(57)【要約】【課題】アルカリpH範囲で安定で、しかもアルカリ - jamstec

JP 2006-87401 A 2006.4.6
(57)【要約】
【課題】アルカリｐＨ範囲で安定で、しかもアルカリｐＨ領域に最適ｐＨを有する新規な
アルカリ性マンナナーゼ、その遺伝子、製造方法並びにアルカリ性マンナナーゼの各種用
途を提供する。
【解決手段】下記の理化学的性質を有するアルカリ性マンナナーゼ：
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
10
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N -ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3+
、 Fe
2+
、 Pb
2+
、 Zn
2+
（チ） SDS-PAGEによる分子量：約 50 kDa。
【選択図】なし
、 Hg
2+
、 Cd
2+
、及び Sn
2+
により阻害を受ける、
(2)
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の理化学的性質を有するアルカリ性マンナナーゼ：
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
10
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける、
（チ） SDS-PAGEによる分子量：約 50 kDa。
【請求項２】
下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなるアルカリ性マンナナーゼ：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置
換または付加してなるアミノ酸配列を有し、下記に掲げる少なくとも１つの理化学的特性
20
を有するタンパク質
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
30
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
【請求項３】
（ｂ）に示すタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列と９６％以上同一のアミノ酸
配列を有するものである、請求項２に記載するアルカリ性マンナナーゼ。
【請求項４】
下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からなるアル
カリ性マンナナーゼ：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
40
ェントな条件でハイブリダイズし、下記に掲げる少なくとも１つの理化学的特性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
50
(3)
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（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
【請求項５】
好アルカリ性中温菌の Bacillus属に属する微生物に由来する酵素である、請求項１乃至４
のいずれかに記載のアルカリ性マンナナーゼ。
【請求項６】
好アルカリ性中温菌の Bacillus属に属する微生物が、「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」
（受領番号 FERM AP-20226）である請求項５に記載するアルカリ性マンナナーゼ。
【請求項７】
10
下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質をコードするアルカリ性マンナナーゼ遺伝
子：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置
換または付加してなるアミノ酸配列を有し、下記に掲げる少なくとも１つの酵素学的特性
を有するタンパク質
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
20
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
【請求項８】
（ｂ）に示すタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列と９６％以上同一のアミノ酸
配列を有するものである、請求項７記載のアルカリ性マンナナーゼ遺伝子。
30
【請求項９】
下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡからなるアルカリ性マンナナーゼ遺伝子：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、下記に掲げる少なくとも１つの理化学的特性を有する
タンパク質またはその前駆体をコードするＤＮＡ
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
40
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
【請求項１０】
請求項７乃至９のいずれかに記載するアルカリ性マンナナーゼ遺伝子を含有する組み換え
ベクター。
50
(4)
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【請求項１１】
請求項１０に記載する組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形質転
換体。
【請求項１２】
宿主細胞が枯草菌である請求項１１に記載する形質転換体。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載する形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から下記の
理化学的特性を有するアルカリ性マンナナーゼを採取することを特徴とする、請求項１乃
至７のいずれかの新規アルカリ性マンナナーゼの製造方法：
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
10
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
20
【請求項１４】
微生物「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」（受領番号 FERM AP-20226）。
【請求項１５】
請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有する酵素組成物。
【請求項１６】
少なくとも請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼと界面活性剤を含有する
洗浄用組成物（但し、繊維製品洗浄用組成物を除く）。
【請求項１７】
少なくとも請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有する漂白処理用組
成物。
30
【請求項１８】
少なくとも請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有する繊維柔軟処理
用組成物。
【請求項１９】
少なくとも請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有するコーヒー抽出
物処理用組成物。
【請求項２０】
請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを用いて酵素処理を行う工程を有す
るマンノオリゴ糖の製造法。
【請求項２１】
40
請求項１９に記載する方法によって製造されるマンノオリゴ糖と生分解性プラスチックス
を含有する組成物。
【請求項２２】
請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼまたは請求項１５の酵素組成物を含
む地盤破砕剤。
【請求項２３】
請求項２１の地盤破砕剤を用いる井戸、温泉または石油の掘穿方法。
【請求項２４】
請求項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼまたは請求項１５の酵素組成物を含
む白水のスカム抑制剤。
50
(5)
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【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物に由来するマンナナーゼ、より詳細にはアルカリｐＨ範囲で安定でし
かもアルカリｐＨ領域に最適ｐＨを有する新規なマンナナーゼ（アルカリ性マンナナーゼ
）及びその遺伝子に関する。さらに本発明は、当該アルカリ性マンナナーゼの製造方法、
並びにその製造のために使用されるベクター及び形質転換体に関する。さらに、本発明は
当該アルカリ性マンナナーゼの各種用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
10
β -1,4-マンナナーゼ（ EC.3.2.1.78、本明細書では、単に「マンナナーゼ」という）マ
は、分子内に β -1,4-D-マンノピラノシド結合を有するホモ及びヘテロの β -D-マンナンで
あるマンナン、ガラクトマンナン、グルコマンナン等の主要骨格である β -1,4-D-マンノ
ピラノシド結合を加水分解し、一連のマンノオリゴ糖を生成する酵素である。マンナナー
ゼによって分解される上記各種のマンナンは、植物の細胞壁の主要な構成成分の一つであ
るヘミセルロースの構成要素である。従って、マンナナーゼは、食品、製紙、繊維、洗浄
に関わる分野に広く利用されている有用な酵素である。
【０００３】
このため、マンナーゼは従来から多数の研究者らによって研究されており、多くの微生
物から単離精製されている。例えば、糸状菌由来のマンナナーゼ〔非特許文献１∼３等〕
20
、放線菌由来のマンナナーゼ〔非特許文献４等〕、バチルス属（ Bacillus）に属する細菌
に由来するマンナナーゼ〔 (1)非特許文献５、 (2)非特許文献６、 (3)特許文献１、 (4)特許
文献２、 (5)特許文献３、 (4)特許文献４等〕などが良く研究されている。ここで Bacillus
属に属する細菌に由来するマンナナーゼに関して、上記 (1)には Bacillus stearothermoph
ilusに由来する分子量 162 kDa及び最適ｐ H 5.5∼ 7.5のマンナナーゼが； (2)には枯草菌（
Bacillus subtilis）に由来する分子量 38 kDa、最適ｐ H 5.5、最適温度 55℃ 及び等電点（
pI） 4.8のマンナナーゼが； (3)には Bacillus sp.に由来する分子量 37± 3 kDa、最適ｐ H 3
-8、及び pI 5.3-5.4のマンナナーゼが； (4)には好アルカリ性 Bacillus sp.に由来する分
子量 43 kDa及び 57± 3 kDa、及び最適ｐ H 8-10のマンナナーゼが；； (5)には Bacillus sp.
に由来する分子量 34± 10 kDa、及び最適ｐ H 7.5-10のマンナナーゼが； (6)には Bacillus
30
agaradhaerensに由来するマンナナーゼが；それぞれ記載されている。
【非特許文献１】 Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, 1976, 32, 2
99-316
【非特許文献２】 Acta. Chem. Scand., 1968, 22, 1924
【非特許文献３】日農化 , 1969, 43, 317； Biochem. J., 1984, 219, 857
【非特許文献４】 Agric. Biol. Chem., 1984, 48, 2189
【非特許文献５】 Appl. Environ. Microbiol., 56, 11, 3505-3510 (1990)
【非特許文献６】 World J. Microbiol. Biotechnol., 10, 551-555 (1994)；
【特許文献１】特願平 03-047076号公報
【特許文献２】特願平 08-51975号公報
40
【特許文献３】米国特許第 6,566,1143号
【特許文献４】米国特許第 6,440,911号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、アルカリ性ｐＨ範囲において安定性に優れ、且つ高いマンナナーゼ活
性を示す新規なマンナナーゼ、およびその遺伝子を提供することである。さらに本発明は
、当該アルカリ性マンナナーゼを効率よく生産する方法、並びに当該マンナナーゼの生産
に使用される発現ベクターや形質転換体を提供することを目的とする。さらに本発明は、
上記アルカリ性マンナナーゼの各種用途を提供することを目的とする。
50
(6)
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【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記特性を有するアルカリ性マンナナーゼを産生する能力を有する微生
物を得るべく、広く天然界を検索した結果、 Bacillus属に属するある種の新規微生物が上
記特性を有する新規のマンナナーゼを産生することを見いだし、さらに本発明者らは、当
該微生物が産生するマンナナーゼを遺伝子工学的手法により効率良く産生する方法の開発
に成功し、本発明の完成に至った。
【０００６】
すなわち、本発明は下記の態様を含むものである。
【０００７】
10
項１．下記の理化学的性質を有するアルカリ性マンナナーゼ：
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
20
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける、
（チ） SDS-PAGEによる分子量：約 50 kDa。
項２．下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質からなるアルカリ性マンナナーゼ：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置
換または付加してなるアミノ酸配列を有し、下記に掲げる少なくとも１つの理化学的特性
を有するタンパク質
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
30
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
項３．（ｂ）に示すタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列と９６％以上同一のア
40
ミノ酸配列を有するものである、項２に記載するアルカリ性マンナナーゼ。
項４．下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡによってコードされるタンパク質からな
るアルカリ性マンナナーゼ：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、下記に掲げる少なくとも１つの理化学的特性を有する
タンパク質をコードするＤＮＡ
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
50
(7)
JP 2006-87401 A 2006.4.6
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
項５．好アルカリ性中温菌の Bacillus属に属する微生物に由来する酵素である、項１乃至
４のいずれかに記載のアルカリ性マンナナーゼ。
10
