Verso la realizzazione del sé

Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare
Schema: Sindrome dell’X-Fragile (gene FMR1)
CEQ ISS
IX turno – 2013
Valutatori:
• Dott.ssa Marina Grasso
• Dott.ssa Anna Ravani
• Dott.ssa Silvia Russo
Roma
ISS
07 marzo 2014
Campione 1
Campione 2
Campione 3
Campione 4
Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare
Schema: Sindrome dell’X-Fragile (gene FMR1)
Schema Completo
Schema Pre-screening
Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare
Schema: Sindrome dell’X-Fragile (gene FMR1)
punteggio
CEQ ISS
IX turno – 2013
1
Schema Completo:
12 laboratori
Schema Prescreening: 3 laboratori
15 Laboratori
14 Risposto correttamente
1 Errata Genotipizzazione (1 campione)
New
New
Poor performance
2
8.4
3
11.6
4
11.6
5
11.6
6
12.3
7
12.5
8
12.8
9
13.1
10
13.2
11
13.3
12
13.4
13
13.5
14
13.9
15
14
Campione 4
4
Commento: Le analisi molecolari hanno permesso
di stabilire che Ellicine Valerio presenta un genotipo
a mosaico allele normale/mutazione completa al
locus FMR1, condizione compatibile con l’indicazione
all’indagine.
Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare
Schema: Sindrome dell’X-Fragile (gene FMR1)
VIII Turno (2012)
Punteggi dei 19 laboratori partecipanti
Schema unico
IX Turno (2013)
Punteggi dei 15 laboratori partecipanti
2 Schemi : Completo e Prescreening
1/7
6/7 non partecipato
Blu: Lab. Schema completo
Azzurro: Lab. Schema Pre-scerening
Rosso : Poor Performance
Genotipizzazione - Pettorbi
Genotipizzazione
5
4
3
2
1
0
media
genotip. su
max 5: 4.37
0 poor
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
VIII Turno 2012
IX Turno 2013
Punteggio Insuff. 8/19 lab
(+2 n.v. su 76 genotipiz.)
Performance insufficiente
1/15 lab (1 su 60 genotipizz.)
Media punteggio Genotip.:
Media punteggio Genotip.:
3.9 su 5
4.31 su 5
Genotipizzazione - Aberuste
5
4
2
media
genotip. su
max 5: 4.37
1
0 poor
3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Genotipizzazione - Tappenti
media
genotip. su
max 5: 4.37
0 poor
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
5
media
genotip. su
max 5: 4.13
3
2
1 poor
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
il metodo usato deve essere
esplicitato chiaramente indicando bibliogr.
(Zhou et al., J Med Genet 2004)
Marcatore: meglio usare 50bp ladder
Genotipizzazione - Ellicine
4
No dato grezzo SB (problemi archiviazione)
Solo MS-PCR :
MS-PCR e separazione frammenti con
elettroforesi su gel di agarosio.
10 11 12 13 14 15
5
4
3
2
1
0
Lab 2. Schema completo:
Genotipizzazione - Pettorbi
Genotipizzazione
5
4
3
2
1
0
media
genotip. su
max 5: 4.37
0 poor
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
VIII Turno 2012
IX Turno 2013
Performance insufficiente 8/19
lab (più 2 n.v. su 76 genotipiz.)
Performance insufficiente
1/15 lab (1 su 60 genotipizz.)
Media punteggio Genotip.:
Media punteggio Genotip.:
3.9 su 5
4.31 su 5
Genotipizzazione - Aberuste
5
4
media
genotip. su
max 5: 4.37
3
2
0 poor
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Genotipizzazione - Tappenti
media
genotip. su
max 5: 4.37
0 poor
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Genotipizzazione - Ellicine
5
media
genotip. su
max 5: 4.13
4
3
2
1 poor
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
1-Pettorbi e 3-Tappenti
L’indagine per long-PCR ha evidenziato uno smear
nel range di normalità, attribuibile ad alleli compresi
tra le 3 +/-2 e le 26 +/-2 ripetute CGG.
10 11 12 13 14 15
5
4
3
2
1
0
Lab 4. Schema completo:
All’indagine per Southern Blot, si evidenzia uno
smear > 5.2 Kb con caratteristiche di mutazione piena,
sia per quanto riguarda le dimensioni della regione di
ripetute (superiore al normale) sia per quanto riguarda
la metilazione delle isole CpG al 5’ del gene FMR1
(allele metilato).
