15-AFM

ATOMIC FORCE MICROSCOPY
(AFM)
Scanning probe microscopy
Strumenti basati sulla interazione a corto raggio
Costruiscono un’immagine del campione in osservazione attraverso l’interazione di
una sonda con gli strati atomici superficiali
microscopia di superficie
Scanning Tunneling microscopy (STM)
Atomic Force Microscopy (AFM)
Binnig and Rohrer 1982
Binnig, Quate and Gerber (1986)
(Nobel prize in 1986)
STM
AFM
Utilizza la corrente di tunnel tra
punta e campione conduttore
Utilizza la forza di interazione
tra gli atomi
•Metalli
•Semiconduttori
•Molecole biologiche (es. DNA)
•Strutture non periodiche
• Materiali sia isolanti sia conduttori
• Alta versatilità
• Semplicità di utilizzo
• Alta risoluzione (0.1Å verticale, 1.0Å
laterale)
• Non distruttività
• Nessuna preparazione del campione
FORZE COINVOLTE
Forze separazione punta-campione: 10-13 N - 10-6 N
• Forze di Van der Waals (di dispersione)
• Repulsione ionica
• Forze di attrito
• Forze di adesione
• Forze elettrostatiche
• Forze magnetostatiche
Tra due atomi uniti da legame covalente alla distanza di ~0.1 nm
agisce una forza di circa 10-9 N
Le misure eseguite con l’impiego dell’AFM non sono distruttive.
Un microscopio a forza atomica è costituito da:
sensore a fotodiodo
registra i movimenti del
raggio laser in rapporto a
quelli del cantilever
sensore a leva (cantilever)
risente delle interazioni
con il campione
Servocontrollo
(feedback)
regola la distanza
tra superficie della
punta e campione in
base al sistema di
acquisizione
scanner piezoelettrico che consente
di muovere il campione in tutte e tre
le direzioni
Principio di funzionamento
Piezoscanner (PZT)
Elettrodi
esterni
A)
B)
A) Potenziale applicato tra i quattro
elettrodi esterni e quello interno
B) Potenziale applicato tra due
elettrodi esterni e quello interno
Elettrodo
interno
DETECTOR
9Posiziona il laser sulla punta
9Massimizza l’intensità del laser
PUNTE
a)
b)
c)
a) punta normale (normal tip), costituita da una piramide schiacciata alta ~3 µm con
raggio di curvatura di ~30 nm
b) superpunta (supertip), prodotta mediante bombardamento elettronico di una
punta normale. La superpunta è più lunga e sottile di una punta normale ed ha
anche un migliore raggio di curvatura
c) ultralever, ancora più sottili e lunghe (100 µm) delle superpunte e possono avere
raggi di curvatura fino a ~10 nm. Le più diffuse sono la punta standard di nitruro
di silicio (Si3N4) e le punte di silicio.
PUNTE
Punte di nitruro di silicio piramidali o tetraedriche
PUNTE
La necessità di ricoprire la punta si basa essenzialmente su
tre motivi:
• la punta non ricoperta è ricca di gruppi silanolici liberi che
potrebbero adsorbire contaminanti capaci di alterare la
composizione della superficie
• senza copertura la punta è molto più fragile e tende a
rovinarsi con un suo uso prolungato impedendo di usare la
punta per un elevato numero di analisi
• poiché la superficie è altamente idrofila essa potrebbe
alterare l’equilibrio del campione soprattutto in campioni
particolarmente delicati come quelli biologici
Copertura delle punte
Tiolialcani: copertura con cromo seguita da ricopertura in
oro funzionalizzato con gruppi alchiltiolici che possono
essere variamente modificati. La ricopertura in metallo
aumenta notevolmente lo spessore della punta riducendo la
risoluzione dello strumento
Organosilani: interagiscono direttamente con i gruppi OH
con la formazione di un film protettivo costituito da una
rete di legami Si-O-Si. Questo metodo protegge la punta
senza bisogno di ricorrere alla ricopertura con metalli.