項６．好アルカリ性中温菌の Bacillus属に属する微生物が、「 Bacillus sp. Strain JAMB
-602」（受領番号 FERM AP-20226）である項５に記載するアルカリ性マンナナーゼ。
項７．下記（ａ）または（ｂ）に記載するタンパク質をコードするアルカリ性マンナナー
ゼ遺伝子：
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、
（ｂ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置
換または付加してなるアミノ酸配列を有し、下記に掲げる少なくとも１つの酵素学的特性
を有するタンパク質
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
20
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
項８．（ｂ）に示すタンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列と９６％以上同一のア
30
ミノ酸配列を有するものである、項７記載のアルカリ性マンナナーゼ遺伝子。
項９．下記（ｃ）または（ｄ）に記載するＤＮＡからなるアルカリ性マンナナーゼ遺伝子
：
（ｃ）配列番号２に示す塩基配列を有するＤＮＡ、
（ｄ）配列番号２に示す塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジ
ェントな条件でハイブリダイズし、下記に掲げる少なくとも１つの理化学的特性を有する
タンパク質またはその前駆体をコードするＤＮＡ
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
40
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
項１０．項７乃至９のいずれかに記載するアルカリ性マンナナーゼ遺伝子を含有する組み
換えベクター。
50
(8)
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項１１．項１０に記載する組み換えベクターを用いて宿主細胞を形質転換して得られる形
質転換体。
項１２．宿主細胞が枯草菌である項１１に記載する形質転換体。
項１３．項１１または１２に記載する形質転換体を培地で培養し、得られる培養物から下
記の理化学的特性を有するアルカリ性マンナナーゼを採取することを特徴とする、請求項
１乃至７のいずれかの新規アルカリ性マンナナーゼの製造方法：
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲に最適ｐＨを有する、
（ハ）ｐＨ安定性： 40℃ 、 pH 7∼ 11、 30分の処理条件で 70％以上のマンナナーゼ活性を有
10
する、
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲に最適温度を有する、
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する、
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する、
（ト）金属阻害： Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、及び Sn
2 +
により阻害を受ける。
項１４．微生物「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」（受領番号 FERM AP-20226）。
項１５．項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有する酵素組成物。
項１６．少なくとも項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼと界面活性剤を含有
20
する洗浄用組成物（但し、繊維製品洗浄用組成物を除く）。
項１７．少なくとも項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有する漂白処理
用組成物。
項１８．少なくとも項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有する繊維柔軟
処理用組成物。
項１９．少なくとも項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを含有するコーヒー
抽出物処理用組成物。
項２０．項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼを用いて酵素処理を行う工程を
有するマンノオリゴ糖の製造法。
項２１．項２０に記載する方法によって製造されるマンノオリゴ糖と生分解性プラスチッ
30
クスを含有する組成物。
項２２．項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼまたは項１５の酵素組成物を含
む地盤破砕剤。
項２３．項２２の地盤破砕剤を用いる井戸、温泉または石油の掘穿方法。
項２４．項１乃至６のいずれかのアルカリ性マンナナーゼまたは項１５の酵素組成物を含
む白水のスカム抑制剤。
【０００８】
なお、本発明において「遺伝子」または「ＤＮＡ」とは、２本鎖ＤＮＡのみならず、そ
れを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含する趣旨で用
いられる。またその長さは特に制限されるものではない。従って、本明細書でいう「遺伝
40
子」または「ＤＮＡ」とは、特に言及しない限り、ゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃ
ＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）及び該正鎖に対して相補的な配列を有する１本鎖ＤＮ
Ａ（相補鎖、逆鎖）、並びに合成ＤＮＡが含まれ、さらに「遺伝子」にはＲＮＡも含まれ
る。また「遺伝子」または「ＤＮＡ」は、本発明の効果を保有する限りにおいて、コード
領域（シグナルペプチド領域を含む）以外に、例えば発現制御領域、シグナル領域、エキ
ソン、イントロンを含むことができる。
【０００９】
また、特に言及しない限り、本発明でいう「遺伝子」または「ＤＮＡ」には、特定の塩
基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」だけでなく、これらによりコードされるタ
ンパク質と生理学的機能が同等であるタンパク質（例えば、同族体、変異体または誘導体
50
(9)
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など、本明細書では「機能的同等物」ともいう）をコードする「遺伝子」または「ＤＮＡ
」が含まれる。本明細書では、かかる「遺伝子」または「ＤＮＡ」を、特定の塩基配列で
示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の「ホモログ」ともいう。かかる「ホモログ」とし
ては、特定の塩基配列で示される「遺伝子」または「ＤＮＡ」の相補鎖に対して、ストリ
ンジェントな条件で、ハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」または「ＤＮＡ」
を挙げることができる。例えば、同族体をコードする遺伝子（ホモログ）としては、本発
明の遺伝子の由来生物である Bacillus sp. strain JAMB-602以外の他の微生物に由来する
対応の遺伝子を例示することができる。
【００１０】
本発明でいう「酵素（アルカリ性マンナナーゼ）」または「タンパク質」には、特定の
10
アミノ酸配列で示される「酵素（アルカリ性マンナナーゼ）」または「タンパク質」だけ
でなく、これらと同等な生理学的機能を有する「酵素（アルカリ性マンナナーゼ）」また
は「タンパク質」（例えば、同族体、変異体または誘導体などの「機能的同等物」）が含
まれる。例えば、同族体（機能的同等物）としては、本発明の「酵素（アルカリ性マンナ
ナーゼ）」または「タンパク質」の由来生物である Bacillus sp. Strain JAMB-602以外の
他の微生物に由来する対応の「酵素（アルカリ性マンナナーゼ）」または「タンパク質」
を例示することができる。また、変異体（機能的同等物）には、天然に存在するアレル変
異体、天然に存在しない変異体、及び人為的に欠失、置換、付加または挿入等されること
によって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が含まれる。なお、かかる同族体や変異
体等の「機能的同等物」としては、特定のアミノ酸配列（配列番号１）で特定される酵素
20
（アルカリ性マンナナーゼ）またはタンパク質と、アミノ酸配列において少なくとも９６
％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以
上同一であるものを挙げることができる。
【００１１】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００１２】
（１）アルカリ性マンナナーゼ
本発明は、新規なアルカリ性マンナナーゼに関する。ここでマンナナーゼとは、マンナ
ン、ガラクトマンナン、グルコマンナン等の主要骨格である β -1,4-D-マンノピラノシド
結合を加水分解する活性を有する酵素であり、正式にはマンナンエンド -1,4-β -マンノ
30
シダーゼ（ EC3.2.1.78）と命名されるものである。別名 β -マンナナーゼ、または β -1,4マンナナーゼとも称される。
【００１３】
かかるマンナナーゼの活性の有無は、簡便にはマンナン成分を含む固体培地におけるハ
ロー形成の有無を目視で判断することによって行うことができる。被験試料中にマンナナ
ーゼが存在すれば、その培養に使用する固体培地中のマンナンが分解されて、当該固体培
地上にハローが形成される。特に制限されないが、後述する参考例の説明に従って行うこ
とができる。ここでマンナン成分としては、ローカストビーンガム（主要構成成分； [Dガラクトース： D-マンノース（ 1:4） ]）を好適に例示することができる。
【００１４】
40
また、マンナナーゼの活性の測定は、 3,5-ジニトロサリチル酸法 [G.L. Miller, Anal.
Chem., 31, 426-428 (1959)]に従って、基質（マンナン成分）の還元物の生成量を測定
することによって行うことができる。特に制限されないが、例えば、基質としてローカス
トビーンガム（主要構成成分； [D-カ゛ラクトース :D-マンノース（ 1:4） ]）を用いて、上
記 3,5-ジニトロサリチル酸法に従って、基質（ローカストビーンガム）還元物の生成量を
測定する方法を挙げることができる。その詳細は後述する参考例に説明する通りである。
【００１５】
本発明において「アルカリ性マンナナーゼ」とは、活性の最適ｐＨがアルカリ領域（ pH
8以上）にあるマンナナーゼを意味する。
【００１６】
50
(10)
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本発明が対象とするアルカリ性マンナナーゼとしては、下記（イ）∼（ト）の理化学的
特性を有するものを挙げることができる：
（イ）作用：マンナンまたは４糖以上のマンノオリゴ糖に作用して３糖以下の糖にまで加
水分解することのできる、エンド型のマンナナーゼ活性を有する,
ここで４糖より大きいマンノオリゴ糖としては、ローカストビーンガム、アイボリーナ
ッツ、コンニャクマンナン、グアガムなどを例示することができる。これらのマンノオリ
ゴ糖に対する本発明のアルカリ性マンナナーゼの相対活性は、好適にはローカストビーン
ガムを 100とした場合に、アイボリーナッツ約 60、コンニャクマンナン約 45、及びグアガ
ム約 30である。本発明のアルカリ性マンナナーゼは、２糖または３糖のマンノオリゴ糖に
対しては、 pH 9及び 40℃ で 24時間処理しても加水分解能を示さないものであることが好ま
10
しい。
（ロ）最適ｐＨ： pH 8∼ 9.5の範囲内に最適ｐＨを有する。好ましくは pH 8.5∼ 9.5の範囲
内、より好ましくは pH９前後に最適ｐＨを有する。
（ハ）ｐＨ安定性： pH 7∼ 11及び 40℃ の条件で 30分処理した場合に 70％以上のマンナンー
ゼ活性を有するか、 pH 11及び 4℃ の条件で 24時間処理した場合に 70％以上のマンナンーゼ
活性を有する。好適には pH 7∼ 11及び 40℃ の条件下で 30分処理した場合に 80％以上のマン
ナナーゼ活性を有するか、 pH 11及び 4℃ の条件で 24時間処理した場合に 80％以上のマンナ
ンーゼ活性を有するようなｐＨ安定性を有していることが望ましい。なお、ここで 70％以
上、好ましくは 80％以上のマンナナーゼ活性を有するとは、処理前のマンナナーゼ活性を
100％とした場合に、処理後のマンナナーゼ活性が処理前のマンナナーゼ活性の 70％以上
20
、好ましくは 80％以上保持されていることをいう。さらに、本発明のアルカリ性マンナナ
ーゼは、 pH 8∼ 11及び 40℃ の条件下で 30分処理するか、または pH 11及び 4℃ の条件で 24時
間処理した場た場合に、 80％以上、好ましくは 90％以上のマンナナーゼ活性を保持してい
るものであることが好ましい。
（ニ）最適温度： 60∼ 70℃ の範囲内に最適温度を有する。好ましくは 65℃ 前後に最適温度
を有する。
（ホ）温度安定性： pH 7.5、 60℃ 及び 30分間の処理条件、または pH 7.5、 55℃ 及び 2時間
の処理条件で 50％以上の活性を有する。
【００１７】
なお、ここで 50％以上のマンナナーゼ活性を有するとは、処理前のマンナナーゼ活性を
30
100％とした場合に、上記処理後のマンナナーゼ活性が処理前のマンナナーゼ活性の 50％
以上保持されていることをいう。
（ヘ）失活： 1 mMの N-ブロモスクシニミドの存在下、 pH 7、 40℃ で 30分間処理することに
よりマンナナーゼ活性が失活する。
【００１８】
なお、ここで「失活」とは、処理前のマンナナーゼ活性を 100％とした場合に、処理後
のマンナナーゼ活性が処理前のマンナナーゼ活性の 10％以下、好ましくは 5％以下となる
ことを意味する。より好ましくは上記処理によってマンナナーゼ活性が消失（ 0%）となる
性質を有するものである。
（ト）金属阻害： pH 7及び 40℃ の条件でそれぞれ 1mM濃度の Fe
+
、 Cd
2 +
、または Sn
2 +
2 +
、 Fe
3 +
、 Pb
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2
40
の存在下で 30分処理した場合、マンナナーゼ活性が阻害され、処理
前のマンナナーゼ活性（ 100％）の 40％以下、好ましくは 30％以下となる。
（チ） SDS-PAGEによる分子量：約 50 kDa。
【００１９】
かかる特性を有する本発明のアルカリ性マンナナーゼとして、好ましくは配列表：配列
番号１で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、本発明
のアルカリ性マンナナーゼは、かかる特定のアミノ酸配列を有するものに制限されず、そ
の機能的同等物であってもよい。ここで機能的同等物としては、配列番号１に示すアミノ
酸配列において１または複数個のアミノ酸配列が欠失、置換または付加してなるアミノ酸
配列を有し、前述する理化学的特性のうち（イ）∼（ト）の少なくとも１つを有するタン
50
(11)
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パク質を挙げることができる。好ましくは（イ）∼（ト）の理化学的特性のうち２つ以上
、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上を有するものであり、より好適には７
つの全てを有するものである。
【００２０】
