トライテスト3カラー用解析試薬とTruCOUNT Tubesを使用したリンパ球

Technical Protocol
Vol. 3
トライテスト3カラー用解析試薬とTruCOUNT Tubesを使用した
リンパ球サブセット絶対数測定
はじめに
フローサイトメーターによるリンパ球サブセット検査では、モノクローナル抗体陽性細胞はリンパ球集団に対
する比率（%陽性率）で求められています。その一方で、検体中の実際の細胞数（絶対数）の把握が臨床研究や
患者のモニタリングに必要であり、正確な絶対数測定のニーズが高まっています。トライテスト3カラー解析
用試薬と絶対数測定用試験管TruCOUNT Tubesを組み合わせることにより高精度かつ簡便にリンパ球サブ
セットの絶対数測定ができます。
トライテスト試薬は洗浄をしない染色プロトコールを採用しています。検体が全血の場合、従来は、解析への
影響を考慮して赤血球溶血後の過剰な抗体や赤血球膜等のデブリを除去するために洗浄操作が必要とされ
てきました。トライテスト試薬は、抗体が適切な濃度に調製済みで、さらにリンパ球ゲート解析にデブリの影
響を受けないCD45 PerCP標識抗体を用いているため、溶血後の洗浄が不要です。リンパ球は細胞表面に
CD45抗原を強く発現しているので、図1のようにCD45 PerCP vs SSCドットプロットでリンパ球をゲーティン
グすることができます。
このTechnical Protocolではトライテスト試薬とTruCOUNT
Tubes を使用したサンプル調製と専用の MultiSET ソフト
ウェアによる測定および解析について説明しています。こ
の方法では、リンパ球とその周辺のイベントの分布から細
胞集団の間にある谷（細胞の分布の少ない領域）を探して、
ゲート設定する領域を決定しています。このゲート設定に
よりデブリ、赤血球、および好塩基球のゲートへの混入を
避けることができます。
ゲーティングされたリンパ球はFL1 vs FL2ドットプロットで
図1. CD45 PerCP vs SSCドットプロットによる
リンパ球ゲーティング
TruCOUNT
ビーズ
4分画蛍光マーカーではなく、アトラクターと呼ばれるだ円
で各サブセット解析を行ないます。アトラクターにはあら
アトラクター
かじめ、その囲む細胞の特徴に基づいて中心となる位置等
が定義されています。
最後に精度管理として使用するTriTEST TruCOUNT Controls
とMult-Check Control の使用方法についてもご紹介し
ます。
Technical Protocol
図2. MultiSETソフトウェアの
アトラクターによるサブセット解析
Technical Protocol
機器およびソフトウェア
1. FACS フローサイトメーター
2. FACSComp ソフトウェア：機器調整用ソフトウェア
3. MultiSET ソフトウェア： CD45リンパ球ゲーティングによるリンパ球サブセット（TruCOUNT Tubesを
用いた絶対数測定も含む）専用ソフトウェア
試薬および器具
1. トライテスト試薬
トライテスト CD3/CD4/CD45*
（カタログ番号： 340383）
（カタログ番号： 340344）
トライテスト CD3/CD8/CD45*
（カタログ番号： 340381）
トライテスト CD3/CD19/CD45*
（カタログ番号： 340300）
トライテスト CD3/CD16+CD56/CD45*
2. TruCOUNT Tubes（カタログ番号： 340334）
3. TruCOUNT Controls（カタログ番号： 340335）
4. Multi-Check Control（カタログ番号： 340911）a)
（カタログ番号： 349202）
5. FACS Lysing Solution（10X）
使用に際して、蒸留水で10倍希釈します。
6. CaliBRITE 3（カタログ番号： 340486）
7. FACSFlow（カタログ番号： 340398）
8. 蒸留水または、イオン交換水
9. Vortexミキサー
10. チップ付きマイクロピペッター（20 µL、50 µL用）
11. チップ付きマイクロピペッター（450 µL用）
a）Multi-Check Controlは包装バイアル数によりいくつかのカタログ番号があります。詳しくはアプリケーションホットライ
ンまでお問い合わせください。
血液採取
EDTA入り採血管（K3 EDTA BD Vacutainer採血管；カタログ番号： 366457）または同等の採血管を使用し
て血液を採取します。
