Kobe University Repository : Kernel Title 膀胱がんに対する制限増殖型アデノウイルスベクターを 用いた新規治療法の開発 Author(s) 寺尾, 秀治 / 長屋, 寿雄 / 後藤, 章暢 Citation 神戸大学医学部神緑会学術誌, 28: 70-71 Issue date 2012-08 Resource Type Departmental Bulletin Paper / 紀要論文 Resource Version publisher URL http://www.lib.kobe-u.ac.jp/handle_kernel/81006791 Create Date: 2015-02-01 助成研究報告 膀胱がんに対する制限増殖型アデノウイルスベクターを用いた 新規治療法の開発 兵庫医科大学 先端医学研究所 細胞・遺伝子治療部門 寺 尾 秀 治（平成13年卒，大学院，平成19年卒） 長 屋 寿 雄（広島大・薬，平成 8 年卒，札幌医科大大学院，平成14年卒） 後 藤 章 暢（産業医科大，昭和62年卒，大学院，平成 4 年卒） はじめに て CAR 及び CD46の発現量を調べた． 浸潤性膀胱癌は再発率が高く，予後も不良であるた め，より効果的な治療法が切望されている癌の一つで キメラ型細胞融解性アデノウイルスベクターの作製 ある．癌に対する遺伝子治療臨床研究において，欧米 腫瘍特異的プロモーターである MK プロモーター を中心として 5 型アデノウイルスベクター（Ad5）を の下流にアデノウイルス由来の E1遺伝子を繋いだ 用いた遺伝子導入法の開発が進んでいる．Ad5の接着 MKp/E1を作製した．その MKp/E1をアデノウイル のターゲット分子である CAR はタイトジャンクショ ス ベ ク タ ー Ad5も し く は Ad5の フ ァ イ バ ー ノ ブ を ンを構成するタンパク質であるが，正常細胞に比べて Ad35のファイバーノブに置換したアデノウイルスベ 膀胱癌では，その発現は低くなることが知られてお クター（Ad5F35）に導入することで，Ad5/MKp-E1 1） り ，癌に対する Ad5を用いた遺伝子導入効率低下の 及び Ad5F35/MKp-E1を作製した． 要因となっている．そこで，我々は RGD 配列や35型 アデノウイルスベクター（Ad35）のファイバーノブ （F35）を導入したキメラ型アデノウイルスベクター を作製し，アデノウイルスベクターによる CAR 非発 2,3） 膀胱癌細胞に対するキメラ型細胞融解性アデノウイル スベクターの抗腫瘍効果の検討 Ad5/MKp-E1及 び Ad5F35/MKp-E1を 膀 胱 癌 細 胞 現癌細胞株への遺伝子導入効率の改善に成功した ． 株及びヒト胎児腎細胞株に10 virus particles/cells の また，安全性の面から，癌細胞に遺伝子を特異的に 濃度で感染させ， 5 日後の殺細胞効果を Alamar blue かつ効率良く発現させるために，癌細胞内で特異的に assay により測定した．アデノウイルスを感染させ 活性化される腫瘍特異的プロモーターを用いた遺伝子 ていない細胞を100として，Ad5/MKp-E1感染群及び 治療法の開発も同時に行われている．我々は腫瘍特異 Ad5F35/MKp-E1感染群について Tukey 検定を用い 的プロモーターの一つであるミドカイン（MK）プロ て比較検討した． モーターに着目し，膀胱癌細胞株で細胞融解性ウイル （*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001） 4） スベクターの抗腫瘍効果を明らかにした ． 今回の研究で，我々は，膀胱癌に対して高い遺伝 結 果 子導入効率が期待されるファイバーノブ改変型 Ad5 膀胱癌細胞株における CAR 及び CD46発現の確認 ベクターに腫瘍特異的プロモーターである MK プロ 膀胱癌細胞株において5637，KK47細胞株では Ad5 モーターを組み合わせたキメラ型細胞融解性ベクター のターゲット分子である CAR の発現を確認できた を作製し，その抗腫瘍効果について検討を行った． が，T24，TCC-SUP では CAR を検出できなかった． 