Kanthapura Raja Rao

Seconda Università degli Studi di Napoli
DiSTABiF
Anno Accademico 2013-14
Corso di Laurea Magistrale in
SCIENZE DEGLI ALIMENTI E DELLA NUTRIZIONE UMANA
Insegnamento di
BIOCHIMICA e BIOTECNOLOGIE
degli ALIMENTI
Prof. Augusto Parente
Lezione 19-2
Le matrici alimentari animali o vegetali contengono migliaia di differenti
composti, sia di interesse nutrizionale che non.
Questi ultimi comprendono contaminanti ambientali, tossine microbiche
e vegetali, farmaci.
Pertanto sono disponibili o vengono messi a punto metodi e test per:
1- ISOLARE
2- IDENTIFICARE
3- QUANTIFICARE
In maniera precisa, accurata, sensibile i composti di interesse
Le matrici di partenza possono essere liquide o solide
Latte di vacca pastorizzato, intero
Categoria
Latte e Yogurt
Codice Alimento
135010
Nome Scientifico
Note
un litro di latte pesa 1030 g
Ripartizione percentuale dell'energia
Composizione
percentuale
Proteine
21%
Lipidi
51%
Carboidrati
28%
Alcool
0%
COMPOSIZIONE CHIMICA E VALORE ENERGETICO PER 100g di PARTE EDIBILE
Composizione chimica
Parte edibile (%):
Acqua (g):
Proteine (g):
Lipidi (g):
Colesterolo (mg):
Carboidrati disponibili
(g):
Amido (g):
Zuccheri solubili (g):
Fibra totale (g):
Fibra solubile (g):
Fibra insolubile (g):
Alcol (g):
Energia (kcal):
Valore per 100g
100
87
3.3
3.6
11
Energia (kJ):
268
4.9
0
4.9
0
0
0
0
64
Note
COMPOSIZIONE CHIMICA E VALORE ENERGETICO PER 100g DI PARTE
EDIBILE
Composizione chimica
Valore per 100g
Note
Sodio (mg):
50
Potassio (mg):
150
Ferro (mg):
0.1
Calcio (mg):
119
Fosforo (mg):
93
Magnesio (mg):
12
Zinco (mg):
0.38
Rame (mg):
0.02
Selenio (µg):
1.6
Tiamina (mg):
0.04
Riboflavina (mg):
0.18
Niacina (mg):
0.1
Vitamina A retinolo
37
5
eq. (µg):
Vitamina C (mg):
1
Vitamina E (mg):
0.07
Composizione
Proteine(%):
3.3
Lisina:
Istidina:
Arginina:
Acido aspartico:
Treonina:
Serina:
Acido glutamico:
Prolina:
Glicina:
Alanina:
Cistina:
Valina:
Metionina:
Isoleucina:
Leucina:
Tirosina:
Fenilalanina:
Triptofano:
Indice Chimico:
Aminoacido
limitante:
COMPOSIZIONE IN AMINOACIDI
mg/100g di parte
g/100g Proteine
edibile
272
93
105
269
164
203
771
371
70
119
37
233
81
192
355
142
176
50
100
7.77
2.66
3
7.69
4.69
5.8
22.03
10.6
2
3.4
1.06
6.66
2.31
5.49
10.14
4.06
5.03
1.43
Trp
Note
COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI
Composizione
g/100g di parte edibile
Lipidi totali(%):
3.6
Saturi totali (%):
2.11
C4:0÷C10:0
0
C12:0
0.11
C14:0
0.37
C16:0
0.92
C18:0
0.39
C20:0
0
C22:0
0
Monoinsaturi totali (%):
1.1
C14:1
0.07
C16:1
0.1
C18:1
0.93
C20:1
0
C22:1
0
Polinsaturi totali (%):
0.12
C18:2
0.07
C18:3
0.05
C20:4
0
C20:5
0
C22:6
0
Altri Componenti acido fitico (g)
0
Rapporto Polinsaturi/Saturi:
0.1
Tabella di composizione degli alimenti
Bovino adulto o vitellone - costata –