留意：血液検体は、染色前に白血球数と白血球分画を測定し、白血球数が測定限界範囲内であることを確認
してください。
留意：血液検体の保存については各能書を参照してください。
2
染色
1. 1検体あたりTruCOUNT Tubes4本を用意し、試験管番号をラベルします。
2. 表1のように20 µLのトライテスト試薬をTruCOUNT Tubesに加えます。リテイナーのすぐ上に分注して
ください。ビーズにチップの先が触れないようにしてください。
留意：トライテスト試薬をMultiSETソフトウェアで解析する場合は4分画蛍光マーカーを使用せずに解
析しますので、アイソタイプコントロールのトライテスト IgG1/IgG1/CD45（カタログ番号：
340385）は不要です。
試験管名（例）
試薬
Sample A tube #1
トライテスト CD3/CD4/CD45
Sample A tube #2
トライテスト CD3/CD8/CD45
Sample A tube #3
トライテスト CD3/CD19/CD45
Sample A tube #4
トライテスト CD3/CD16+CD56/CD45
表1. 試薬の添加
3. 抗凝固剤入り全血を正確に50 µL加えます。
留意：全血は試験管壁に付けないようにTruCOUNT Tubesのリテイナーのすぐ上に分注してください。
試験管壁に着いた血液は試薬により染色されません。また、ピペットチップの先がビーズペレッ
トに触れないようにしてください。
b)
全血を正確に入れることは絶対数測定において重要ですので、リバースモードを使用し、分注
C)
してください。あらかじめチップの外側をティッシュで拭き取ってから、分注してください。
4. 試験管にキャップをし、Vortexミキサーで緩やかに混和後、20∼25˚C、暗所で15分インキュベートし
ます。
5. 1X FACS Lysing Solutionを450 µL加えます。
6. 試験管にキャップをし、Vortexミキサーで緩やかに混和後、20∼25˚C、暗所で15分インキュベートし
ます。
7. 6時間以内にフローサイトメーターで測定します。すぐに測定できない場合は20∼25˚C、暗所で保存し
てください。
b）リバースモード
1 プッシュボタンを第2ストップ（最初に停止する位置より更に押し下げた位置）までスムーズに押し下げます。
2
3
4
ピペットのチップをサンプルに浸します。プッシュボタンをゆっくり戻します。チップの中にサンプルが完全に吸引され
るように、ここで約1秒ほど待ちます。
TruCOUNT Tubesのステンレスのすぐ上にチップの先端を沿わせ、プッシュボタンを第1ストップまでスムーズに押し下
げ、サンプルを吐出します。
同じサンプルにチップを再使用する場合は、次の分注サイクルのためにプッシュボタンを第1ストップにとどめておき、操
作2∼3を繰り返します。
c）チップの拭き取り
必要に応じて、チップの外側を実験用ティッシュで拭いてください。このとき、チップの先端開口部には触れない様、気を
付けてください。毛羽立ちがないティッシュを使用してください。使用したティッシュは、安全かつ衛生的な方法で処分し
てください。
出典：「ギルソンマニュアルリキッドハンドリングガイド 2nd Edition」エムエス機器株式会社発行
3
Technical Protocol
機器条件設定
FACSCompを行ないます。FACSCompについての詳細はTechnical Information Vol.2「FACSComp 4.2
を参照してください。
Quick Reference」
。
1. 2本の3カラーFACSComp用のCaliBRITE Beads浮遊液を用意します（表2）
FACSFlow
CaliBRITE Beads
試験管A
1 mL
無標識ビーズのみ
試験管B
3 mL
無標識、FITC、PE、PerCPビーズ
表2. CaliBRITE Beadsの準備
2. アップルメニューからFACSCompを立ち上げます。
3. Sign In画面でオペレータ名を入力します。
4. Set Up画面のAssay TypeでLyse/No-Wash（LNW）にチェックを入れます。
5. CaliBRITE BeadsロットIDを入力します。
6. インストラクションに従い、FACSCompを実行します。
図2. FACSComp画面Summury Test画面
7. Sensitivity test 終了後表示される Summary Test 画面（図 2 ）下部の Optimization 、または上部の
Optimizationアイコンをクリックします。