上記機能的同等物としてより好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列とアミノ酸配
列において９６％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ま
しくは９９％以上の同一性を有し、且つアルカリ性のｐＨ範囲（ pH 8以上）で安定で、当
該アルカリ性ｐＨ範囲に最適ｐＨを有するタンパク質を挙げることができる。なお、２つ
の配列を対比した場合における配列の同一性は、当該配列間で同一であるアミノ酸数の、
全アミノ酸数に対する百分率で示される。
10
【００２１】
上記の原理に従い、２つのアミノ酸配列における配列の同一性は、 Karlin および Alts
chul のアルゴリズム [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 2264-2268 (1990)および Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 90, 5873-5877 (1993)]により、決定することができる。この
ようなアルゴリズムを用いたプログラムとしては、 BLASTプログラム [Altschul et al.,
J. Mol. Biol., 215, 403-410 (1990)]、及び当該 BLASTより感度良く配列同一性を決定す
ることのできる Gapped BLASTプログラム [Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402,
(1997)]
を挙げることができる。これらのプログラムは、例えば米国 National Center for Biotec
hnology Informationのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００２２】
20
また、本発明のアルカリ性マンナナーゼには、配列表：配列番号２で示される塩基配列
からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質、並びにその機能的同等物が含まれる。
ここで機能的同等物としては、配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列
からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡ（ホモログ）によ
ってコードされるタンパク質であって、且つ前述する理化学的特性のうち（イ）∼（ト）
の少なくとも１つを有するタンパク質を挙げることができる。好ましくは（イ）∼（ト）
の理化学的特性のうち２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上を有する
ものであり、より好適には７つの全てを有するものである。
【００２３】
なお、ここで配列番号２に示される塩基配列に対して相補的な塩基配列からなるＤＮＡ
30
とハイブリダイズする「ストリンジェントな条件」は、 Bergerと Kimmel (Guide to Molec
ular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol.152, Academic Press, San Dieg
o, CA, USA, 1987)に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温
度 (Tm)に基づいて決定することができる。例えば、ハイブリダイズ後の洗浄条件（いわゆ
るこれが「ストリンジェントな条件」）として、 6xssc (1xsscの組成； 0.15 M NaCl, 0.0
15 M クエン酸ナトリウム、 pH 7.0), 0.5% SDS, 5Xデンハート及び 100 mg/mlニシン精子 D
NA)を含む溶液にプロ -ブと共に 65℃ で８ ∼ １６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が
挙げられる（ Sambrookら、 Molecular Cloning-a Loboratory Mannual, 2
n d
ed.）。
【００２４】
なお、本発明のアルカリ性マンナナーゼは、本発明で開示するアミノ酸配列に基づいて
40
化学的または遺伝子工学的手法によって製造することができる。遺伝子工学的手法による
製造方法の詳細については、後述する。また、アミノ酸配列における改変は、当業界にお
いて既に公知な方法、例えば部位特異的変異導入法 [Current Protocols I molecular Bio
logy, edit. Ausubel et al., John Wily & Sons, Section 8. 1-8.5 (1987)]等を用いて
、改変しようとするアミノ酸配列に、適宜、置換、欠失、挿入、付加、逆位などの変異を
導入することによって行うことができる。
【００２５】
本発明のアルカリ性マンナナーゼは、上記特性を有するものであれば特にその由来を問
うものではないが、好ましくは Bacillus属に属する微生物に由来するものである。好まし
くは生育最適ｐＨがｐＨ９前後であり、生育最適温度が 36∼ 37℃ である Bacillus属に属す
50
(12)
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る好アルカリ性中温菌に由来する。かかる微生物の一例として、制限はされないが、その
16S rDNAの配列が、 Bacillus alcalophilusの 16S rDNAの配列と 95％以上 100％未満、好ま
しくは 96∼ 99％の範囲、より好ましくは 96.7％同一であるか、または Bacillus
pseudalc
alophilusの 16S rDNAの配列と 95％以上 100％未満、好ましくは 96∼ 99％の範囲、より好ま
しくは 96.3％同一性であるような微生物を例示することができる。
【００２６】
ここで、２つの配列における配列同一性は、前述するように、これらの配列間での同一
であるアミノ酸数の、全アミノ酸数に対する百分率で示される。またアミノ酸配列と同様
に、２つの塩基配列における配列同一性は、 Karlin および Altschul のアルゴリズム [Pr
oc. Natl. Acad. Sci., USA, 87, 2264-2268 (1990)および Proc. Natl. Acad. Sci., USA
, 90, 5873-5877 (1993)]により、決定することができる。
【００２７】
本発明のアルカリ性マンナナーゼを産生する、好アルカリ性の Bacillus属に属する微生
物として、好適には「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」（受領番号 FERM AP-20226）（以
下、「 JAMB-602株」ともいう）を挙げることができる。この微生物の特性を表１に示す。
【００２８】
10
(13)
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【表１】
10
20
30
40
【００２９】
50
(14)
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当該菌体（ JAMB-602株）は土壌から分離取得したものであり、 pH 9前後で良く生育する
好アルカリ性の Bacillus属細菌である。さらに当該 JAMB-602株は、 16S rDNA塩基配列に基
T
づく相同性解析の結果、 Bacillus alcalophilus（ DSM485 ）と 96.7%の相同性を、また Ba
T
cillus pseudoalcalophilus（ DSM8725 ）と 96.3％の相同性を有しており、これらの菌体
と近縁種のものではあるが、 DNA-DNAハイブリダイゼーション分析から、 JAMB-602株と上
記 B. alcalophilus及び B. pseudoalcalophilus とはそれぞれ 12.4%及び 11.2%の相同性し
か見られなかった。このことから本発明菌体（ JAMB-602株）は、 Bacillus属に属する新種
の微生物である。当該本発明菌体を、「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」（略称： JAMB-6
02株）と命名して、平成１６年９月２４日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地
１中央第６に住所を有する独立行政法人産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、
10
寄託者が付した識別のための表示を「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」とし、受領番号を
「ＦＥＲＭＡＰ−２０２２６」として寄託されている（通知番号：１６産生寄第２２６
号）。
【００３０】
上記微生物は、本発明のアルカリ性マンナナーゼを生産し、菌体外の溶出する能力を有
している。このため、本発明のアルカリ性マンナナーゼは、上記微生物（ JAMB-602株）を
培養することによって、培養液から採取することが可能である。
【００３１】
（２）アルカリ性マンナナーゼ遺伝子
本発明はまた、上記アルカリ性マンナナーゼの遺伝子を提供する。なお、ここでいう遺
20
伝子には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡならびにＲＮＡが含まれる。
【００３２】
当該遺伝子は、前述するアルカリ性マンナナーゼ（タンパク質）をコードする塩基配列
を有するものであればよい。具体的には、配列表；配列番号２に示す塩基配列からなるＤ
ＮＡ、並びにそのホモログを挙げることができる。ここでホモログとしては、配列番号２
で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされるタンパク質（アルカリ性マンナ
ナーゼ）と機能的に同等なタンパク質をコードする遺伝子を挙げることができる。なお、
機能的に同等とは、配列番号２で示される塩基配列からなるＤＮＡによってコードされる
タンパク質（アルカリ性マンナナーゼ）と同様に、少なくともアルカリ領域でマンナナー
ゼ活性を有すること、好ましくは当該活性の最適ｐＨがアルカリ領域（ pH 8以上）である
30
ことを意味する。
【００３３】
好ましいホモログとしては、（１）のおいて説明した理化学的特性のうち（イ）∼（ト
）の少なくとも１つを有するタンパク質を挙げることができる。好ましくは（イ）∼（ト
）の理化学的特性のうち２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上または６つ以上を有す
るものであり、より好適には７つの全てを有するものである。
【００３４】
かかるホモログとして、具体的には、配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な
塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有す
る遺伝子を挙げることができる。ストリンジェントな条件としては、前述のものを同様に
40
挙げることができる。具体的なホモログとしては、配列番号４で示される塩基配列を有す
る遺伝子を挙げることができる。当該遺伝子は、Ｎ末端領域にシグナルペプチドを有する
、アルカリ性マンナナーゼの前駆体（配列番号３）をコードするＤＮＡである。
【００３５】
なお、本発明の遺伝子は、実施例で示すように、「 Bacillus sp. Strain JAMB-602」か
ら単離取得することもできる。それ以外の方法として、化学的な合成によって調製するこ
ともできる。
【００３６】
（３）組み換えベクター
本発明は、上記アルカリ性マンナナーゼをコードする遺伝子を含有する組み換えベクタ
50
(15)
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ーを提供する。当該組み換えベクターは、アルカリ性マンナナーゼをコードする遺伝子を
、所望の宿主細胞内で発現可能な状態で含んでおり、当該宿主細胞を形質転換するために
使用される。ゆえに、本発明の組み換えベクターは、かかる宿主細胞の形質転換が達成で
きる形態を有するものであればよく、例えばプラスミド、バクテリオファージ、レトロト
ランスポゾンの形態を有するものであってもよい。
【００３７】
本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、宿主として大腸菌（ E. coli）や枯草
菌（ B. subtilis）などの細菌を使用する場合、一般に、少なくともプロモーター − オペ
レーター領域（プロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合領域（ SD領域）を含む）
、開始コドン、本発明のアルカリ性マンナナーゼをコードするＤＮＡ、終止コドン、ター
10
ミネーター領域、及び複製可能単位を有する。また、酵母等の真菌細胞または動物細胞を
宿主細胞として用いる場合は、一般に、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナル
ペプチド及び本発明のアルカリ性マンナナーゼをコードするＤＮＡ、及び終止コドンを有
する。また、本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、必要に応じて、エンハンサ
ーなどのシスエレメント、本発明のアルカリ性マンナナーゼをコードするＤＮＡの 5'側ま
たは 3'側の非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、複製可能単
位、相同領域、選択マーカーを含むことができる。これらのエレメントは、本発明のアル
カリ性マンナナーゼをコードする遺伝子の発現に用いられる宿主に対応したものであれば
、特に制限されず、当業界の技術常識に基づいて選択することができる。
【００３８】
20
なお、選択マーカーとしては、特に制限されず、例えば遺伝子発現に使用される宿主が
細菌の場合は、薬剤抵抗性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性
遺伝子、シクロヘキシミド耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子など）、宿主が細菌以
外の例えば酵母などの場合は、栄養要求性遺伝子（例えば、ＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ
２、ＡＲＧ４など）などを始めとする公知の各種選択マーカーを利用することができる。
【００３９】
本発明の組み換えベクター（発現ベクター）は、簡便には、上記本発明のアルカリ性マ
ンナナーゼをコードするＤＮＡを、公知の発現用ベクターに、目的のアルカリ性マンナナ
ーゼが発現可能な状態で導入することによって、具体的にはプロモーターの下流に導入す
ることによって作成することができる。かかる導入は、ＤＮＡ組み換えの一般的な方法、
30
例えば Molecular Cloning. (1989). (Cold Spring Harbor Lab.)に記載される方法に従っ
て行うことができる。
【００４０】
発現用ベクターとしては、プラスミドベクターとして、例えば pRS413、 pRS415、 pRS416
、 YCp50、 pAUR112または pAUR123などの YCp型大腸菌（ E. coli） -酵母シャトルベクター；
pRS403、 pRS404、 pRS405、 pRS406、 pAUR101または pAUR135などの YIp型大腸菌（ E. coli）
-酵母シャトルベクター；大腸菌（ E. coli）由来のプラスミド（例えば pBR322、 pBR325、