[tessuto muscolare privato del grasso visibile]
Categoria
Carni Fresche
Codice Alimento
101150
Nome Scientifico
Bos taurus
Ripartizione percentuale dell'energia
Composizione
percentuale
Proteine
61%
Lipidi
39%
Carboidrati
0%
Alcol
0%
COMPOSIZIONE CHIMICA E VALORE ENERGETICO PER 100g DI PARTE
EDIBILE
Composizione chimica
valore per 100g
Note
Parte edibile (%):
Acqua (g):
Proteine (g):
Lipidi(g):
Colesterolo (mg):
Carboidrati disponibili
(g):
Amido (g):
Zuccheri solubili (g):
Fibra totale (g):
Fibra solubile (g):
Fibra insolubile (g):
Alcol (g):
Energia (kcal):
Energia (kJ):
100
71.6
21.3
6.1
0
0
0
0
0
0
0
140
586
COMPOSIZIONE CHIMICA E VALORE ENERGETICO PER 100g DI PARTE
EDIBILE
Note
Composizione chimica
valore per 100g
Sodio (mg):
41
Potassio (mg):
313
Ferro (mg):
1.3
Calcio (mg):
4
Fosforo (mg):
172
Magnesio (mg):
16
Zinco (mg):
3.3
Rame (mg):
0.04
Selenio (µg):
Tiamina (mg):
0.1
Riboflavina (mg):
0.12
Niacina (mg):
4.2
Vitamina A retinolo eq.
tr
(µg):
Vitamina C (mg):
0
Vitamina E (mg):
Composizione
Proteine(%):
21.3
Lisina:
Istidina:
Arginina:
Acido aspartico:
Treonina:
Serina:
Acido glutamico:
Prolina:
Glicina:
Alanina:
Cistina:
Valina:
Metionina:
Isoleucina:
Leucina:
Tirosina:
Fenilalanina:
Triptofano:
Indice Chimico:
Aminoacido limitante:
COMPOSIZIONE IN AMINOACIDI
mg/100g di parte
g/100g Proteine
edibile
1938
822
1278
2066
869
871
3632
875
1059
1310
232
1029
611
920
1832
754
869
239
100
8.96
3.83
6.16
9.68
4.08
3.95
16.51
4.21
5.22
6.14
1.04
4.67
2.87
4.29
8.33
3.37
3.99
1.08
Trip.
Note
COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI
Composizione
g/100g di parte edibile
Lipidi totali(%):
6.1
Saturi totali (%):
2.03
C4:0÷C10:0
0
C12:0
0
C14:0
0.13
C16:0
1.06
C18:0
0.74
C20:0
0
C22:0
0
Monoinsaturi totali (%):
1.99
C14:1
0.09
C16:1
0.15
C18:1
1.53
C20:1
0
C22:1
0.15
Polinsaturi totali (%):
1.21
C18:2
0.57
C18:3
0.11
C20:4
0.16
C20:5
0.14
C22:6
0.07
Rapporto Polinsaturi/Saturi:
0.6
PRINCIPIO
- ALIMENTI DA MATRICI SOLIDE E LIQUIDE
MATRICI SOLIDE
- ROMPERE LA STRUTTURA CELLULARE;
- REINTRODURRE UN NUOVO ORDINE SULLA BASE DELLE SEGUENTI
PROPRIETÀ PRINCIPALI:
1) Solubilità (in soluzioni saline; in solventi organici; al variare del
pH della soluzione; al variare della temperatura, ecc.);
2) Adsorbimento e ripartizione tra fasi;
3) Proprietà acido-basiche (cromatografia a scambio ionico;
elettroforesi; focalizzazione isoelettrica; …);
4) Grandezza molecolare (setaccio molecolare/gel-filtrazione;
ultracentrifugazione; ..);
5) Proprietà idrofobiche (cromatografia ad interazione idrofobica;
cromatografia a fase inversa);
6) Proprietà biologiche (cromatografia di affinità)
Si definisce una soluzione tampone una soluzione che si oppone alla
variazione del pH per aggiunte moderate di acidi o basi.