図3. FACSComp画面Optimization画面（1）
8. Optimization 画面（図 3 ）左下の選択ボタンをクリックし、Optimization 2：Save File Name=
TriTEST.optを選択します。
4
9. いずれかのサンプル（どの染色試薬でも構いません）をVortexミキサーで緩やかに混和後、フローサイ
トメーターに取り付け、Startをクリックします。
必要な機器調整ウィンドウが自動的に表示されます
（図4）
。
この時の機器設定は終了したばかりの FACSComp Lyse/No-Wash（ LNW ）の設定になっています。
ThresholdはFL3 = 300に設定されています。
図4. FACSComp画面Optimization画面（2）
10. 必要であれば、FL3 Thresholdを調整します。
FL3 Thresholdはデブリを削除しリンパ球がすべて表示されるように設定しますが、過度にデブリを削除
してしまうとMultiSETソフトウェアがリンパ球集団を確認することができません。1ページの図1のドット
プロットの様に少量のデブリが表示されるように設定してください。
MultiSETソフトウェアを使用する場合、FACSComp設定から更に、蛍光Voltageの調整、Compensation
の調整は必要ありません。
11. Save Optimized Settingsをクリックします。
機器設定はTriTEST.optという名称で、FACStation HD：BD Files：Instrument Setting Files内に保存さ
れます。
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Technical Protocol
データ取り込みと解析
MultiSET ソフトウェアを使用して解析します。MultiSET についての詳細はユーザーズガイドまたは
FACSCalibur Training Manual Section 9 MultiSETを参照してください。
サンプルは、測定前にVortexミキサーで緩やかに混和してください。
1. アップルメニューからMultiSETを選択し、オペレータ名、施設名、責任者名を入力します。
2. Acceptをクリックします。
図5. MultiSET Set Up画面
）From Cytometer： Acquisition with Analysis"のラジオボタンをクリックします。
3. Set Up画面（図5“
フローサイトメーターからデータを取り込んだ後、解析が自動的に行なわれるモードです。
Automatic Saving Option欄はデータファイルやレポートの保存の有無や、保存場所を指定する欄で
に保存さ
す。初期設定はFACStation HD：BD Files：MultiSET Files内の日付けのフォルダ（DDMMYY）
れます。このフォルダはMultiSET立ち上げ時に自動的に作成されますので、初期設定のまま使用する
ことが便利です。
4. Acceptをクリックします。
FACSComp 画面が表示されます。この時点でFACSComp を実行することも可能です。すでに実行し
ている場合は Skip FACSComp をクリックしてください。いずれの場合も、次のステップとして Test
Prefs画面（図6）が表示されます。
図6. MultiSET Test Prefs画面
6
5. Test Prefs画面に必要な情報を入力します。
留意：ここで、必ず入力しなければならないのはTruCOUNT Beadsのビーズ数です。この値はデータ
ファイルに保存され、後から変更することができません。
1）画面下部のLot IDsをクリックする。
2）Absolute Count Beadsのアイコンをクリックする。
3）Lot ID を入力し、Beads/Pellet欄にそのロットのビーズ数を入力する。
ビーズ数はTruCOUNT Tubesのパッケージ袋に記載されています。
留意：絶対数測定を行なう場合には、
正しいTruCOUNT Tubesのlot IDとビーズ数を入力してください。
lot IDとビーズ数はスケジュールドキュメント（後に作成するワークシートのようなもの）に附随
します。TruCOUNT Tubesのロットが変わり、ビーズ数が変わる場合は、スケジュールドキュメ
ントを新しく作成し、測定を分けてください。
Physician Report Choices、Laboratory Report Choices、Summary Report ID、および画面下部の