Particelle colloidali: Il metodo più diffuso consiste nel
ricoprire la punta direttamente con microsfere di silicone
CANTILEVERS
I cantilevers
sono lunghi
alcune
centinaia di
µm
La costante elastica (k) dei cantilevers deve essere inferiore a quella di un
sistema di atomi in un solido (~ 10 N/m) . 10-3 < K < 10 N/m
Essa dipende da forma, dimensioni e materiale
Cantilevers più spessi e corti sono più rigidi ed hanno frequenze di risonanza
più alte (range 1-100 Hz)
Modalità di lavoro
Contact mode-forze repulsive (pochi Å)
• force mode (punta ad altezza costante)
segnale dal piezoelettrico
•deflection mode (punta ad altezza costante)
segnale dal fotodiodo
• height mode (punta ad oscillazione costante)
Non-contact mode-forze attrattive
la punta è mantenuta a distanza (tra 5 e 15 nm) dal
campione e oscilla secondo forze di attrazione del
campione stesso
Tapping mode
la leva è fatta oscillare vicino a frequenza di
risonanza in modo che abbia contatto transiente
con la superficie del campione
Curva forza-distanza
Nel “contact mode”, la leva è mantenuta
a distanza inferiore a pochi angstroms
dalla suoerficie del campione e la forza
di interazione è di tipo repulsivo.
Nel “non-contact mode”, il cantilever è
mantenuto alla distanza di 10-100
angstroms dal campione e la forza di
interazione è di tipo attrattivo.
Diagramma dell’andamento di energia potenziale
tra campione e sonda
Contact mode
E’ modalità più utilizzata e richiede cantilever morbidi.
FORZE IN GIOCO:
•Forza repulsiva di Van der Waals
•Forze capillari attrattive
•Forza esercitata dal cantilever (dipende da costante di
elasticità)
Contact mode: altezza costante
Distanza mantenuta costante: è
misurata la forza necessaria per
mantenere la leva ad altezza
costante
ALTA PROBABILITA’ DI DANNEGGIAMENTO PUNTA E CAMPIONE
Contact mode: oscillazione (o forza)
costante
Ampiezza di oscillazione mantenuta
costante: è misurata la forza
necessaria per mantenere costante
la deflessione della leva
E’ misurata la forza di interazione tra superficie e punta
Lateral force AFM (LFM)
Le forze laterali di attrito (frizione) determinano torsione della punta
Contact Mode AFM
Vantaggi:
- Alta velocità di scansione
- “risoluzione atomica”
- facilità di scansione di campioni con molti cambiamenti nella
topografia verticale
Svantaggi:
- Forze laterali possono distorcere l’immagine
- Forze capillari dovute ad uno strato fluido possono causare
notevoli impedimenti alla interazione sonda-campione
- La combinazione di queste forze riduce la risoluzione
spaziale e può causare danno di campioni più “morbidi”
Non-contact mode
•Forze misurate più deboli di quelle misurate in modalità contact
•Distanza punta-campione 10-100 Å
•Alla punta viene applicata una piccola oscillazione vicina a frequenza
di risonanza 100-400 kHz
•Oscillazione del cantilever dipende da frequenza di risonanza, da
costante elastica e da forza di repulsione
•Le deboli forze in gioco vengono misurate analizzando i cambiamenti
in ampiezza,
fase e frequenza delle oscillazioni della punta.
Non-contact Mode AFM
Vantaggi:
-Sulla superficie del campione è esercitata una debole
forza e non è recato danno ai campioni più “morbidi”
-Ideale per lo studio di materiali elastici
-Vengono eliminate le forze di attrito
Svantaggi:
- Bassa risoluzione laterale, limitata dalla separazione
punta-campione
- Velocità di scansione più bassa per evitare il contatto
con lo strato fluido
- Solitamente applicabile a campioni estremamente
idrofobici, ricoperti da un minimo strato fluido
Tapping mode
E’ una specializzazione del non-contact mode:
•Modalità complementare fra Contact AFM e
Non-Contact AFM
•La punta oscilla entrando anche in contatto
con la superficie del campione
Tapping mode
Tapping mode
Diverso materiale
Tappping Mode AFM
Vantaggi:
- Elevata risoluzione laterale (1 nm to 5 nm).