Si tratta generalmente di soluzioni di un acido debole e il suo sale con una
base forte (per esempio il sistema acido acetico - acetato di sodio) o,
viceversa, di una base debole e il suo sale con un acido forte (per esempio il
sistema ammoniaca - cloruro d'ammonio) o ancora di un sale, di una base
debole e di un acido debole di acidi e basi forti concentrate.
Sistemi tampone di uso comune
pK
4,75
Acido acetico - acetato di sodio
Acetato d'ammonio
Carbonato d'ammonio
6,10 e 10,22
Bicarbonato di sodio
Bicarbonato di sodio - carbonato di sodio
Fosfato di sodio mono e bibasico
1,93, 6,70 e 12,30
Tricina (N-tris(idrossimetil)metilglicina)
10,0
HEPES (acido N-2-idrossietilpiperazina-N’-2-etansulfonico)
7,50
Tris. HCl (2 ammino-2-idrossimetil propano 1,3-diolo)
8,14
Omogenati di organi, tessuti e cellule
Il tipo più semplice di modello in vitro per gli organismi multicellulari è quello dell’omogenato.
L’omogeneizzazione distrugge il tessuto e rilascia i componenti intracellulari in sospensione.
Queste miscele preliminari (crude) possono essere direttamente utilizzate per l’analisi di enzimi
o per studi in cui il rilascio di un metabolita o un composto xenobiotico all’interno di tessuti
integri può risultare difficoltoso.
L’omogeneizzazione viene anche usata come fase preliminare per la purificazione parziale di
organuli cellulari per gli studi sulla compartimentazione metabolica.
Per il successo della omogeneizzazione sono molto importanti la scelta del tessuto, le proprietà
fisiche e chimiche della soluzione fisiologica usata ed il metodo impiegato per la distruzione
delle cellule.
Il materiale biologico deve essere ricco di organuli specifici e molto attivo nei processi
metabolici di interesse (es. fegato per mitocondri, timo per nuclei).
La soluzione impiegata è fondamentale per preservare gli organuli, l’integrità metabolica e, se
necessario, prevenire alcune attività enzimatiche. Essa deve mantenere le condizioni
isosmotiche, un adatto pH e gli ottimali livelli di ioni inorganici.
Di seguito sono elencati alcuni componenti delle soluzioni e la loro funzione.
Componente
Saccarosio
Funzione
Agente osmotico
2-mercaptoetanolo,
DTT, DTE, cisteina
Citrato
Agenti riducenti
EDTA o EGTA
Mg++
Disattivante della
desossiribonucleasi
neutra
Agenti chelanti
(rimozione di cationi)
Catione bivalente
Impiego
Prevenire il rigonfiamento
e l’esplosione degli
organuli
Riduzione dei ponti
disolfuro degli enzimi
Preservazione dei nuclei
Inattivazione delle proteasi
di membrana
Preservare l’integrità del
nucleo e dei ribosomi
Distruzione delle cellule
Le procedure di omogeneizzazione (così come quelle di purificazione delle proteine!) implicano
necessariamente una fase di distruzione cellulare.
La scelta del metodo dipende dalla natura della parete/membrana cellulare da distruggere.
Cellule di mammifero.  10 um.
Membrana plasmatica
Cellule batteriche.  1-4 um. Parete
estremamente rigida (peptidoglicani)
Cellule vegetali.  10o um. Parete rigida
(complessi di carboidrati, lignina o cera)
Cellule di funghi e lieviti.  vario. Parete
estremamente rigida (polisaccaridi)
Metodi di distruzione delle cellule
Meccanici, chimici ed enzimatici.
Omogeneizzatori.
Apparecchi che sfruttano le forze taglianti. Il
tessuto viene tagliato in piccoli pezzi e frullato,
in presenza di tampone. Utilizzabili per tessuti
animali e vegetali. Per adattarlo ai
microrganismi occorre introdurre piccole sfere
di vetro che, collidendo, riescono a distruggerli.
I sistemi più noti sono il Waring-Blender ed il
Polytron.
Frantumazione con abrasivi.
