In vitro ヒトCYP誘導試験
ヒト凍結または非凍結肝細胞を用い、被験物質の代謝酵素誘導能を
評価します。
凍結肝細胞
方法
細胞播種
（細胞播種用
培地）
反応
（誘導剤含有
培養用培地）
（培養用培地）
• 4時間
基質代謝
誘導剤暴露
培地交換
•24～48時間
•48～72時間
• 培地は24時間毎に交換
• 培地は24時間毎に交換
評価内容
（基質含有培
養用培地）
分析
（LS/MS/MS）
•基質
• Phenacetin
• Bupropion
• Testosterone
• Diclofenac
• S-Mephenytoin
分子種
指標活性
陽性対照
① 酵素活性（LC/MS/MSで測定）
CYP1A2
Phenacetin O–deethylation
Omeprazole
② mRNA発現量
③ 蛋白発現量（Western blotting法）
CYP2B6
Bupropion hydroxylation
Phenobarbital
CYP3A4/5
Testosterone 6β-hydroxylation
Rifampicin
CYP2C9
Diclofenac 4’-hydroxylation
Rifampicin
CYP2C19
(S)-Mephenytoin 4’-hydroxylation
Rifampicin
結果
例： 誘導の特異性
薬物
薬物濃度
DMSO（溶媒対照）
－
Rifampicin （Rif）
10 μmol/L
Phenobarbital (PB)
500 μmol/L
Omeprazole (Ome)
50 μmol/L
β-Naphthoflavone (NF)
30 μmol/L
培養条件
暴露時間
37℃、5% CO2
72時間
25
① 酵素活性
150
CYP1A2
CYP3A4
Activity
(pmol/well/min)
Activity
(pmol/well/min)
20
15
10
100
50
5
0
② mRNA発現量
0
0.3
CYP1A2
Relative amounts of mRNA
normalized against GAPDH
Relative amounts of mRNA
normalized against GAPDH
0.4
0.3
0.2
0.1
0.2
0.1
0.0
③ 蛋白発現量
CYP3A4
0.0
CYP1A2
DMSO
CYP3A4
Rif
PB
Ome
NF
DMSO
CYP1A2→
Rif
PB
Ome
NF
CYP3A4→
β-actin→
β-actin→
非凍結肝細胞
・細胞は、海外業者より国内代理店を介して 購入しております。
・CYP1A2， CYP2B6，CYP3A4，CYP2C9，CYP2C19の評価が可能です。
Fresh human hepatocytes
結果
例： Rifampicin酵素誘導能についての検討
生成した6β-hydroxytestosterone
(µmol/L)
反応時間と代謝量の関係
60分反応で測定した酵素活性
4.5
8
6
10 µmol/L Rifampicin
4.0
0.1 vol% DMSO
3.5
(7.7)
( )内は誘導倍率
3.0
2.5
4
2.0
(2.8)
1.5
2
1.0
(1.0)
(1.2)
0.5
0.0
0
0
30
60
90
反応時間 (min)
120
0
0.1
1
Rifampicin (µmol/L)
10