- Bassa forza di interazione e minore danno a campioni
“morbidi” in aria.
- Assenza di forze laterali
Svantaggi:
- Velocità di scansione più bassa rispetto al contact mode
APPLICAZIONI
•Studio di superfici cellulari
•Struttura di aggregati proteici
•Studio di legami ligando-recettore
•Struttura di acidi nucleici
Voltaggio di deflessione cantilever
FORZE ADESIVE DI CONTATTO
Approach
Retract
3
1
2
4
surface
ADHESION
or pull-off
force
Distanza di separazione
1) a larghe distanze tra punta e
campione non ci sono interazioni
tra i due
1
Lontano dalla
superficie
2) muovendo il campione verso la
punta si evidenziano interazioni
tra i due che si riflettono nel
movimento della leva e della
punta
2
Attrazione alla
superficie
3) avvicinando ulteriormente il
campione la leva si flette
3
4)
allontanando il campione dalla
punta la leva si deflette a causa delle
forze di adesione tra i due fino al 4
distacco
Cantilever si
flette
Rilascio
Se non sussistono interazioni di adesione tra campione e punta
all’avvicinarsi del campione alla punta non si registrano forze di
adesione e si assiste solo alla flessione della leva dovuta alla
semplice pressione del campione sulla punta ma non si verifica
nessun fenomeno di flessione della leva allontanando il campione.
A
Superficie di
spore
dormienti (A)
e germinative
(B) di
Aspergillus
Oryzae
B
Saccharomyces
cerevisiae
50 nm
50 nm
Superficie di spore
di Aspergillus
nidulans
Superficie di
conidi di
Ceratocystis
fimbriata
200nm
Funzionalizzazione di punte
•anticorpi
•recettori
•enzimi
La deflessione
misura la forza di
legame
Biotinylated proteins were separated by electrophoresis and fixed with crosslinking chemicals on the gel, followed by direct force measurement between the
biotinylated proteins on the gel and a streptavidin-modified tip of an AFM
cantilever.
Funzionalizzazione con streptavidina della punta AFM ricoperta d’oro
utilizzando PEG come cross-linker
PEG cross-linking
Thiol solution
Streptavidin
derivatization
BSA
Immagine di sezione di gel colorato con Coomassie Brillant Blue
500ng di BSA-Strept sono stati applicati in SDS PAGE
Curve di forza
contr
no-inter
adesione
singola forza di
attrazione
multipla forza di
attrazione
Calibrazione dello strumento
Results
Force curves analyzed on the various conditions of gel surfaces; on gels containing
biotinylated BSA (A),on gels containing biotinylated BSA ininhibition condition (B), on
gels containing normal BSA (C), and on normal gels (D) . Approach and release curves are
shown in gray and black color,respectively.
Results
Comparison of unbinding force distribution. Histogram of unbinding force on normal gel
(graydashedlines), on the gel containing BSA (graylines) and on the gel containing
biotinylated-BSA (blacklines). Specified amounts of proteins were applied for gel
electrophoresis, such as 500ng for (A) and (B), 500 pg for (C) and 5pg for (D).
As a negative control experiment, free biotin was added in the experimental buffer for
force measurement to make the histogram of (B).
Results
Comparison of the detection limit of proteins
with different methods. Scanned images and
optical density profiles of CBB and silver
stained electrophoresis gel (A), and stained
dot-blot (B). The f 100 ratio values in our
proposed method (C). The frequency to
obtain an interaction force larger than
100pN was divided by the total frequency to
obtain an interaction force to get f 100 ratio
values.
• Le proteine Munc-18-1, SH3 e
PX sono state ottenute come
fusione con GST
•Le punte ed il supporto sono
derivatizzati con GSH
Phox homology
domain (PX)

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