pUC18、 pUC19、 pUC119、 pTV118N、 pTV119N、 pBluescript、 pHSG298、 pHSG396または pTrc9
9Aなどの ColE系プラスミド； pACYC177または pACYC184などの p1A系プラスミド； pMW118、 p
MW119、 pMW218または pMW219などの pSC101系プラスミドなど）；枯草菌（ B. subtilis）由
40
来のプラスミド（例えば pUB110、 pTP5など）； pHSP64などの大腸菌（ E. coli） -枯草菌（
B. subtilis）シャトルベクターを挙げることができる。またファージベクターとして、
λ ファージ（ Charon 4A, Charon21A, EMBL4, λ gt100, gt11, zap）、 ψ X174、 M13mp18、
M13mp19などを挙げることができる。レトロトランスポゾンとしては Ty因子などを挙げる
ことができる。また、融合タンパク質として発現する発現ベクター、例えば pGEXシリーズ
（ファルマシア製）、 pMALシリーズ（ Biolabs社製）を使用することもできる。
【００４１】
本発明の実施例では、本発明のアルカリ性マンナナーゼの前駆体をコードする遺伝子を
、 pHSP64プラスミドベクター [大腸菌（ E. coli） -枯草菌（ B. subtilis）シャトルベク
ター： Sumitomo et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 59 (11), 2172-2175 (1995)]
50
(16)
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のマルチプルクローニングサイトに導入することによって、本発明のアルカリ性マンナナ
ーゼ発現用ベクターを作成している。当該プラスミドベクターによれば、枯草菌（ B.subt
ilis）を宿主として、その中で、外来遺伝子として連結された本発明のアルカリ性マンナ
ナーゼの遺伝子を効率的に転写及び翻訳することができる。
【００４２】
（４）形質転換体
本発明はまた、宿主細胞に上記組み換えベクターを導入して形質転換されてなる形質転
換体を提供する。
【００４３】
組み換えベクターの宿主細胞への導入（形質転換）方法は、特に制限されず、トランス
10
フォーメーション法、トランスフェクション法、コンピテント細胞法、エレクトロポレー
ションなど、導入する宿主細胞の種類や組み換えベクターの形態に応じて、適宜選択する
ことができる。
【００４４】
宿主細胞としては、大腸菌（ E. coli）や枯草菌 (B. subtilis)などの細菌、サッカロマ
イセス・セレビシエ（ Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・ポンベ（ Saccha
romyces pombe）、ピヒア・パストリス（ Pichia pastoris）などの酵母、 sf9や sf21など
の昆虫細胞、 COS細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ CHO細胞）などの動物細胞、タ
バコなどの植物細胞を挙げることができる。好ましくは、大腸菌や枯草菌などの細菌、及
び酵母である。
20
【００４５】
なお、発現ベクターの宿主細胞内での存在様式は、特に制限されず、染色体中に挿入さ
れて、あるいは置換されて組み込まれてもよいし、またプラスミド状態で存在していても
よい。
【００４６】
（５）アルカリ性マンナナーゼの製造方法
斯くして得られた形質転換体は、宿主に応じて適切な培地中で培養されることによって
、本発明の新規アルカリ性マンナナーゼを産生することができる。本発明は、かかる形質
転換体を利用した新規アルカリ性マンナナーゼの製造方法を提供するものである。当該方
法は、具体的には、上記の形質転換体を培地で培養し、得られた培養物から、アルカリ性
30
マンナナーゼを採取することによって実施することができる。
【００４７】
培地には、上記形質転換体の生育に必須な炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン、薬剤な
どが含有される。炭素源としてはマンナン成分、アラビノース、セロビオース、フルクト
ース、ガラクトース、グルコース、グリセロール、イノシトール、ラクトース、マンニト
ール、マンノース、ラフィノース、ラムノース、スクロース、トレハロース、キシロース
が；窒素源としては硫酸アンモニウムや塩化アンモニウムなどの無機窒素、並びにカゼイ
ン分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン及びビーフ抽出物などの有機窒
素源；無機塩としては例えば二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二
カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム等；ビタミンとしては
40
ビタミンＢ１を始めとする各種のビタミン；薬剤としてはアンピシリン、ネオマイシン、
シクロヘキシミド、テトラマイシンなどの各種抗生物質を挙げることができる。なお、こ
れらは一例であり、これらに制限はされない。
【００４８】
培地の一例としては、宿主が大腸菌などのグラム陰性菌、または枯草菌などのグラム陽
性菌といった細菌の場合は、ＬＢ培地（日水製薬）、Ｍ９培地（ J. Exp. Mol. Genet., C
old Spring Harbor Laboratory, New York, p.431, 1972）などが；また宿主が酵母の場
合、ＹＰＤ培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone, ２％ glycerol）、
ＹＰＧ培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone, ２％ glycerol）、ＹＰ
培地（１％ Bacto yeast extract, ２％ Bacto peptone、ＹＰＤ培地（１％ Bacto yeast
50
(17)
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extract, ２％ Bacto peptone, ２％ glucose）、０．７％ Yeast Nitrogen Base (Difc
o社 )、ＹＰ培地〔１％ Bacto yeast extract (Difco社 ) , ２％ Polypeptone S (日本製
薬 )〕、などが例示される。
【００４９】
培養は、通常 10∼ 40℃ の温度範囲で数 ∼ 80時間程度実施され、必要に応じて通気、攪拌
を加えることもできる。培養温度は、宿主に応じて設定できるため、特に制限されないが
、好ましくは 18∼ 42℃ 、より好ましくは 25∼ 38℃ の範囲で実施することができる。
【００５０】
本発明のアルカリ性マンナナーゼの製造方法は、さらに、斯くして得られる培養物から
目的のアルカリ性マンナナーゼ（タンパク質）を採取することによって実施される。目的
10
タンパク質の採取は、培養後、培養上清中または形質転換体（菌体）中に蓄積された、目
的のタンパク質を公知の方法で抽出し、また必要に応じて精製することによって行うこと
ができる。分離精製は、例えば、塩析法、溶媒沈澱法、透析法、限外濾過法、ゲル電気泳
動法、あるいはゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の手法を組み合わせて行うことが
できる。
【００５１】
（６）アルカリ性マンナナーゼの用途
上記本発明のアルカリ性マンナナーゼは、酵素組成物、洗浄用組成物、漂白処理用組成
物、及び繊維柔軟剤の成分として使用することができる。以下、これらの各組成物につい
20
て説明する。
【００５２】
(6-1) 酵素組成物
本発明の酵素組成物は、アルカリ性マンナナーゼに他の１種以上の酵素を組み合わせて
なるものである。本発明のアルカリ性マンナナーゼと組み合わせて用いられる酵素として
、下記からなる群から選択される１または２以上の酵素を挙げることができる：
プロテアーゼ、セルラーゼ（エンド -β -1,4-グルカナーゼ）、 β − グルカナーゼ（エン
ド -β -1,3(4)-グルカナーゼ）、リパーゼ、クチナーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ
、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノ
ールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ヘミセルラーゼ、キシログルナナーゼ
30
、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ラムノガラクツロナンアセチルエステ
ラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、ペクチ
ンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナ
ーゼ、マンノシダーゼ、β―グルクロニダーゼ。中でも好ましくは、プロテアーゼ、セ
ルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、プルラナーゼ、ペクチンリアーゼであ
る。
【００５３】
(6-2) 洗浄用組成物
本発明の洗浄用組成物 [但し、繊維製品（衣料品を含む）を対象とする繊維製品洗浄用
組成物は除く ]は、本発明のアルカリ性マンナナーゼを含むことを特徴とするものである
40
が、これに加えて他の洗浄成分を含むことができる。
【００５４】
ここで洗浄成分としては、清浄作用を有するもの、またはこの清浄作用を補強する作用
を有するものを挙げることができ、被洗浄物の種類に応じて適宜選択することができる。
具体的には、界面活性剤、ビルダー、漂白剤、泡抑制剤、起泡剤などを例示することがで
きる。
【００５５】
ここで界面活性剤は、非イオン性界面活性剤、カチオン系界面活性剤、アニオン系界面
活性剤、及び両性界面活性剤の中から適宜選択して用いることができる。中でも好ましく
は非イオン性界面活性剤及び／又はアニオン系界面活性剤である。ここで非イオン性界面
50
(18)
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活性剤としては、例えばアルキルフェノールのポリエチレン、ポリプロピレン及びポリブ
チレンオキシド縮合物を；カチオン系界面活性剤としては第４級アンモニウム系の界面活
性剤を；アニオン系界面活性剤としてはアルキルエステルスルホネート系の界面活性剤を
；両性界面活性剤としては、第二及び第三アミンの誘導体、複素環式第二及び第三アミン
の誘導体、又は第四級アンモニウム、第四アンモニウム、第四ホスホニウム又は第三ホス
ホニウム化合物の誘導体を例示することができる。但し、これらに制限されることなく、
通常洗浄剤に使用される界面活性剤を広く使用することができる。
【００５６】
界面活性剤は、洗浄用組成物あたり０ .１ ∼ ６０重量％の割合で使用することができる
。制限されないが、洗浄用組成物あたりの各界面活性剤の割合としては、非イオン性界面
10
活性剤については０．００１ ∼ ５０重量％、カチオン系界面活性剤については０ .２ ∼ ２
５重量％、好ましくは１∼８重量％、アニオン系界面活性剤については１∼４０重量％、
好ましくは３ ∼ ２０重量％、両性界面活性剤については０ .２ ∼ １５重量％、好ましくは
１∼１０重量％の割合を例示することができる。
【００５７】
ビルダーとしては、アルミノシリケート材料、シリケート、ポリカルボキシレートを挙
げることができる。好ましくは、無機化合物であるアルミノシリケート材料（より詳細に
は水和化された合成ゼオライト）、及びシリケート（例えば積層シリケートや結晶性シリ
ケートが含まれる）である。但し、これらに制限されることなく、通常洗浄剤に使用され
るビルダーを広く使用することができる。ビルダーは、洗浄用組成物あたり５∼８０重量
20
％の割合で使用することができる。洗浄用組成物が液状である場合は、５∼３０重量％の
割合で使用することが好ましい。
【００５８】
漂白剤としては、例えば酸素系漂白剤、過カルボン酸系漂白剤時、及びハロゲン系漂白
剤など、通常洗浄剤に使用される漂白剤を広く使用することができる。漂白剤は、制限さ
れないが、洗浄用組成物あたり０∼２５重量％の割合で使用することができる。
【００５９】
泡抑制剤としては、例えばシリコーンやシリカ -シリコーンなどの、通常洗浄剤に使用
される泡抑制剤を広く使用することができる。泡抑制剤は、制限されないが、洗浄用組成
物あたり０∼２重量％の割合で使用することができる。
30
【００６０】
制限はされないが、本発明の洗浄用組成物には、本発明のアリカリマンナナーゼを好ま
しくは０ .０００１ ∼ ２重量％、より好ましくは０．０００５ ∼ ０ .５重量％の割合で使用
することができる。さらに本発明の洗浄用組成物には、上記アルカリ性マンナナーゼに加
えて、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵素、キシログルカナーゼ及びカルボヒド
ラーゼなどの酵素を含むことができる。ここでセルラーゼ、アミラーゼ、ペクチン分解酵
素、キシログルカナーゼ及びカルボヒドラーゼとしては、好適にはｐＨ７∼１２の範囲に
最大活性を有するか、若しくは最大活性の１０％以上、好ましくは２５％以上、より好ま
しくは４０％以上の酵素活性を有するような、好アルカリ性セルラーゼまたは耐アルカリ
セルラーゼ、好アルカリ性アミラーゼまたは耐アルカリアミラーゼ、好アルカリ性ペクチ
40
ン分解酵素または耐アルカリペクチン分解酵素、好アルカリ性キシログルカナーゼまたは
耐アルカリキシログルカナーゼ、及び好アルカリ性カルボヒドラーゼまたは耐アルカリカ
ルボヒドラーゼである。
【００６１】
制限はされないが、洗浄用組成物中にセルラーゼは０．０００１∼２重量％、好ましく
は０．０００１８∼０．０６重量％の割合；アミラーゼは０．０００１∼２重量％、好ま
しくは０．０００１８∼０．０６重量％の割合；ペクチン分解酵素は０．０００１∼２重
量％、好ましくは０．０００５∼０．５重量％の割合；キシログルカナーゼは０．０００
１∼２重量％、好ましくは０．０００５∼０．５重量％の割合；及びカルボヒドラーゼは
０．０００１∼２重量％、好ましくは０．０００５∼０．５重量％の割合で配合すること
50
(19)
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ができる。
【００６２】
本発明の洗浄用組成物には、上記成分に加えて他の成分、例えば蛍光増白剤、研磨剤、
殺菌剤、曇り抑制剤、再付着防止剤、柔軟剤、着色剤、香料などを配合することもできる
。これらの成分も通常洗浄剤に使用されるものが広く使用できる。
【００６３】
本発明の洗浄用組成物の洗浄対象は、繊維製品（衣料を含む）以外のものであれば特に
制限されない。よって、本発明の洗浄用組成物には、例えば食器等を対象とする食器洗い
洗浄組成物；毛髪並びに皮膚等を対象とする毛髪や皮膚洗浄組成物（ヘアシャンプー、ボ
ディーシャンプー）；床やガラス等の表面に付着した汚れを洗浄する硬質表面クリーナー
10
；コンタクトレンズ洗浄剤；歯みがきや入れ歯用洗浄剤などを挙げることができる。
【００６４】
本発明の洗浄用組成物は、その形態を特に制限するものではなく、例えば液状、ペース
ト状、ゲル状、棒状、錠剤状、噴射スプレー、発泡体状、粉末状、顆粒状、または粒状を
有することができる。また粒状組成物はまた圧縮形態で存在することができ、また液体組
成物は濃縮された形態であってもよい。
【００６５】
(6-3) 漂白処理用組成物
本発明のアルカリ性マンナナーゼは、製紙パルプ（化学パルプ、半パルプ、機械パルプ
、クラフトパルプなど）の塩素を含まない漂白プロセスにおいて、この漂白効果を高め、
20
過酸化水素のニーズを低減または排除するのに有効に使用することができる。ゆえに、本
