Code No.AF-1050、AF-1051 ヒスチジンタグタンパク質精製磁気ビーズキット使用説明書【目的・用途】【トラブルシューティング】ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製に使用できる磁気ビーズです。粒径 3m のトラブルタンパク質の収量が少ない均一なビーズ表面にニトリロ三酢酸を共有結合で固定化しており、ビーズを磁気ラックで集合させるため、バッチ法に比べ洗浄効率、回収効率が高く、高純度の分離が可能です。【特徴】 1） Ni-NTA キレート磁気ビーズによる高効率精製 2）均一なサイズのビーズで高洗浄効率・高回収率を実現 3）磁気ラックを用いると簡便な操作が可能【キット内容・保存方法】容量内容 AF-1050 AF-1051 磁気ビーズ 1mL 5mL 洗浄バッファー(2x) 50mL ー溶出バッファー 3mL ー開封後の使用保存方法期限 4℃ 1年精製の間にタンパク質が分解・劣化する磁気ビーズがチップやチューブに接着する非特異的な結合が多い Bradford や BCA の測定値が収量と合わない原因と対策いずれかの段階でサンプルをロスしている。各段階の溶液を SDS-PAGE にて確認してください。インキュベーションが不十分。インキュベーション時間、温度の最適な条件を検討してください。混合が不十分。ビーズとサンプルの混合はボルテックスまたは回転攪拌機を用いて十分行ってください。タンパク質分解酵素が働いている。低温(2-8℃)で精製を行ってください。また、適当なプロテアーゼ阻害剤をバッファーに加えてください。洗浄バッファー中の塩濃度を下げる(例：500mM 塩化ナトリウム)。また、Tween20 濃度を上げる(例：0.1%)。洗浄が不十分。サンプル結合後の洗浄回数を 3 回から 5 回に増やす。洗浄バッファーの Tween20 量を 0.1%まで増やす。洗浄バッファーを完全に除く。磁力が不十分。弊社磁気ラックを使用してください。溶出バッファーに含まれるイミダゾールは Bradford や BCA に影響があります。透析や希釈によって適切な条件を検討してください。 ※磁気ラック 1.5-2.0mL チューブ用(AF-1000)は別売です。【成分】洗浄バッファー：50mM リン酸バッファー(pH 7.4)、300mM 塩化ナトリウム、 0.02% Tween20(終濃度) 溶出バッファー：50mM リン酸バッファー(pH 7.0)、300mM 塩化ナトリウム、 500mM イミダゾール、0.1% Tween20 関連商品 ◎ SDS-PAGE 用分子量マーカー「XL-Ladder シリーズ」プレステインタイプはブロッティング後メンブレンでのバンド確認にも最適です。未着色タイプは His タグを付加しているので、抗 His 抗体使用時のポジコンに使えます。 Code No. 品名内容【磁気ビーズを使用する前に】 SP-2140 3-color Prestained XL-Ladder 3 色着色タイプ： 50 レーン分 <サンプルの準備> SP-2120 Prestained XL-Ladder Broad 青色着色タイプ： 50 レーン分ニッケル磁気ビーズのタンパク質結合容量は 100l あたり約 0.5mg です SP-2110 XL-Ladder Broad 未着色タイプ： 100 レーン分 (～35kDa)。また、サンプル量は 100l となるように調整してください。 ◎ 関連試薬 <バッファーの準備> 洗浄バッファーは 2 倍に超純水で希釈して使用します。1 サンプル当たりの使用量は洗浄バッファー6.9mL です。 Code No. 品名内容 BW-1010 PBS(20x) 500ml BW-1011 TBS(20x) 500ml その他各種プレキャストゲル、高速電気泳動槽等ご用意しております！ <磁気ビーズの洗浄> 1）磁気ビーズをピペッティングまたはボルテックスにより再懸濁し、100l を新しいチューブに移します。 2) 磁気ビーズが入ったチューブを磁気ラックにセットし、20-60 秒静置します。 3) 上清を除きます。 4) チューブを磁気ラックから外し、洗浄バッファー1mL を加え、撹拌します。 5) 2)～4)をさらに 2 回繰り返します。【基本プロトコール】 1）磁気ビーズの洗浄後、チューブを磁気ラックにセットし、洗浄バッファーを除きます。 2）サンプル 100uL、洗浄バッファー900uL を加えます。 3）室温、回転下で 30 分間インキュベートします。 4) <磁気ビーズの洗浄>のプロトコール 2)～4)を 3 回繰り返します。 5) 磁気ビーズを磁気ラックにセットし、上清を除きます。 6) 磁気ラックからチューブを外し、100l の溶出バッファーを加えます。 7) ピペッティングにより穏やかに再懸濁します。 8) 室温、回転下で 15 分間インキュベートします。 9) 磁気ビーズを磁気ラックにセットし、上清を回収します。 10) 6)～9)を繰り返します。※ ※ほとんどのタンパク質は最初の溶出で回収されます。必要であれば 2 回目の溶出を行ってください。詳しくはアプロサイエンスホームページをご覧ください。 ⇒ http://aproscience.com/