39.60 –
SIM:258-260
SIM:168-170
SIM:168-170
SIM:72-74
SIM:72-74
SIM:190-192
41.28 –
27.26: -
11.21 –
)
SIM:190-192
SIM:144-146
SIM:144-146
SIM:88-90
23.53 –
SIM:88-90
SIM:132-134
23.53 –
NADH SIM:663-665
SIM:132-134
NADH SIM:663-665
SIM:130-132
42.54 - PEP
42.54 - PEP
13.06 –
13.06 –
SIM:166-167
SIM:86-88
24.07 –
SIM:86-88
SIM:116-118
24.07 –
(
図4 ：レバー抽出物のクロマトグラム
4.
SIM:116-118
)
(
4.
SIM:130-132
SIM:166-167
)
3
3
親水性物質を含むメタノール /水混合層を、限外ろ過後 IC-MSに
注入しました。図 4に豚レバーサンプルの抽出物の電気伝導度
と SIMのクロマトグラムを示します。電気伝導度では多数の
ピークが出ており、すべてのピークの定性は困難ですが、いくつ
かのピークは MSQ Plusで定性することができました。
まとめ
Application Note IC16001
図3で示した Bligh-Dyer抽出法を用いて豚レバーより抽出した
IC-MSQ Plusにより解糖系の21種類の有機酸と糖リン酸の
定性を行うことができました。MSQ Plusではカラムで分離
できない成分を確認できるので、サンプルの前処理方法の確
認などに有効であると考えられます。しかしシングル四重極
質量分析計の分解能は未知成分の定性を行うには十分ではな
く、トリプル四重極や Orbitrapのような高分解能の質量分析
結果と考察
計がより適しています。
今回の検討では、IC-MSにより計23種の有機酸、糖リン酸および
グルコースの定性を試みました。図2の23成分のクロマトグラ
ムのうち、21成分を MSQ Plusで検出することができました。グ
ルコース -6 -リン酸（G6 P）とフルクトース -6 -リン酸（F6 P）
は同じm/z 259ですが、これらは陰イオン交換カラムで分離で
きているため、それぞれ別成分として定性が可能です。m/z 191
のクエン酸とイソクエン酸についても同様に定性が可能でし
た。一方、同じm/z 185の2 -ホスホグリセリン酸（2 PGA）と
3 -ホスホグリセリン酸（3 PGA）、
m/z 169のジヒドロキシアセ
トンリン酸（DHAP）とグリセルアルデヒド3リン酸（GAP）は、
今回の条件ではカラムで分離できなかったため、それぞれ定性、
定量することはできませんでした。また Acetyl-CoAと NADは
今回の方法では検出できませんでした。
MSQ Plusシングル
参考文献
1 . Dionex Corporation (now part of Thermo Fisher
Scientific). MS ApplicationGuide; Sunnyvale, CA.
2 . Dionex Corporation (now part of Thermo Fisher
Scientific). Determination of Common Anions and Organic
Acids Using Ion Chromatography-Mass Spectrometry.
Application Note 243 ; Sunnyvale, CA.
3 . Thermo Fisher Scientific. Determination of NADH and
NADPH Using Ion Chromatography and High Resolution
Accurate Mass Spectrometry. Technical Note 149 ;
Sunnyvale, CA.
Dionex ICS-5000 +
四重極質量分析計
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Inc. 無断複写・転載を禁じます。
2016 Thermo Fisher Scientific K.K.
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〒221-0022 横浜市神奈川区守屋町3 -9
E-mail : [email protected]
www.thermoscientific.jp
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