発明のアリカリマンナナーゼは、塩素を含まない製紙パルプの漂白処理用組成物の１成分
として使用することができる。よって本発明は、アルカリ性マンナナーゼを含む製紙パル
プの漂白処理用組成物を提供するものである。かかる漂白処理用組成物は、本発明のアル
カリ性マンナナーゼに加えて、当該組成物に一般的に使用される各種の成分を広く配合す
ることができる。なお、アルカリ性マンナナーゼの配合割合としては、その比活性にもよ
るが、通常０．００１％∼２０％の範囲で使用することができる。
【００６６】
(6-4) 繊維産業及びセルロース繊維加工産業における用途
本発明のアルカリ性マンナナーゼは、繊維の製造または繊維の加工に際して（好ましく
30
はセルロース系繊維）、必要に応じて他の炭水化物分解酵素（例えば、キシログルカナー
ゼ、キシラナーゼ、種々のペクチン分解酵素）を組み合わせて使用することができる。な
お、ここで「セルロース系繊維」には、綿、混紡綿、または天然若しくは人工セルロース
物質（例えば、木材パルプのようなキシラン含有セルロース繊維）、またはこれらの混紡
から作られた繊維、織布、不織布（ニット、織物、デニム、ヤーン、及びタオル地を含む
）が含まれる。混紡の例としては、綿またはレーヨン／ビスコースと、羊毛，合成繊維（
例えば、ポリアミド繊維、アクリル繊維、ポリエステル繊維、ポリビニルアルコール繊維
、ポリビニリドンクロリド繊維、ポリウレタン繊維、ポリ尿素繊維、アラミド繊維）及び
セルロース含有繊維（例えば、レーヨン／ビスコース、ラミー、麻、アマ／リネン、ジュ
ート、酢酸セルロース繊維、リオセル）より選択される少なくとも１つとの組み合わせか
40
らなる混紡を挙げることができる。
【００６７】
本発明のアルカリ性マンナナーゼは、セルロース系繊維を衣類の製造に使用可能な材料
に加工するか、若しくはセルロース系繊維を衣類の製造に好適に使用できる材料に加工す
る目的で使用することができる。繊維産業におけるセルロース系繊維の加工には、例えば
繊維を紡糸してヤーンにする工程：ヤーンから織布またはニットを作成する工程；及びそ
の後に染色等する仕上げ工程など複数の工程が含まれる。
【００６８】
こうした工程において、特に織る前に、繊維には高分子糊（例えば、マンナン、でんぷ
ん、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコールなど）が加えられるが、かかる
50
(20)
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処理を施した材料は、加工前に除去する必要がある。本発明のアルカリ性マンナナーゼは
、こうしたマンナン含有糊の除去に使用することができる。
【００６９】
またグアガムやローカストビーンガム等のガラクトマンナンは、繊維の捺染に使用され
る捺染糊の増粘剤として広く使用されている。ゆえに本発明のアルカリ性マンナナーゼま
たはこれを含む酵素組成物は、捺染糊の粘度の低減や、捺染加工後の繊維から捺染糊を洗
浄し除去するために使用することができる。
【００７０】
(6-5) 植物由来の増粘剤やゲル化剤等の分解及び修飾
植物成分に由来する増粘剤、ゲル化剤または分散剤には、有効成分としてマンナン、ガ
10
ラクトマンナン、グルコマンナン、またはガラクトグルコマンナンを含むものがある。か
かるものとしては、例えばローカストビーンガムやグアガムなどのガム類を挙げることが
できる。本発明のアルカリ性マンナナーゼまたはこれを含む酵素組成物は、これら増粘剤
、ゲル化剤または分散剤等の用途に広く使用されているマンナン成分を含む植物由来物質
を分解し、その物理化学的性質（例えば、粘度など）を修飾するのに好適に使用すること
ができる。具体的には、マンナンを含む飼料や食物の粘度を低下させ、粘性のあるマンナ
ン含有物質（飼料、食物）の加工を容易にするために好適に使用することができる。
【００７１】
(6-6) コーヒー液やその加工に際して生じるゲル形成や沈澱生成の抑制
また本発明のアルカリ性マンナナーゼまたはこれを含む酵素組成物は、液体コーヒー抽
20
出物中に存在するガラクトマンナン等のマンナン類の加水分解に利用することができ、こ
れによってコーヒー液やその加工に際して生じるゲル形成や沈澱生成を抑制することがで
きる。特にインスタントコーヒーの凍結乾燥中のゲル形成、ホットベンダーなど加温保存
中におけるゲル形成や沈澱生成の抑制に有効に使用することができる。
【００７２】
(6-7) 地下部の破砕における使用（石油掘穿）
本発明のアルカリ性マンナナーゼまたはこれを含む酵素組成物は、米国特許第 5806597
号、第 5562160号、第 5201370号、及び第 5067566号と同様に、酵素破砕剤として使用する
ことができる。具体的には、井戸掘穿や石油掘穿等を目的として、地盤を破砕し地下部を
形成するための破砕剤として使用することができる。
30
【００７３】
破砕剤としては、本発明のアルカリ性マンナナーゼまたはこれを含む酵素組成物を、水
和可能ポリマー、及び当該水和可能ポリマーを本発明のアルカリ性マンナナーゼと架橋す
るための架橋剤と混合して、架橋ポリマーゲルとして使用されることが好ましい。当該架
橋ポリマーゲルは、地下部を破壊するのに十分な圧力下で、地下部に所望の穴を形成しな
がら穴中にポンプで送入される。地下部の穴に送入された架橋ポリマーゲルは、時間とと
もにそれに含まれる本発明のアルカリ性マンナナーゼの分解作用によって粘度が低下して
、低粘度の液状物となる。このため、地下部の溜まった当該液体は、地下部から容易に穴
表面にポンプで送り戻すことができる。こうした架橋ポリマーゲルによる圧搾作業、穴内
に溜まった架橋ポリマーゲルの低粘度化、及びその回収作業の繰り返しにより、地下部を
40
形成することが可能となる。
【００７４】
（ 6-8）マンノース、オリゴ糖の製造
本発明のアルカリ性マンナナーゼは、コンニャク等のグルコマンナン、ローカストビー
ンガム、グアーガム、大豆種皮由来のガラクトマンナン、コーヒー豆由来のガラクトマン
ナン、木材由来のガラクトグルコマンナン、海藻由来の β -1，４マンノ多糖類、酵母由来
の β -1，４マンノ多糖類に作用させることによって、マンノース、マンノオリゴ糖、ガラ
クトマンノオリゴ糖、グルコマンノオリゴ糖の製造に使用することが出来る。具体的には
、本発明のアルカリ性マンナナーゼを β − 1，４マンノピラノース環を有する植物性多糖
類に作用させることによって、カロリー成分であるグルコースを含まない製品、例えば甘
50
(21)
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味料、点滴成分、製飴、低カロリー・ノンカロリー成分、サルモネラ菌定着抑制成分、生
分解性プラスチック促進剤を製造することができる。
【００７５】
（ 6-9）飼料添加剤
本発明のアルカリ性マンナナーゼは飼料添加剤として、飼料の調製に使用することがで
きる。具体的には、本発明のアルカリ性マンナナーゼを牛等の反すう動物の飼料に飼料添
加剤として配合すると、当該マンナナーゼの作用によって、弱アルカリ性の胃の中で穀物
に含まれるマンナンが分解されてマンノオリゴ糖が生成され、ビフィダス菌を増やし、整
腸、増体重促進、飼料効率向上、便秘および下痢低減、発情再帰日数短縮、便臭改善の効
果をもたらすことができる。
10
【００７６】
（ 6-10）白水スカムの抑制剤
本発明のアルカリ性マンナナーゼは、製紙工程における櫛分や抄紙工程で循環利用され
る白水のスカムの抑制剤として有用である。各種の櫛を通して水浴中で固形不純分を取り
除かれた砕木したままのパルプや蒸解パルプは、漂白、乾燥工程を経て連続的にロールに
よって巻き取られるが、櫛槽や抄紙槽で再利用される水は、アルカリ性で白くにごり、溶
解したパルプ由来の多糖類、繁殖した微生物、微生物分泌物、パルプ繊維屑糖によるスカ
ムやスケールを発生させ、櫛分や抄紙槽内でパルプにスカムを混入させる。本発明のアル
カリ性マンナナーゼによれば、細胞壁の損傷による微生物の生育を抑制したり、スカム成
分の溶解を促進させることによって、白水中のスカムの発生を抑制することができる。ま
20
た漂白や乾燥工程でスカムやスケールを分解ないしは焼き切ることが可能である。こうし
た本発明のアルカリ性マンナナーゼによるスカムの発生抑制及び分解作用は、製紙工程に
おいて、パルプの裁断による巻き取りの中断を防ぐのに有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７７】
以下、実施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例等
に限定されるものではない。なお、下記の実施例において特に言及しない限り、％は w/v
％を意味するものとする。
【００７８】
参考例
30
なお、下記の実施例において、 (1)マンナナーゼの検出方法（マンナナーゼ存在の確認
）、及び (2)マンナナーゼ活性の測定は下記の方法に従って行った。
(1) マンナナーゼの検出方法
マンナナーゼの検出は、マンナン成分を含む固体培地におけるハロー形成の有無を目視
で判断することによって行った。すなわち、被験試料中にマンナナーゼが存在すれば、培
地中のマンナンが分解されてハローが形成される。具体的には、被験試料をマンナン成分
としてローカストビーンガムを含む固体培地（ 0.2 % locust bean gum（ Sigma，以下同じ
）、 0.5 % Polypepton S（日本製薬，以下同じ）、 0.5 % yeast extract（ Difco，以下同
.
じ）、 0.1 % K2 HPO4 、 0.02 % MgSO4 7H2 0、 0.5 % Na2 CO3 、 1.5 % agar）（以下、「マン
ナン含有固体培地」と称する）に塗布し、 30℃ で数日間培養を行う。コロニー形成後、当
40
該固体培地に 0.1％コンゴーレット水溶液を重層し染色する。その後、 1％塩化ナトリウム
水溶液で脱色し、マンナンの分解により形成されるハローを目視により判断し、被験試料
中のマンナナーゼの存在の有無を評価する。以下、本法によるマンナナーゼの検出方法を
「ハロー法」とも称する。
【００７９】
(2) マンナナーゼ活性の測定
マンナナーゼ活性の測定は、基質としてローカストビーンガム（主要構成成分； [D-ガ
ラクトース :D-マンノース（ 1:4） ]）を用いて、 3,5-ジニトロサリチル酸法 [G.L. Miller,
Anal. Chem., 31, 426-428 (1959)]に従って、基質（ローカストビーンガム）還元物の
生成量を測定することによって行った。
50
(22)
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【００８０】
具体的には、測定対象の酵素液を基質溶液 [最終濃度 0.25 % ローカストビーンガム、 50
mM グリシン -NaCl-NaOH緩衝液 , pH 9.0]にいれて（総量 1 ml）、 40℃ で 30分間処理して
酵素反応を行う。反応後、ジニトロサリチル酸溶液 1 mlを加え、沸騰水中で 5分間加熱し
た後、氷水にて冷却する。冷却後、水 4mlを加え 535nmの吸光度を測定する。なお、１分間
に１ μ molの D-マンノースに相当する還元糖を生成する酵素量（タンパク質量）を１単位
（１Ｕ）とする。タンパク質量は、標準タンパク質として牛血清アルブミンを用いたタン
パク質アッセイキット（ Bio-rad)を用いて測定する。
【００８１】
以下、本法によるマンナナーゼ活性の測定方法を「ジニトロサリチル酸法」と称する。
10
【００８２】
実施例１アルカリ性マンナナーゼ生産菌 Bacillus sp. Strain JAMB-602の分離
埼玉県嵐山町より採取した土壌を滅菌水に懸濁し、上澄み液をマンナン含有固体培地に
塗布して、 30℃ で数日間培養を行った。コロニー形成後、当該固体培地に 0.1％コンゴー
レット水溶液を重層して染色し、その後 1％塩化ナトリウム水溶液で脱色してマンナンの
分解により形成されるハローの有無を評価した。
【００８３】
ハロー形成能を有するコロニーをマンナナーゼ生産候補株とし、液体培養を行った。具
体的には、液体培地（マンナン含有固体培地より寒天（ agar）を除いたもの）に上記マン
ナナーゼ生産候補株を植菌し、 30℃ で数日間好気的に振とう培養した。その後、遠心分離
20
により培養液を、菌体（沈殿物）と上清に分け、得られた上清を 5mM Tris-HCl緩衝液（ pH
7.5）にて透析し、これを粗酵素液として用いて、各ｐＨにおけるマンナナーゼ活性を
、参考例に記載するジニトロサリチル酸法に従って測定した。これにより、粗酵素液に含
まれるマンナナーゼの最適ｐＨを求めた。本法にて、最適ｐＨをアルカリ領域（ pH 8以上
）に有するマンナナーゼ生産候補株（以下、「本発明菌体」という）を単離して、下記に
示す (1)∼ （ 9）の試験に供した。
【００８４】
（Ａ）試験内容及びその方法
(1) 形態学的試験
0.5 % Polypepton S、 0.5 % yeast extract、 0.5 % glucose、 0.1 % K2 HPO4 、及び 0.0
30
2 % MgSO4 を含む培地を用いて本発明菌体を生育させ、光学顕微鏡によって細胞形態及び
サイズ、並びに鞭毛による運動性の有無を観察した。さらにグラム染色性（陽性／陰性）
、並びに好気性及び嫌気性の別について定法に従って評価した。
【００８５】
(2) 胞子形成
培地〔 BBL
T M
Trypticace
T M
Soy Agar(1.5 % pancreatic digest of casein、 0.5 % pap
aic digest of soybeen meal、 0.5 % sodium chloride、 1.5 % agar）及び 0.01 % MnCl2
・ 4H2 O含有〕を用いて本発明菌体を培養し、顕微鏡により胞子形成の有無を確認した。
【００８６】
(3) 生育条件試験
40
0.5 % Polypepton S、 0.5 % yeast extract、 0.5 % glucose、 0.1 % K2 HPO4 、及び 0.0
2 % MgSO4 を含む培地を用いて、本発明菌体の生育条件（生育 pH範囲、最適生育 pH、生育
温度範囲、最適生育温度、生育塩濃度範囲）を求めた。なお、 pHテストは pH 6∼ 11までの
範囲で pH１ずつの間隔で行った。培地の pHは 5、 6および 7は塩酸、 pH 8及び 9は炭酸水素ナ
トリウム、 pH 10以上は炭酸ナトリウムを用いて調整した。生育温度範囲の測定には温度
勾配バイオフォトレコーダー（ ADVANTEC）を用いた。塩濃度テストは塩化ナトリウムを用
いて、培地の塩濃度を 3％、 5％、 7％、 10％、及び 15％に調整して行った。
【００８７】
(4)生理性状学試験
(4-1) オキシダーゼ試験、カタラーゼ試験
50
(23)
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オキシダーゼ試験は、チトクローム・オキシダーゼ試験用ろ紙「ニッスイ」（製造販売
元、日水製薬株式会社）を用い、カタラーゼ試験は 3％過酸化水素を用いて定法に従って
試験を行った。
【００８８】
(4-2) デンプン分解能（ Hydrolysis of starch）
固体培地〔 Bacto Tryptic Soy Broth without Dextrose
T M
（ 1.7 % pancreatic digest
of casein、 0.3 % soy bean peptone、 0.5 % NaCl、 0.25 % dipotassim phosphate） (Dif
co社 )、及び 0.5 % Starch azure含有 [Na2 CO3 で pH 9.5に調整 ]〕に本発明菌体を植菌し、
生育後、ハロー形成の有無を確認した。ハローが形成される場合は、本発明菌体にデンプ
ン分解能があると判断される。
10
【００８９】
(4-3) カゼイン分解能（ Hydrolysis of casein）
固体培地〔 BBL社製 Trypticace Soy Agar
T M
(1.5 % pancreatic digest of casein、 0.