Subset Ranges 、Panel Tools、Reagent ToolsについてはMultiSETユーザーズガイドまたはMultiSET
トレーニングマニュアルを参照してください。
6. Accept をクリックします。
Samples画面（図7）が表示されます。この表がスケジュールドキュメントファイルに相当します。
図7. MultiSET Samples画面
7. 1列めの Sample Name欄をクリックし、サンプルの名前を入力します。
8. Panel Name欄をクリック&ホールドし、ポップアップメニューから"3 Color TBNK + TruC Panel"を選
択します。
9. 他のサンプルがあれば、同様にSample Name欄をクリックし、サンプルの名前を入力します。
留意： TruCOUNT Tubesを使用する時、WBC、およびLymphs欄に情報を入力しないでください。
10. CytometerメニューのInstrument SettingsよりTriTEST.optの機器設定ファイルをフローサイトメー
ターにダウンロードします。
留意：「機器条件設定」の手順に従ったFACSComp Optimization画面での調整直後であれば、フロー
サイトメーターの機器設定はTriTEST.optになっています。一度電源を切ったり、他のアプリケー
ションのために使用した場合はこの手順を行なってください。
TriTEST.optはFACStation HD：BD Files：Instrument Settings Filesに入っています。
11. FileメニューからSaveを選択し、スケジュールドキュメントを一時保存します。
7
Technical Protocol
12. Run Testsをクリックします。
データ取り込み画面（図8）が表示されます。
図8. MultiSET データ取り込み画面
13. サンプルAの1本目の試験管（トライテスト CD3/CD4/CD45）を混和し、フローサイトメーターにセット
し、Acquireをクリックします。
データ取り込みが開始されます。
14. 取り込みが終了し、Lab Report 画面（図9）が表示されたら、フローサイトメーターからサンプルを取り
外します。
Analyzing dataのメッセージが表示され、解析された後に計算結果がLaboratory Report画面に表示
されます。
図9. MultiSET Lab Report画面
15. Continueをクリックします。
ソフトウェアは次の試験管のデータ取り込みと解析を引き続き行ないます。
16. ステップ13から15を残りの試験管について繰り返してください。
8
17. 最後のビーズ入り試験管の取り込みが終了した後、Laboratory Report画面でContinueをクリックし
ます。
を表示します。
ソフトウェアはこのサンプルの Physician Report 画面（図10）
図10. MultiSET Physician Report画面
18. Physician Report画面のNextをクリックする。
続けてサンプルがあれば、ソフトウェアはスケジュールドキュメントのサンプル2の1本目の試験管の
データ取り込みを行なう画面になります。
このサンプルがスケジュールドキュメントの最後であれば、Summary Report画面（図11）が表示され
ます。
図11. MultiSET Summary Report画面
留意： Laboratory Report、Physician Reportの保存、プリントの有無は設定できます。詳しくはMultiSET
ソフトウェアユーザーガイドを参照していただくか、アプリケーションホットラインへお問い合わ
せください。
19. Quitをクリックし、MultiSETソフトウェアを終了します。
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Technical Protocol
Laboratory Reportの見方
取り込んだイベント数
入力したTruCOUNT Tubes中のビーズ数
（パッケージに記載）
取り込んだリンパ球
（のゲートより）
取り込んだTruCOUNT
ビーズ数
（のアトラク
ターより）
取り込んだCD3+CD4+
リンパ球数（のアト
ラクターより）
下の計算式により求
めた全血1 µLあたりの
CD3 + CD4 + リンパ球
絶対数
図12. Laboratory Report
絶対数測定計算式