Lab 2. Schema completo:
Long-PCR (Enhanced Polymeras Chain Reaction Assay secondo Tassone F. et al., JMD 2005)
e separazione dei frammenti su sequenziatore ABI Prism 310
Southern Blot (digestione DNA genomico con enzimi di restrizione EcoRI/EagI e
ibridizzazine con sonda StB12.3)
Campione
3
4
2
1
smear nel range di normalità, attribuibile ad alleli compresi
tra le 3 +/-2 e le 26 +/-2 ripetute CGG.
Campione
3 4 2 1
Interpretazione - Pettorbi
Interpretazione
5
4
3
2
1
0
media interpret.
su max 5: 4.7
0 poor
0 non valutati
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Interpretazione - Aberuste
5
4
3
2
1
0
VIII Turno 2012
IX Turno 2013
Performance insufficiente 2 su
66 interpretaz. (10 interpr. non
valutate)
Performance insufficiente 0 su
59 interpretaz. (1 interpr. non
valutata)
Media punteggio
Media punteggio
Interpret.:
3.77 su 4
Interpret.:
4.62 su 5
media interpret.
su max 5: 4.67
0 poor
0 non valutati
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Interpretazione - Tappenti
Lab 6. Prescreening:
5
4
media interpret. su
max 5: 4.73
3
2
0 poor
0 non valutati
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Analisi molecolare eseguita su soggetto con ritardo
mentale. L’analisi ha evidenziato la presenza di un allele
di 29 (+/-1) ripetizioni CGG.
Il risultato consente di escludere che il ritardo mentale
sia associato a sindrome dell’X Fragile.
10 11 12 13 14 15
Interpretazione - Ellicine
5
4
3
2
1
0
media interpret. su
max 5: 4.36
0 poor
1 non valutato
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Metodo: analisi eseguita tramite FRAXA 1 KitFL Experteam.
Efficienza diagnostica: il sistema utilizzato non identifica
espansioni superiori a 100 triplette CGG, mosaicismi, mutazioni
puntiformi/delezioni e non valuta lo stato di metilazione
del promotore FMR1
Interpretazione risultato
Mosaici Norm /Full (1 % dei pz con s. X Fragile)
Referazione - Pettorbi
Refertazione
4
3
2
media refertaz.
su max 4: 3.57
1
0 non valutati
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
VIII Turno 2012
IX Turno 2013
12 Non valutate
1 Non valutata
Media punteggio
Media punteggio
Refertaz.: 3.16
Refertazione - Aberuste
4
su 4
Refertaz.: 3.55
su 4
Lab 2. Schema completo:
3
media refertaz.
su max 4: 3.55
2
0 non valutati
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Refertazione - Tappenti
4
3
media refertaz.
su max 4: 3.55
2
1
0 non valutati
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
Refertazione - Ellicine
2
media refertaz.
su max 4: 3.52
1
1 non valutato
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15
RISULTATO: l’analisi molecolare, ha evidenziato
la presenza di un allele espanso maggiore di
200 ripetizioni CGG.
CONCLUSIONI: Il risultato depone per una
diagnosi di portatore della mutazione del gene
FMR-1 responsabile della Sindrome dell'X Fragile.
Si consiglia una consulenza genetica.
mutazione completa : 2 eventi mutazionali:
- espansione >200 CGG
- metilazione promotore gene FMR1
N.B. >200 CGG ma promotore NON metilato
>>> High Functioning males
4
3
SB (no dati grezzi) / MS-PCR
>200 CGG
È necessario riportare lo stato di metilazione
del promotore FMR1 per definire se il genotipo
si associa alla s. X Fragile
Carenze riscontrate ancora frequentemente
Dati grezzi di qualità non ottimale
10 (3 laboratori)
sensibilità e specificità analitica
non riportate
12 (3 laboratori)
Sensibilità diagnostica
non riportata
24 (6 laboratori)
Raccomandazioni sul Referto:
• Occorre esplicitare l’indicazione clinica all’indagine
• Si consiglia inserire i numeri di pagina anche quando il referto è redatto in una pagina (1/1)
• Nell’anonimizzazione del referto per la partecipazione al CEQ, si consiglia di lasciare “le voci” riguardanti l’intestazione per
farne capire la struttura.