一方，Ad35のターゲット分子である CD46は全ての細 方 法 胞株において，その発現を観察することができた（図 膀胱癌細胞株における CAR 及び CD46発現の確認 1 ）． ヒト膀胱癌細胞株5637，KK47，T24，TCC-SUP 細 胞，コントロールとしてヒト胎児腎細胞株 HEK293細 キメラ型細胞融解性アデノウイルスベクターの作製 胞から細胞溶解液を作製し，ウェスタンブロット法に 遺 伝 子 組 換 え 操 作 に よ り， 表 1 の よ う な MK プ － 70 － 神緑会学術誌 第 28 巻 2012 年 図 1 膀胱癌細胞株での CAR および CD46のタンパク質発現 表 1 制限増殖型アデノウイルスベクターの構造 図 2 膀 胱癌細胞株での制限増殖型アデノウイルスベク ターによる殺細胞効果 なかったが，5637，KK47細胞では CAR タンパク質 を検出することができた．また，CD46 タンパク質は 今回用いた全ての細胞株で検出することができた．こ ITR: adenovirus inverted terminal repeat sequence, MKp: midkine promoter, pA: polyadenylation signal, F5: the fiber knob of adenovirus type 5, F35: the fiber knob of adenovirus type 35. れらの結果から，Ad35のファイバーノブを導入した ロモーターによって E1遺伝子の発現が制御される 本研究は再発率が高く予後も不良である浸潤性膀胱 ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク タ ー（Ad5/MKp-E1, Ad5F35/ 癌のより効果的な治療の開発に向けた基礎的研究と MKp-E1）を作製し，HEK293細胞を用いてそれらの なった． ベクターを大量に調製した． アデノウイルスベクター（Ad5F35）が広範囲の膀胱 癌細胞株に対して抗腫瘍効果を示すことがわかった． 謝 辞 膀胱癌細胞に対するキメラ型細胞融解性アデノウイル 本研究を行うにあたり，平成23年度の神緑会研究助 スベクターの抗腫瘍効果の検討 成金を賜りましたことを，前田盛会長ならびに神緑会 膀胱癌細胞株にアデノウイルスベクターを感染させ 会員の皆様へ心より深謝いたします． たところ，KK47細胞では，Ad5/MKp-E1と Ad5F35/ MKp-E1での違いを見出すことはできなかった．しか 文 献 し，5637，T24，TCC-SUP 細 胞 に お い て，Ad5F35/ 1 ） Sachs MD, Rauen KA, Ramamurthy M et al. MKp-E1の殺細胞効果は Ad5/MKp-E1と比較して有 (2002): Integrin alpha(v) and coxsackie adenovirus 意に上昇していた（図 2 ）． receptor expression in clinical bladder cancer. Urology, 60: 531-536. 考 察 2 ） Terao S, Acharya B, Suzuki T et al. (2009): 本研究では，ファイバーノブ改変型 Ad5による膀 Improved gene transfer into renal carcinoma cells 胱癌細胞に対する抗腫瘍効果について調べた．CAR using adenovirus vector containing RGD motif. 非発現細胞株である T24，TCC-SUP 細胞において， Anticancer Res, 29: 2997-3001. ファイバーノブ領域を改変したアデノウイルスベク 3 ） Acharya B, Terao S, Suzuki T et al. (2010): ター Ad5 （Ad5F35/MKp-E1）の抗腫瘍効果はファイ Improving gene transfer in human renal carcinoma バーノブ領域を改変していないアデノウイルスベク cells. Exp Ther Med, 1: 537-540. ター （Ad5/MKp-E1）に比べて有意に上昇している 4 ） Terao S, Shirakawa T, Kubo S et al. (2007): ことを明らかにした．感染効率の鍵となる細胞表面 Midkine promoter-based conditionally replicative の CAR，CD46の発現を膀胱癌細胞で調べたところ， adenovirus for targeting midkine-expressing human T24，TCC-SUP 細胞では CAR タンパク質を検出でき bladder cancer model. Urology, 70: 1009-1013. － 71 －
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