Strumenti e additivi (mortai, sabbia,
allumina,
ecc.)
che
disgregano
efficacemente pareti cellulari (e/o matrici
extracellulari) molto resistenti.
Sonicatori.
Bagni o sonde ad immersione capaci di
generare onde sonore ad alta
frequenza (ultrasuoni). La distruzione
delle cellule avviene per il fenomeno
denominato cavitazione, ossia la
formazione durante la fase di pressione
negativa di milioni di piccole bolle che,
in una delle successive fasi di
compressione, implodono con un
drastico e improvviso cambiamento
della temperatura e della pressione
nella zona interessata.
ALTRI METODI MECCANICI.
La French Press è il sistema più impiegato per
cellule con parete estremamente rigida (microbi).
La sospensione cellulare viene sottoposta ad
elevatissime pressioni ed esce dalla camera
pressurizzata attraverso un piccolo foro.
La rottura avviene a causa del repentino calo di
pressione.
Gli omogeneizzatori Dounce e Potter-Elvehjem
distruggono le cellule forzandone il passaggio
(mediante pressione esercitata manualmente o
automaticamente) attraverso il ristretto spazio
tra pestello e parete.
Metodi enzimatici.
Le pareti cellulari possono essere
degradate utilizzando enzimi specifici.
Il lisozima ad esempio taglia i
peptidoglicani e può essere quindi
utilizzato per i batteri mentre zimolasi e
liticasi esercitano la medesima funzione
sulle pareti dei lieviti.
La chitinasi viene invece impiegata per i
funghi filamentosi.
Shock osmotico.
L’utilizzo di una soluzione ipotonica
determina l’esplosione delle membrane
cellulari a causa della penetrazione del
solvente nelle cellule. Il metodo può essere
impiegato per le cellule non dotate di
parete oppure congiuntamente ad altri
metodi.
Congelamento/Scongelamento.
L’integrità delle cellule può essere
anche danneggiata da rapidi cicli di
congelamento/scongelamento.
L’acqua presente all’interno della
cellula, formando cristalli di
ghiaccio, aumenta di volume e
rompe le membrane.
Anche in questo caso il trattamento
è adatto alle cellule prive di parete.
Detergenti e solventi organici.
Le membrane possono essere
disgregate mediante l’azione di
detergenti come l’SDS o solventi
organici come il butanolo che
dissolvono
il
doppio
strato
fosfolipidico e liberano il contenuto
cellulare insieme alle proteine di
membrana.
La scelta del tampone
Soluzioni tampone:
Gli organismi e le cellule, in genere, possono resistere ad ampie variazioni di pH
dell’ambiente esterno.
I processi cellulari, al contrario, sono sensibili ai cambiamenti di pH e avvengono in un
medium il cui pH è rigidamente controllato.
La massima parte dei processi cellulari avviene ad un pH circa neutro (7.2-7.4).
Gli studi in vitro richiedono l’utilizzo di sistemi tampone con determinati requisiti:
1) possedere una buona capacità tamponante nell’intervallo di pH richiesto;
2) essere disponibile commercialmente;
3) essere molto solubile in acqua e impermeabile alle membrane biologiche;
4) essere enzimaticamente e idroliticamente stabile;
5) possedere un valore di pH poco influenzabile dalla concentrazione, temperatura
composizione del mezzo;
6) non essere tossico;
7) formare complessi solo con cationi solubili;
8) non assorbire la luce nella regione del visibile o dell’ultravioletto.
Soluzioni fisiologiche
(PM= 58,44 g -> NaCl 0,9%; 900mg/100 mL; 9g/L; 0,154 M)
Le soluzioni fisiologiche comprendono soluzioni tampone impiegate
per incubazioni di breve durata e medium di crescita a lungo termine
di colture cellulari, piante o tessuti animali.
Le proprietà chimico fisiche delle soluzioni sono pensate per
minimizzare gli artefatti e la loro composizione tende a mimare
quella dei fluidi corporei.
Fattori cruciali delle soluzioni fisiologiche sono la isotonicità del
medium rispetto alle cellule e la capacità tamponante ad un pH
fisiologico.

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