•
Le categorie alleliche sono:
il limite di accuratezza delle triplette varia a seconda della categoria allelica
Normale <45 CGG
(±1) <45 CGG
Intermedio 45-54 CGG
(±2) 45-54 CGG
Premutazione 55-200 GG
(±3) tra 55-80
Mutazione completa >200 CGG
(±4) tra 81-200 CGG
Terminologia
“I risultati ottenuti sono compatibili con un maschio selvatico (sano) al locus FMR-1”;
Ellicine Valerio
Pettorbi Mario
Tappenti Giulio
anche il termine Sano è poco appropriato, in questo caso sarebbe opportuno indicare:
"genotipo maschile con un numero di triplette CGG nel range della normalità"
L’indicazione all’estensione dell’analisi ai genitori è inappropriata;
il paziente è maschio e la sindrome è legata all'X è sufficiente indicare l’analisi alla madre
(0,5)
Linguaggio inadeguato:
Aberuste Maria
Non si può parlare di "femmina emizigote", ma di "femmina eterozigote" per la premutazione
(0,5)
Note :
Contaminazione in reazioni PCR : deve essere esclusa inserendo gli opportuni controlli negativi (Bianco)
Contaminazione Materna in Diagnosi Prenatale : deve essere SEMPRE esclusa con opportuna analisi di microsatelliti.
Rare varianti genetiche : scelta accurata di coppie di primers può scongiurare l’allele ‘drop out’
Erronee identificazioni di paternità : argomento da trattare in sede di colloquio per la raccolta del consenso informato
Scambi di campioni : deve essere escluso assicurando
• tracciabilità del campione mediante per es. Codice a Barre;
• identificazione paziente con ameno 2 elementi (Cognome-Nome e codice laboratorio-ID)
• buona pratica: per es. confermare una mutazione mediante ripetizione dell’analisi a partire dal campione originale (sangue
periferico. ecc )
Si ritiene, pertanto, non opportuno inserire questa nota nel referto.
E' Importante indicare invece :
Sensibilità diagnostica probabilità che un Test genetico sia Positivo in un
soggetto affetto/portatore. (detection rate) (permette di valutare i «falsi negativi»)
Specificità diagnostica del test : probabilità che un Test genetico sia
Negativo in un soggetto normale. (permette di valutare i «falsi positivi»)
ACCURATEZZA del Sizing
Distribuzione del n. CGG riportati su referto
6
9
8
allele Premutato di Aberuste
allele normale di Aberuste
5
7
4
6
5
3
4
3
2
1
2
Lab 4
Lab 9
Long
PCR
PCR convenz.
Agaroso ABI 3730
Lab 3
TP-PCR
0
15
1
18
2
19
3
20
4
21
5
23
6
1
0
80
1
81
2
84
3
85
4
86
5
90
6
92
7
893
94
9
96
10
9
allele normale di Ellicine
8
Metodi
7
Southern blot
6
Amplidex TM FMR1 PCR Kit, asuragen (TP PCR)
5
PCR convenzionale (Fu et al 1991)
Amplidex TM FMR1 mPCR Kit, asuragen (mPCR)
4
MLPA ME029-B2, MRC Holland
3
2
1
FRAXA PCR kit, Experteam
Lab 4
Lab 9
Long
PCR
PCR convenz.
Agaroso ABI 3730
Methyl sensitive PCR
Long PCR
0
22
1
25
2
26
3
27
4
28
5
29
6
N. di Lab
7
6
5
3
2
2
1
1
97
11
Long PCR
Elettroforesi Agarosio
Southern blot
TP-PCR
bp 289,68 – 230= bp 59,68:3= 19,89 >> 20 CGG
bp 289,68 – 221= bp 68,68:3= 22,89 >> 23 CGG
Usare Macro introducendo
Fattore di correzione
e Fattore Mobilità (settato su strumento)
CGG
18
30
32
56
85
116
X
bp
283,35
318,66
324,45
395,25
478,81
569,33
Y
bp 600
y=m0X + C0
y = 2,916007x + 231,192614
R² = 0,999987
500
400
300
200
100
m0= fattore di mobilità
C0 = fattore di correzione
m0 e C0 vanno inseriti nella macro
0
0
50
100
CGG Repeats
150
Obbiettivo >> Accuratezza e Standardizzazione del sizing CGG
RINGRAZIAMENTI
Anna Ravani Silvia Russo -
Laboratorio di Genetica Molecolare, U.O. Genetica Medica,
AO Universitaria Ferrara
Laboratorio Genetica
Istituto Auxologico Italiano - Cusano Milanino, Milano
Federica Censi
Fabrizio Tosto
Giovanna Floridia
Domenica Taruscio
Controllo Esterno di Qualità in Genetica Molecolare

Download Report