5 % papaic digest of soybeen meal、 0.5 % NaCl、 1.5 % agar)、及び 0.5 % skim milk
含有 [Na2 CO3 で pH 9.0に調整 ]〕に本発明菌体を植菌し、生育後菌体を取り除き、 30 % ト
リクロロ酢酸溶液を培地に滴下し、ハロー形成の有無を確認した。ハローが形成される場
合は、本発明菌体にカゼイン分解能があると判断される。
【００９０】
(4-4) ゼラチン分解能（ Hydrolysis of gelatin）
固体培地〔 Nutrient Broth(0.3 % beef extract、 0.5 % peptone) (Difco社 )、 2 % aga
20
r、及び 1 % gelatin含有 [Na2 CO3 で pH 9.0に調整 ]〕に本発明菌体を植菌し、生育後菌体
を取り除き、 30 % トリクロロ酢酸溶液を培地に滴下し、ハロー形成の有無を確認した。
ハローが形成される場合は、本発明菌体にカゼイン分解能があると判断される。
【００９１】
(4-5) インドール産生能（ Production of indole）
培地〔 SIM確認培地（ 0.3 % beef extract、 2.8 % peptone、 0.0025 % sodium thiosulf
ate、 0.1 % ammonium Fe(III) citrate、 0.3 % agar）（日水製薬社製）〕を試験管に分
注し、本発明菌体を穿刺培養し、インドール試薬（ p-ジメチルアミノベンズアルデヒド、
5g；アミルアルコール、 75 ml；濃塩酸、 25 ml）を 1 ml加え、変色の有無を確認した。変
色が観察される場合は、本発明菌体にインドール産生能があると判断される。
30
【００９２】
(4-6）硫化水素生成能（ Production of H2 S）
培地〔 SIM確認培地（ 0.3 % beef extract、 2.8 % peptone、 0.0025 % sodium thiosulf
ate、 0.1 % ammonium Fe(III) citrate、 0.3 % agar）（日水製薬社製）〕を試験管に分
注し、本発明菌体を穿刺培養し、硫化水素の生成を確認した。培地が黒く変色する場合に
、本発明菌体に硫化水素生成能があると判断される。
【００９３】
(4-7) 硝酸塩及び亜硝酸塩の還元能（ KNO3 reduction、 NaNO2 reduction）（それぞれ
培地 6および 7）
培地 6〔 1 % beef extract、 1 % peptone、 0.5 % NaCl、及び 0.1 % KNO3 含有 [Na2 CO3 で
40
pH 9.5に調整 ]〕、または培地 7〔 1 % beef extract、 1 % peptone、 0.5 % NaCl、及び 0.0
01 % NaNO2 含有 [Na2 CO3 で pH 9.5に調整 ]〕を、試験管に各々分注後、植菌を行ない、本
発明菌体を生育させた。生育後、培地 6に 0.33 % スルファニル酸および 0.5 % ジメチル α
-ナフチルアミンを各々 1 ml加え、変色の有無を観察した。培地が赤く変色した場合は、
亜硝酸塩が存在し、本発明菌体に硝酸塩に対する還元能があると判断される。培地が変色
しない場合は、亜鉛を少量加える。この際、培地が赤色に変色した場合は、培地中に硝酸
塩が残留しており、本発明菌体に硝酸塩への還元能は無いと判断される。一方、亜鉛を加
えた際に培地が変色しなかった場合は、本発明菌体に亜硝酸塩への還元能があり、菌体が
亜硝酸塩を還元して、脱窒が行なわれたと判断される。
【００９４】
50
(24)
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また、培地７を用いて本発明菌体を生育後、当該培地 7に 0.33 % スルファニル酸および
0.5 % ジメチル α -ナフチルアミンを 1 mlずつ加えた場合に、培地が変色しなかった場合
は、当該本発明菌体は硝酸塩を還元せずに亜硝酸塩のみを還元する能力があると判断され
る。
【００９５】
(4-8) DNase 活性
固体培地〔 Bacto DNase TEST AGAR (2 % Bacto Tryptose、 0.2 % deoxyribonucleic ac
id、 0.5 % NaCl、 1.5 % Bacto agar)(Difco社 )〕に本発明菌体を植菌し、生育後菌体を取
り除き 1N 塩酸を培地に滴下し、ハロー形成の有無を確認した。ハローが形成される場合
は、本発明菌体に DNase 活性があると判断される。
10
【００９６】
(4-9) 糖の資化性
軟寒天培地〔 0.3 % agar、 0.7 % K2 HPO4 、 0.2 % KH2 PO4 、 0.01 % MgSO4 、 0.1 % (NH4 )2
SO4 、 0.5 % NaCl、 0.5 % 各種炭素源（ L-arabinose,cellobiose, D-fructose, D-galacto
se, D-gulucose, grycerol, inositol, D-lactose, maltose, D-mannitol, D-mannose, D
-R[raffinose, L-rhamnose, D-sorbitol, sucrose， D-trehalose, xylose]、及び vitamin
solution含有 [Na2 CO3 で pH 9.9に調整 ]〕に本発明菌体を穿刺培養し生育させ、生育の有
無から、各種炭素源（糖）に対する本発明菌体の資化性を評価した。
【００９７】
(5) 16S rDNA塩基配列を用いた相同性解析
20
最適ｐＨをアルカリ領域に有する上記マンナナーゼ生産候補株（本発明菌体）から、定
法に従ってゲノム DNAを抽出した [H. Saito and K. Miura: Biochem.Biophys.Acta, 72, 6
19-629 (1963)]。これをテンプレートとし、約 1,500 bpの 16S rRNA遺伝子を増幅すること
のできるユニバーサルプライマーを用いて PCRを行ない、 16S rRNA遺伝子を増幅した。得
られた PCR産物を精製した後、これをテンプレートとし、 16S rRNA遺伝子の内部共通配列
より作成したプライマーを用い、シーケンス反応を行ない、塩基配列の決定を行った。得
られた塩基配列のデータをもとに、 FASTA program (http://www.ddbj.nig.ac.jp)を用い
て、相同性検索を行った。
【００９８】
(6) HPLCによる GC含量の測定
30
Tamaoka等 [FEMS Microbiol Lett., 25, 125-128 (1984)]の方法に従い、菌体中の GC含
量を測定した。培養菌体より抽出精製した DNAをエタノール沈澱した後、乾燥し、蒸留水
で 0.5μ g/μ lの濃度に調整した。この DNA溶液 10μ lを沸騰溶液中に 10分間保った後、氷水
で急冷し、一本鎖 DNAに変性させた。これに 10μ lのヌクレアーゼ P1溶液（ 0.1 mg/ml ヌク
レアーゼ P1, 40 mM酢酸ナトリウム , 2 mM 硫酸亜鉛 , pH 5.3）を加えて 50℃ で 1時間処理
して加水分解を行ない、 DNAをヌクレオチドにした。さらにこれに 10μ ｌのアルカリフォ
スファターゼ（ 2.4単位 /ml, 0.1M Tris-HCl, pH 8.1）を加えて 37℃ で 2時間以上処理し、
ヌクレオシドにしたものを分析試料とし、下記条件の高速液体クロマトグラフィー（ HPLC
）に供して GC含量を求めた。
【００９９】
40
＜高速液体クロマトグラフィーの GC含量分析条件＞
機器：高速液体クロマトグラフ LC Module 1(Waters社 )、
検出波長： 260 nm、
分析用カラム： Cosmosil 5C18カラム（ 4.6× 150 mm）（ナカライテスク）、
カラム温度：室温（ 15-25℃ ）、
移動相： 0.02 Mリン酸一アンモニウム -アセトニトリル（ 19： 1、 v/v）、
流速： 1 ml/min 、
サンプル量： 10 μ ｌ。
【０１００】
(7) DNA- DNAハイブリダイゼーション
50
(25)
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培養菌体より抽出精製した DNA を用いて、 Ezaki等 [Int. J. Syst. Bacteriol., 39, 22
4-229 (1989)]の方法に従い、 DNA-DNAハイブリダイゼーションを行った。
【０１０１】
(8)菌体脂肪酸組成の分析
Waino等 [Int. Syst. Bacteriol., 49, 821-831 (1999)]の方法に従って本発明菌体の脂
肪酸組成を分析した。テフロン（登録商標）ライニング付き耐熱性スクリューキャップの
試験管に凍結乾燥した本発明菌体 20 mgを入れた。これに 5 v/v% 無水塩酸・メタノール溶
液（国産化学） 2 mlを加え、キャップを締めた。 100℃ 、 3時間加熱処理を行なった。加熱
後、冷却し、蒸留水を 1 ml加えた後、 3 mlのヘキサンを加え 2分間激しく振盪した。 3000
× gで 5分間遠心し、ヘキサン層を別のスクリューキャップに移した。残った塩酸・メタノ
10
ール溶液にまた 3 mlのヘキサンを加え同様の操作を行ない、 3回抽出した。斯くして回収
したヘキサン層に同量の蒸留水を加え 2分間激しく振盪した。これを 3000× Gで 5分間遠心
して、ヘキサン層から塩酸を除いた。予めジエチルエーテルで洗浄し乾燥しておいた無水
硫酸ナトリウム 5 gを入れた新しい試験管に、上記のヘキサン層を移し、軽く撹拌した後
、 3時間静置した。このヘキサン層を新しい試験管に移し、減圧濃縮機で 200μ l程度にな
るまで濃縮した。これをガスクロマトグラフィー・マススペクトロメトリー（ GC/MS）に
供して、菌体脂肪酸組成を分析した。
【０１０２】
(9) キノン組成の分析
Komagata等 [Methods Microbiol., 19, 161-203 (1983)]の方法に従い、本発明菌体の
20
キノン組成を分析した。凍結乾燥した本発明菌体（約 200 mg）をねじ口試験管に入れ、 20
mlのクロロホルム -メタノール（ 2： 1,v/v）を加え、冷暗所で一晩置き、菌体成分を抽出
した。このクロロホルム -メタノール懸濁液を濾紙で濾過し、濾液をナス型フラスコに集
め、ロータリー・エバポレーターで濃縮乾固させた。ナス型フラスコの内壁に乾固した菌
体成分を少量のアセトンで抽出した。このアセトン抽出液を、シリカゲル TLCプレート（ M
erck Kiesel-gel 60 F2 5 4 , 0.2 mm thickness, 20 cm× 20 cm）にスポットした。同様に
、当該シリカゲル TLCプレートに、以下に示したマーカーをスポットした。この TLCプレー
トをヘキサン -ジエチルエーテル（ 4： 1,V/V）で 1時間展開して、乾燥させた後、紫外線ラ
ンプ（ 254 nm）下で、展開したアセトン抽出液（被験試料）のスポットについて、キノン
のバンドを確認した。
30
【０１０３】
確認したキノンのバンド画分を TLCプレートから削り取り、試験管に移し、 1 mlのアセ
トンを加え、軽く振盪して抽出した。このアセトン抽出液を高速液体クロマトグラフィー
の前処理用 0.5μ ｍの疎水性 PTFEメンブランフィルター（サンプレップ FH4, Millipore）
で濾過した後、窒素ガスを使用し、約 100μ l位に濃縮した。これを試験サンプルとして、
下記条件の高速液体クロマトグラフィーに供して、キノン組成の分析を行った。
【０１０４】
＜高速液体クロマトグラフィーでのキノン分析条件＞
機器：高速液体クロマトグラフ LC Module 1 (Waters社 )、
検出波長： 270 nm、
40
分析用カラム： m-Bondasphere(5 m, C18,100Å )（ 3.9× 150 mm） (Waters社 )、
ガードカラム： Delta-Pak（ C18,100Å ） (Waters社 )、
カラム温度：室温（ 15-25℃ ）、
移動相：メタノール -イソプロパノール（ 2： 1， v/v）、
流速： 1 ml/min 、
サンプル量： 10 μ l、
標準試料：メナキノン -6、メナキノン -7、ユビキノン -7、ユビキノン -8、及びユビキノ
ン -10を使用。
【０１０５】
（Ｂ）試験結果
50
(26)
結果を表１に示す。
【０１０６】
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(27)
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【表１】
10
20
30
40
【０１０７】
50
(28)
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表１に示すように、土壌から分離したマンナナーゼ生産候補株（本発明菌体）は、好ア
ルカリ性の Bacillus属細菌であることが分かった。さらに 16S rDNA塩基配列の相同性解析
T
の結果、 Bacillus alcalophilus（ DSM485 ）と 96.7%の相同性を、また Bacillus pseudoal
T
calophilus（ DSM8725 ）と 96.3％の相同性を有していた。相同性解析により本発明菌体と
近縁と考えられる上位 11種の菌株と本発明菌体の 16S rDNA塩基配列を用いて近隣結合法 [S
aitou and Nei: Molecular Biology and Evolution, 4, 406-425 (1987)]を行うことによ
り、分子系統樹を作成し、本発明菌体の近縁種及び帰属分類群の検討を行った。作成した
分子系統樹を図１に示す。その結果、本発明菌体は、上記 B. alcalophilus及び B. pseudo
alcalophilusと、同一ではないものの姉妹群を形成することが判明した。また、本発明菌
体と上記の B. alcalophilus及び B. pseudoalcalophilusとのゲノム関連性を評価するため
10
に、 DNA-DNAハイブリダイゼーションを行った結果、本発明菌体と B. alcalophilus及び B.