絶対数/µL ＝
測定されたリンパ球サブセットイベント数
測定されたビーズのイベント数
×
TruCOUNT Tubes中のビーズ数
サンプル量
精度管理
TruCOUNT Controls （カタログ番号： 340335）
TruCOUNT Controlsは、TruCOUNT Tubesを用いたリンパ球サブセット絶対数測定法で測定される細胞数
の直線性をチェックするために使用します。
KitにはLow、Medium、Highの3つの濃度のビーズが各2バイアルずつ入っています。各ビーズは15テスト入
りです。測定されたビーズ数は箱に記載されている表示値と比較します。
【染色】
3ページの通常の染色の手順6の後、試験管を30秒穏やかにVortexし、Low, MediumまたはHighのビーズ
をリバースモードで50 µL分注し、緩やかにVortexします。
【機器条件設定】
通常の機器設定と同じです。
10
【データ取り込みと解析】
MultiSETのSamples画面で、TruCOUNT Controlsが含まれるパネルを選択します。
例）MultiReagent Control
測定順序
1
2
3
パネル内試薬名
CD4/CD8/CD3 TruC Ctrl L
CD3/CD19/CD45 TruC Ctrl M
CD3/CD16+56/CD45 TruC Ctrl H
パネルはあらたに作成することができます。他の組み合わせが必要な場合はアプリケーションホットライン
へお問い合わせください。
【プリントの見方】
取り込んだTruCOUNT
Controlビーズ数（の
アトラクターより）
10ページの計算式に
より求めた全血1 µLあ
たりのControlビーズ
絶対数
図13. Laboratory Report
（TruCOUNT Control Beadを使用した場合）
Multi Check Control
Multi Check Controlには、安定化したヒトリンパ球および赤血球が保存液中に含まれています。包装の中に
含まれるアッセイバリューシートにアッセイレンジが記載されています。フローサイトメトリーによる表面抗
原染色、赤血球の溶血、機器設定および機器性能、および解析の日々の精度管理のためにご使用ください。
詳しくはBD Multi-Check Control添付文書をご覧ください。
11
Technical Protocol
測定性能
【再現性】
TruCOUNT Control Beadをそれぞれ同時に10回繰り返して測定しました。
TruCOUNT Controls
Low
Medium
表示値（平均値）
49
249
997
表示値（S.D.）
7.9
21.7
64.8
1
47
239
946
2
41
265
963
3
46
228
971
4
48
233
964
5
42
248
1016
6
50
233
1036
7
45
251
991
8
53
226
956
9
50
238
1000
10
平均値
S.D.
C.V.%
High
57
247
923
47.9
240.8
976.6
4.9
12.0
34.1
10.15
4.98
3.49
(社内データ)
表3. 同時再現性
【SimulTEST試薬との比較】
(cells/µL)
1400
CD3+ CD4+細胞絶対数
トライテスト CD3/CD4/CD45試薬による
TruCOUNT Tubesとトライテスト CD3/CD4/CD45試薬を使用
+
してサンプル調製し、MultiSETソフトウェアで解析した CD3
CD4＋細胞絶対数測定結果について従来法による結果との相関
関係を確認しました。従来法は、サイマルテスト IMKLymphocyte キットの CD3/CD4 試薬でサンプル調製し
SimulSETソフトウェアで解析したCD3+ CD4＋細胞パーセンテー
ジを、血球計数機"Sysmex SE-9000/RAM 1"で測定した白血
+
球数とリンパ球パーセンテージを使用して、計算によりCD3
CD4＋細胞絶対数を求めています。
1200
1000
800
600
400
n = 45
g = 0.933
y = 0.99x + 4.2
200
0
0
200
400
600
800
1000 1200
(cells/µL)
CD3+ CD4+細胞絶対数
（従来法）
サイマルテスト CD3/CD4試薬と血球計算機による
図14. 従来法との相関
66-012-00
R0-0511-001-188

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