配偶子の超低温保存
超低温保存の意義
超低温保存の意義
卵子
初期胚
•
•
•
•
•
• 遺伝資源の保存（遺伝的な形質や特性変化の
防止）
• 感染、飼育管理上の事故の防止（疾病および遺
伝的汚染の防止）
• 飼育管理の省力化と経費節減
• 動物輸送の簡易化、長距離・国際間移動が容易
• 発情同期化が不要、余剰胚利用
雌性遺伝子資源（ハプロイド）の保存
感染、飼育管理上の事故の防止
余剰卵子の保存
放射線治療前などの妊孕性保存対策
加齢による妊孕性低下への対策
超低温保存の歴史
1949 Polge ニワトリ精子の凍結保存
1950～1970年代 家畜の凍結精液開発、実用化
1972 Whittinghamら マウス胚の凍結保存に成功
。
①ジメチルスルホオキシド（DMSO）の利用
②植氷処理による潜熱発生の防止
③緩慢冷却による胚細胞内氷晶形成を防止
1985 Rall and Fahy マウス胚のガラス化凍結
1986～ 改良ガラス化保存法の開発
ガラス化保存
傷害
凍結保存
1
℃
植氷
共晶点
冷却曲線（植氷あり）
過冷却
－4.5℃
氷点
－７℃
潜熱の放出
過冷却
－4.5℃
氷点
℃
冷却曲線（植氷なし）
－0.5℃／分
－25℃
液体窒素へ
固相
固相
液相
液相
固相
固相
液相
液相
hr
hr
等張液
細胞内凍結を避ける方法
耐凍剤浸漬直後
◎適正な冷却速度
• 植氷による過冷却防止
氷点－１℃ぐらいで過冷却を止める
• 耐凍剤（凍害保護物質）の添加
細胞内の蛋白と結合して水の移動を
穏やかにし、塩害を防止
• 脱水
氷晶を小さくする
融解後の生存性に影響する要因
◎細胞の要因
a. 細胞のサイズ
b. 細胞膜の性質
c. 動物種
d. 胚の発育段階
e. 細胞質内の脂肪滴
f. 卵子や胚の質
g. 細胞骨格
耐凍剤透過後
植氷
凍結操作
融解後の生存性に影響する要因
◎手法の要因
a. 超低温保存法
b. 凍害保護物質
c. 凍害保護物質の平衡
d. 冷却速度
e. 液体窒素中への投入温
度
f. 収容容器
g.
h.
i.
j.
凍害保護物質の希釈
操作する環境温度
融解もしくは加温の方法
実施者
2
凍害
•
•
•
•
•
•
•
塩害
最小容積
外部からの機械的圧迫
細胞膜・細胞内小器官の破壊
低温傷害
凍害保護物質の細胞毒性
浸透圧ショック
凍害保護物質（CPA)
細胞膜透過性
ジメチルスルホオキシド（DMSO）
エチレングリコール（EG)、グリセリン
プロパンジオール など
細胞膜非透過性
シュクロース、トレハロース、フィコール
ラフィノース など
凍害保護物質
① 低分子
② 中性物質
③ 低毒性
④ 低温で水溶性が高い
⑤ 高濃度の濃縮が可能
融解
目的
① 耐凍剤の除去
② 復水
手法
ショ糖の添加
脱グリセロールに伴う細胞の膨張が押 さえら
れ、細胞の負担が減少する。
空気中での保持
融解時の氷の移動による悪影響を緩和する
凍結胚の融解法
3
Vitrificationの実技
絹谷産婦人科 平岡原図
4