pseudoalcalophilus とはそれぞれ 12.4%及び 11.2%の相同性しか見られなかった。このこ
とから本発明菌体は、 Bacillus属に属する新種の微生物であると考えられた。このため、
当該本発明菌体を、「 Bacillus sp.Strain JAMB-602」と命名して、平成１６年９月２４
日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６に住所を有する独立行政法人
産業技術総合研究所、特許生物寄託センターに、寄託者が付した識別のための表示を「 Ba
cillus sp. Strain JAMB-602」とし、受領番号を「ＦＥＲＭＡＰ − ２０２２６」として
寄託した（通知番号：１６産生寄第２２６号）。
【０１０８】
実施例２マンナナーゼ遺伝子のクローニング、及び塩基配列の決定
20
上記 Bacillus sp. Strain JAMB-602（以下、単に「 JAMB-602株」という）を、マンナン
含有固体培地（ 0.2 % locast bean gum、 0.5 % Polypepton S、 0.5 % yeast extract、 0.
.
1 % K2 HPO4 、 0.02 % MgSO4 7H2 0、 0.5 % Na2 CO3 、 1.5 % agar）で培養し、得られた培養
菌体から定法に従ってゲノム DNAを抽出した [H. Saito and K. Miura, Biochim. Biophys.
Acta, 72, 619-629 (1963)]。このゲノム DNAを EcoRIにて消化し、 High Pure PCR Produc
t Purification kit (Roche Diagnostics)を用いて精製した。これを、予め EcoRIで消化
後、アルカリフォスファターゼ (Roche Diagnostics)で処理した pUC18プラスミドベクター
に、 DNA Ligation Kit Ver.2（ Takara製）を用いてライゲーションを行った。ライゲーシ
ョン後のプラスミドをコンピテントセル (E. coli HB101) に導入して、形質転換した後 [
D. Hanahan, Mol. Gen. Genet., 166, 557-580 (1983)]、これをアンピシリン（ 100μ g/m
30
l）を含む Luria-Bertani（ LB）固体培地（ Difco）に塗布し、 37℃ で一晩培養した。培養
後、上記ＬＢ固体培地に 0.25 % コンニャクマンナン、 50 mM グリシン -NaCl-NaOH緩衝液
(pH 9.0)、 0.7 % 寒天および 1 mg/ml リゾチームを含むゲルを重層し 37℃ で 4時間保温し
、次いで、当該ゲル層の上に 0.1 % コンゴーレッド水溶液を注いだ。そして、周囲にクリ
アゾーンを形成（ハロー形成）しているクローンを、マンナナーゼ活性、すなわちをマン
ナナーゼ遺伝子を有するクローン（陽性クローン）として単離した。
【０１０９】
この陽性クローンからプラスミドを抽出し（ High Pure Plasmid Isolation kit： Roche
製）、これを pU5Aと命名し、その中に導入されているマンナナーゼ遺伝子の塩基配列を、
ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Kitおよび ABI 377 Sequencerを用いて
40
決定した。決定したマンナナーゼ遺伝子の塩基配列、ならびにこれから推定したマンナナ
ーゼのアミノ酸配列を図２に示す。マンナナーゼ遺伝子は、 490個のアミノ酸からなるタ
ンパク質（分子量 53763 Da）をコードする 1470 bpのオープンリーディングフレーム（ ORF
）を有しており、それは G＋ Cを 39.5mol％の割合で含んでいた。潜在的なリボゾーム結合
部位（ 5'-GAGGAG-3'：図２中「 RBS」として標記）は開始コドン TTGの 9bp上流に位置して
おり、推定プロモーター配列である 5'-TTGAAA-3'（ -35領域：図２中「 -35」として標記）
及び 5'-TAGTTT-3'（ -10領域：：図２中「 -10」として標記）は、開始コドンからそれぞれ
158bp上流及び 135bp上流に 17bpの間隔をおいて位置していた。 Ala32と Asn33との間に潜在
的な切断部位があり、 N末端領域に 32個のアミノ酸からなるシグナル配列の存在が認めら
れた。終止コドン TAGの 6 bp下流域に逆反復配列（図中、 → 及び ← で示す）が認められた
50
(29)
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。これらのことから成熟酵素（ mature）の分子量は 50422 Da（ 458アミノ酸）であり、等
電点は pH 5.01であると推定された。
【０１１０】
上記マンナナーゼ遺伝子の塩基配列から JAMB-602株由来アルカリ性マンナナーゼについ
て推定されるアミノ酸配列を、 FASTAアルゴリズムを用いたコンピュータ・ホモロジー分
析により、他の公知のマンナナーゼ（ GH family 5）のアミノ酸配列と相同性解析を行っ
た (http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY)。
【０１１１】
結果を表２に示す。この結果から本発明菌体 JAMB-602株に由来するアルカリ性マンナナ
ーゼは、 Bacillus sp. I633に由来するマンナナーゼとアミノ酸配列において類似するも
10
のの新規なマンナナーゼであることが判明した。
【０１１２】
【表２】
20
【０１１３】
30
実施例３マンナナーゼの発現
JAMB-602株のゲノム DNAを鋳型として、 LA Taq DNA polymerase（ TaKaRa）を用いて PCR
を行ない、マンナナーゼ遺伝子を増幅した。 PCRに際して、マンナナーゼ遺伝子の 5'及び 3
'末端領域の配列を有するオリゴヌクレオチドに BamHI/SalI制限酵素部位（下線部）を導
入した下記の２つプライマーを作成し、これを使用した。
5'-CGTCGACTGTCATCCTCCGCGCTGGCTGCG-3'(配列番号６ )
5'-TTGGATCCCTGGTGATTAGTTACTCAGCAC-3'(配列番号７ )
斯くして増幅したマンナナーゼ遺伝子を、制限酵素 BamHI及び SalIにて処理した後、こ
れを、同制限酵素で消化後アルカリフォスファターゼ処理したベクター pHSP64（ E. coliB. subtilisシャトルベクター） [Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 2172-2175 (1995)
40
]にライゲーションした。ライゲーション後のプラスミド（ pA5AM）を、コンピテントセル
(E. coli HB101)に導入した。得られた形質転換体を、アンピシリン（ 100μ g/ml）を含
むＬＢ固体培地に塗布し、 37℃ で一晩培養した。培養後、ＬＢ固体培地に 0.25% コンニャ
クマンナン、 50 mM グリシン -NaCl-NaOH緩衝液 (pH 9.0)、 0.7 % agarおよび 1 mg/mlリゾ
チームを含むゲルを重層し、 37℃ で 4時間保温した後、 0.1 % コンゴーレッド水溶液にて
ハローの検出を行い、形質転換体のマンナナーゼ活性を評価した。
【０１１４】
実施例４マンナナーゼの発現、及び精製
マンナナーゼを高発現するために、実施例３で調製したプラスミド（ pA5AM）を用いて
、 Bacillus subtilis ISW1214 （ TaKaRa）を形質転換 [S. Chang, et al., Mol. Gen. Gen
50
(30)
et.,
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168, 111-115 (1979)]した。これを CLT培地〔 10 % corn steep liquor（和光純薬
.
）、 0.1 % yeast extract、 1 % bonito meat extract、 0.1 % KH2 PO4 、 0.02 % MgSO4 7H2
O、 NaOHで pH 6.8に調整、 7 % maltose（別滅菌）、 0.05 % CaCl2 （別滅菌）、 tetracycli
ne（ 15 μ g/ml）〕で、 30 ℃ で 3日間好気的に振とう培養を行った。培養後、培養液を遠
心分離（ 12,000× g、 10分間）により菌体と上清に分け、上清を粗酵素液とし、これから
マンナナーゼを精製した。なお、精製工程はすべて 4℃ 以下で行った。
【０１１５】
具体的には、まず培養上清（ 31.8 mL）を、 10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.5)で一晩透析
を行った。透析後、透析液を 10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.5)にて平衡化した DEAE-650M（
東ソー）カラム（ 2.5× 20cm）に供して吸着させ、同緩衝液を通液して非吸着タンパク質
10
を溶出した。次いで塩化ナトリウム溶液（ 10 mM Tris-HClに溶解）を用いて、 50 mM から
150 mMの塩化ナトリウム濃度勾配をかけマンナナーゼを溶出した。マンナナーゼ活性画分
を 10 mM リン酸塩緩衝液 (pH 7.0)にて平衡化したハイドロキシアパタイト（日本ケミカル
）カラム（ 2.5× 20 cm）に吸着させ、同緩衝液にて通液して非吸着タンパク質を溶出した
。次にリン酸塩緩衝液 (pH 7.0)を用いて、 10 mMから 150 mMのリン酸濃度勾配をかけマン
ナナーゼを溶出した。マンナナーゼ活性画分を限外濾過（ Amicon Ultra 10k; Millipore
）にて濃縮し、リン酸塩緩衝液を 10 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.5)に置換した。同緩衝液に
て平衡化した DEAE-650Mカラムに濃縮サンプルを吸着し、同緩衝液にて通液して非吸着タ
ンパク質を溶出した。次いで塩化ナトリウム溶液（ 10 mM Tris-HCl緩衝液に溶解）を用い
て、 80 mM から 140 mMの NaCl濃度勾配をかけマンナナーゼを溶出した。マンナナーゼ活性
20
画分を限外濾過にて濃縮し、緩衝液を 5 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.5)に置換した。得られ
たマンナナーゼ活性画分を SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけて、精製した酵素
が、分子量約 50 kDaの単一バンドを示すことを確認した（図３）。
【０１１６】
なお、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動は、 Laemmli [Nature, 2277, 680-685 (19
70)] の方法に従って行った。電気泳動には、 12 % アクリルアミドゲルを使用し、染色に
はクマーシー・ブリリアント・ブルー（ CBB）染色を使用した。
【０１１７】
下記の表３に示すように、上記の陰イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパ
タイトクロマトグラフィーといった精製操作により、組換えマンナナーゼは 12.5倍に精製
30
されて、 287 U/mgもの高い比活性を示した。なお、収率は 33％であった。
【０１１８】
【表３】
40
【０１１９】
このことから、上記方法によれば、組換えマンナナーゼが、培養上清１ Lあたり 2.4gも
の高収率で生産できることがわかった。すなわち、上記宿主 -ベクター系によると、組換
えマンナナーゼの工業的生産が可能であると考えられる。
【０１２０】
実施例５マンナナーゼの酵素学的特性
（１）最適ｐＨ
基質（最終濃度 0.25% ローカストビーンガム）を含む、種々 pH（ pH 5.6− 10.9）を有す
50
(31)
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る 50 mM 緩衝液（ pH 5.6− pH 6.1：酢酸塩緩衝液 ; pH 6.3− pH 8.5：リン酸塩緩衝液 ; pH
7.7− pH 10.9：グリシン -NaCl-NaOH 緩衝液）に、実施例４で精製したマンナナーゼ（ 0.
