IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO G2677T del

IDENTIFICAZIONE DEL POLIMORFISMO
G2677T del GENE MDR1
(Farmacoresistenza digossina chemioterapici antitumorali)
AMPLI-set-G2677T MDR1 RT
Cat. n. 2.006RT
Il gene ABCB1, anche noto come gene della resistenza multipla (MDR1), è il trasportatore molecolare meglio caratterizzato
attraverso la sua capacità di conferire un fenotipo MDR alle cellule tumorali che hanno sviluppato resistenza ai farmaci.
Il gene MDR1 codifica per una glicoproteina-P (PgP), che svolge un ruolo importante nello sviluppo della resistenza a molti
chemioterapici antitumorali precludendone l’accumulo a livello delle cellule neoplastiche in caso di superespressione. Più in
generale, la PgP è responsabile dell’escrezione biliare e renale di molti farmaci e ne può modificare l’assorbimento intestinale o il
passaggio a livello del SNC. Queste strutture proteiche sembrano essere una sorta di cancello intelligente attraverso il quale le cellule
dell’organismo umano possono regolare l’entrata o l’uscita dal citoplasma di particolari sostanze. Queste possono essere non solo
fattori indispensabili per la vita della cellula che per diversi motivi non attraverserebbero la membrana cellulare (macromolecole o
sostanze idrofobiche), ma anche gli stessi prodotti del metabolismo della cellula che se non eliminati al più presto potrebbero
compromettere la vitalità stessa del cellula e la funzionalità dell’organo corrispondente.
Due polimorfismi frequentemente riscontrati nella popolazione caucasica sono localizzati negli esoni 21 (2677G→T) e 26
(3435C→T). Il polimorfismo G2677T nell’esone 21 è responsabile della sostituzione aminoacidica Ala893Ser, mentre il
polimorfismo C3435T nell’esone 26 comporta l’insorgenza di una mutazione silente, responsabile dell’alterazione dei livelli di
espressione della proteina MDR1. Questi polimorfismi sono associati ad alterazioni nella farmacocinetica di vari farmaci tra i quali la
digossina e numerosi chemioterapici antitumorali.
Il kit permette l’identificazione del polimorfismo G2677T del gene MDR1, mediante la tecnica della Real-time PCR. La ricerca di
tale polimorfismo viene eseguita previa amplificazione con primers specifici ed ibridazione con un probe che riconosce una sequenza
interna.
Nel kit utilizzato per la rivelazione del polimorfismo G2677T, il probe che riconosce la sequenza wt (allele G) è coniugata al reporter
FAM, mentre quello che riconosce la sequenza polimorfica (allele T) è coniugato al reporter JOE.
Principio del metodo:
A) estrazione del DNA genomico
B) amplificazione e rivelazione mediante l’utilizzo
dell’apparecchio real-time PCR.
Applicabilità: Su DNA genomico estratto e purificato da
campioni di Sangue Intero.
Numero di Test: 50.
CONTENUTO DEL KIT E SUA CONSERVAZIONE
AMPLIFICAZIONE
PCR mix 2X
H2O sterile
Primer-probe mix 20X
Controllo positivo normale (GG)
Controllo positivo omoz. Mutato (TT)
Controllo positivo Eterozigote
+4°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
-20°C
Stabilità: superiore a 18 mesi se correttamente conservato.
Materiali Richiesti: tubi da 1,5 ml; portaprovette refrigerato;
puntali sterili con barriera antiaerosol; piastra da 96 pozzetti.
Reagenti richiesti non compresi nel kit: acqua bidistillata
sterile, cloroformio, etanolo 100 %, etanolo 70 %.
Per l'estrazione del DNA si consiglia di utilizzare il seguente
kit:

Kit Estrazione DNA da Sangue intero - cat. n. 101
Strumenti richiesti:
Centrifuga con rotore ad angolo fisso per provette da 2 ml
(12.000 x g) e centrifuga a rotore oscillante con adattatori per
provette da 15 ml (1.500 x g);
Set di pipette pre-PCR e post-PCR
1) 0.5 – 10 microlitri
2) 5 – 50 microlitri
3) 50 – 200 microlitri
Cappa Biohazard classe II; strumentazione real-time PCR.
Tutti i materiali necessari all’esecuzione del test devono
essere sterili, DNase/RNase free e monouso.
INTERPRETAZIONE DEI RISULTATI
L’ analisi dei risultati sarà effettuata dal programma specifico
(ALLELIC DISCRIMINATION) dello strumento Real-time
PCR precedentemente impostato. In ogni caso, comunque,
risulta utile analizzare anche i grafici dell’AMPLIFICATION
PLOT, per accertarsi che la reazione sia avvenuta in modo
corretto.
Allelic discrimination MDR1 G2677T
Legenda:
Rosso: Allele WT (G)
Verde: Alleli G e T
Blu: Allele MUT (T)
Amplification plots MDR1 G2677T
Legenda: Blu: Allele WT (G) Fuxia: Allele Mut (T)
Bibliografia
The Journal of Biological Chemistry (1990) 265 (1), 506-514.
Genetics and Molecular Research (2010) 9 (1), 34-40.
AAPS PharmSci (2002) 4 (4), article 29.
The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (2001) 297:1137-1143.
Rev.01

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