18 U/ml）を加え、 40℃ で 5分間酵素反応を行った。他の反応条件は参考例に記載するジニ
トロサリチル酸法の条件に準じた。結果を図４（ａ）に示す。この結果から pH 7.5∼ 9.5
、好ましくは pH 8∼ 9.5、特に pH 9前後が最適ｐＨであることがわかった。
【０１２１】
（２）ｐＨ安定性
実施例４で精製したマンナナーゼ（ 0.3 U/ml）を、 Britton & Robinson universal buf
fe（ pH 3.5− pH 11.8）と混合し（酵素混合時の濃度 10 mM）、各種のｐＨ条件下（ pH 3−
12）で 40℃ にて 30分、または 4℃ にて 24時間処理した後、参考例に記載するジニトロサリ
10
チル酸法に準じて、反応溶液中のマンナナーゼの残存活性を測定した。結果を図４（ｂ）
に示す（ 40℃ にて 30分の反応系の結果は黒丸で、 4℃ にて 24時間の反応系の結果を黒三角
で示す））。この結果から、上記のいずれの条件でも、 pH 7∼ 11の範囲で安定であること
がわかった（ 70％以上、特に 80％以上のマンナナーゼ活性が残存）。また、 pH 11.5、特
に pH 11.5条件下で 4℃ で 24時間保存した場合でも 70％以上のマンナナーゼ活性が残存して
いた。
【０１２２】
（３）最適温度
30∼ 80℃ に加温した基質溶液（最終濃度 0.25% ローカストビーンガム、 50 mM グリシン
-NaCl-NaOH緩衝液 , pH 9.0）に、実施例４で精製したマンナナーゼ（ 0.2U/ml）を入れて
20
（総量 1 ml）、 5分間酵素反応を行った。他の反応条件は、参考例に記載するジニトロサ
リチル酸法の条件に準じた。結果を図５（ａ）に示す。この結果から、最適温度は 60∼ 70
℃ 、特に 65℃ 前後であることがわかった。当該マンナナーゼの由来菌は、生育最適温度が
36-37℃ である中温菌（ mesophiles）に属する菌である。上記マンナナーゼの最適温度（ 6
5℃ 前後）は、当該中温菌（ mesophiles）に由来するマンナナーゼの最適温度としては高
い温度である。
【０１２３】
（４）温度安定性
上記マンナナーゼの温度安定性を調べた。具体的には、実施例４で精製したマンナナー
ゼ（ 0.3 U/ml）を 5 mM Tris-HCl緩衝液 (pH 7.5)に溶解し、 55℃ 、及び 60℃ で、 10分、 20
30
分、 30分及び 60分間処理した後、参考例に記載するジニトロサリチル酸法の条件に準じて
マンナナーゼの残存活性を測定した。結果を図５（ｂ）に示す。この結果からわかるよう
に、本発明のマンナナーゼは 55℃ （図中、黒丸で示す）及び 60℃ （図中、黒三角で示す）
で比較的安定であった（ 70℃ の結果示さず）。 55℃ 及び 60℃ における非可逆的熱不活性化
の初速度定数（ｋ）は、半対数座標上で直線回帰線を示した。 55℃ 及び 60℃ における半減
期は、それぞれ 2時間及び 30分であった。この結果から、本発明のマンナナーゼは、従来
公知のアルカリ性マンナナーゼ [T.Akino, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 26,
323-327 (1987);T. Akino, et al., Appl. Environ. Microbiol., 55, 3178-3183 (1989)
]に比して温度安定性が高く、この点を有利な特徴として、広く利用可能な酵素であると
考えられた。
【０１２４】
（５）金属イオンおよび化合物の影響の測定
マンナナーゼを各種の化合物（表４）または各種の金属塩（表５）と混合し（酵素混合
時の濃度 1 mM）、 5 mM Tris-HCl (pH 7.0)中、 40℃ で 30分間処理した。その中から 0.1ml
取りだして、参考例に記載するジニトロサリチル酸法の条件に準じてマンナナーゼ残存活
性を測定した。マンナナーゼ活性に対する各種の化合物の影響を表４に、金属塩の影響を
表５にそれぞれ示す。
【０１２５】
40
(32)
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【表４】
10
【０１２６】
【表５】
20
30
40
【０１２７】
この結果から、酢酸ヨード、ヨウ化アセトアミド、 N-エチルマレイミド、ジチオスレイ
トール、 1-エチル -3-(3-ジメチル -アミノプロピル )カーボネート、ジエチルピロカーボネ
ート、 EDTA、及び EGTAは、実質的にマンナナーゼに影響しなかった。一方、 N-ブロモスク
シニミド（ NBS）はマンナナーゼの活性を完全に阻害した。幾つかの酵素に対する NBSの阻
50
(33)
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害は、タンパク質中のトリプトファンの酸化であることが知られている [Methods Enzymol
., 11, 498-506 (1967)]。このことから、マンナナーゼの触媒活性または構造の維持にト
リプトファン残基が関わっていると考えられる。
【０１２８】
一方、金属に関しては、 Fe
3 +
、 Fe
2 +
、 Pb
2 +
、 Cu
2 +
、 Zn
2 +
、 Hg
2 +
、 Cd
2 +
、 Sn
2 +
といった金
属イオン（塩化物）は、強くまたは中程度にマンナナーゼの活性を阻害した。それに対し
+
+
て、同条件下で、 Na 、 K 、 Mn
2 +
、 Ca
2 +
、 Mg
2 +
、及び Co
2 +
は、マンナナーゼ活性に対して
実質的に影響を及ぼさなかった。このことから、本発明のマンナナーゼは、従来公知のア
ルカリ性マンナナーゼ [T. Akino et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 26, 323-327
( 1 9 8 7 ) ; T . A k i n o e t a l . , A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . , 5 5 , 3 1 7 8 - 3 1 8 3 ( 1 9 8 9 ) ]に比し
10
て、重金属に対して感受性が高く影響されやすい酵素であることがわかった。
【０１２９】
（６）加水分解物の TLC分析と基質特異性
(6-1)
実施例４で精製したマンナナーゼを用いて、アイボリーナッツ（マンノースのホ
モポリマー； Megazyme）を加水分解し、経時的に産生される生成物を TLC分析により測定
した。具体的には、 0.4 % のアイボリーナッツ及びマンナナーゼ（ 0.05 U/ml）を含む溶
液（ 50 mM グリシン -NaCl-NaOH 緩衝液 , pH 9.0）を、 40℃ で反応させた（ 10分、 20分、 3
0分、 1時間、 24時間）。一定時間経過後、反応液を沸騰水中で 5分間熱処理し、酵素反応
を停止した。上記各サンプルを TLCプレート（ Silica gel 60, 20× 10 cm, MERCK）に 5μ l
スポットし、水、ブタノール及び酢酸水を含む〔水：ブタノール：酢酸（ 1： 2： 1（ v/v）
20
〕展開溶媒を用いて二重展開を行った。展開後、 TLCプレートに 10 %(v/v) 硫酸を噴霧、
加熱処理しスポットを発色させた。結果を図６（ａ）に示す。
【０１３０】
これから、本発明のマンナナーゼは、アイボリーナッツを２糖及び３糖にまで加水分解
することがわかる。すなわち、本発明のマンナナーゼは、５糖及び６糖のマンノオリゴ糖
に対して強い加水分解能を有し、また４糖のマンノオリゴ糖に対しても僅かに加水分解能
を有するものの、２糖及び３糖のマンノオリゴ糖に対しては加水分解能が低いか又は無い
ことが分かった。
【０１３１】
(6-2)
この結果を受けて、次に、実施例４で精製したマンナナーゼを用いて、マンノ
30
オリゴ糖（ 2糖 ∼ 6糖）を加水分解し、経時的に産生される生成物を TLC分析により測定し
た。具体的には、 0.4 % の各マンノオリゴ糖（ 2糖 [M2]、 3糖 [M3]、 4糖 [M4]、 5糖 [M5]、 6
糖 [M6]）及びマンナナーゼ（ 0.05 U/ml）を含む溶液（ 50 mM グリシン -NaCl-NaOH緩衝液 ,
pH 9.0）を、 40℃ で反応させた（ 10分、 20分、 30分、 1時間、 24時間）。一定時間経過後
、反応液を沸騰水中で 5分間熱処理し、酵素反応を停止した。上記各サンプルを TLCプレー
ト（ Silica gel 60, 20× 10 cm, MERCK）に 5μ lスポットし、水、ブタノール及び酢酸水
を含む〔水：ブタノール：酢酸（ 1： 2： 1（ v/v）〕展開溶媒を用いて二重展開を行った。
展開後、 TLCプレートに 10 %(v/v) 硫酸を噴霧、加熱処理しスポットを発色させた。結果
を図６（ｂ）に示す。
【０１３２】
40
これからの結果から、本発明のマンナナーゼは、マンナン、４糖より大きいマンノオリ
ゴ糖を加水分解することが示され、さらにこの加水分解パターンから、本発明のマンナナ
ーゼがエンド作用型マンナナーゼであることが示された。
【０１３３】
なお、本発明のマンナナーゼの、ローカストビーンガム、アイボリーナッツ、コンニャ
クマンナン、及びグアガムに対する相対活性は約１００ :６０ :４５ :３０あった。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】本発明の菌体（ Bacillus sp. Strain JAMB-602）の帰属分類群を示す、 16S rDNA
配列分析に基づく系統樹を示す図である。
50
(34)
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【図２】本発明の菌体（ Bacillus sp. Strain JAMB-602）に由来するマンナナーゼの遺伝
子配列とそれから演繹されるアミノ酸配列を示す図である。
【図３】実施例４において調製し精製したマンナナーゼ（精製酵素）の電気泳動像（ SDSPAGE）である（レーン P）。図中、レーンＭは蛋白質の分子量を示すためのマーカーの泳
動像である。
【図４】実施例５において、実施例４において調製し精製したマンナナーゼの最適ｐＨ（
図４（ａ））、及びｐＨ安定性（図４（ａ））を測定した結果を示す図である。図ｂ中、
− ● − は 40℃ で 30分間、 − ▲ − は 4℃ で 24時間反応させた結果を示す。
【図５】実施例５において、実施例４において調製し精製したマンナナーゼの最適温度（
図５（ａ））、及び温度安定性（図５（ａ））を測定した結果を示す図である。図ｂ中、
− ● − は 55℃ 、 − ▲ − は 60℃ でそれぞれ反応させた結果を示す。
【図６】図６（ａ）は、実施例４で精製したマンナナーゼの、アイボリーナッツ（マンノ
ースのホモポリマー； Megazyme）に対する加水分解パターンを、図６（ｂ）は、同じく実
施例４で精製したマンナナーゼの、マンノオリゴ糖（ 2糖 [M2]、 3糖 [M3]、 4糖 [M4]、 5糖 [M
5]、 6糖 [M6]）に対する加水分解パターンを示す図である。
【図１】
【図２】
10
(35)
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
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【配列表】
2006087401000001.app
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(37)
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.
ＦＩ
テーマコード（参考）
Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｅ２１Ｂ 43/26
(2006.01)
(2006.01)
Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ
４Ｈ００３
Ｅ２１Ｂ 43/26
Ｃ１１Ｄ
(2006.01)
Ｃ１１Ｄ
3/386
3/386
(72)発明者秦田勇二
神奈川県横須賀市夏島町２番地１５独立行政法人海洋研究開発機構内
(72)発明者ウイリアムディー．グラント
イギリス国レスターエルイー１９エイチエヌメディカルサイエンスビルディングユ
ニバーシティーロードピー．オー．ボックス１３８デパートメントオブマイクロバイオ
ロジーアンドイムノロジーユニバーシティーオブレスター
(72)発明者掘越弘毅
神奈川県横須賀市夏島町２番地１５独立行政法人海洋研究開発機構内
Ｆターム(参考) 4B024 AA03 BA12 CA03 CA05 DA06 DA07
4B027 FB28 FK07 FQ11
4B050 CC03 DD02 FF05 FF09 FF11 FF12 HH02 LL04 LL05
4B064 AF04 CA21 CB07 CC24 CD19 DA16
4B065 AA15Y AA19X AA26X AB01 AC06 CA31 CA57
4H003 EC01

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