La PCR - Dipartimento.net

“Metodi rapidi per la determinazione dei batteri
patogeni responsabili di tossinfezioni alimentari”
Elisabetta Delibato
Centro Nazionale per la Qualità degli Alimenti e per i Rischi
Alimentari
Istituto Superiore di Sanità
Le tossinfezioni alimentari rappresentano un serio
problema di sanità pubblica per la loro relativa
frequenza e per l’alto numero di soggetti che
possono essere colpiti in un singolo evento
epidemico.
Comprendono manifestazioni patologiche in genere
a carattere gastroenterico acuto, alla cui origine
vi è il consumo di cibi contaminati da microrganismi
patogeni e/o loro metaboliti tossici.
Le tossinfezioni alimentari possono essere classificate
in:
infezioni, quando l’agente eziologico è rappresentato da
batteri vitali ingeriti con gli alimenti contaminati in
grado di riprodursi nei tessuti dell’ospite;
intossicazioni, quando la patologia è causata da tossine,
in genere preformate, elaborate negli alimenti dagli
stessi microrganismi.
Le due condizioni possono talvolta coesistere dando
luogo ad una vera e propria sindrome mista tossicoinfettiva.
Le tossinfezioni alimentari si manifestano in genere dopo
un breve periodo d’incubazione con tipiche manifestazioni
a carico dell’apparato digerente quali nausea, vomito,
diarrea.
Numerosi sono i fattori che possono causare la presenza
di microrganismi patogeni in un alimento:
•la contaminazione microbica delle materie prime e degli
ingredienti e/o additivi in genere;
•la contaminazione, anche crociata, che può avvenire durante i
processi di lavorazione e preparazione;
•la contaminazione che può avvenire nelle fasi di
confezionamento,
di
conservazione
e
distribuzione
dell’alimento.
Recenti Regolamenti Europei
L’unione Europea per rispondere alle paure del consumatore ha
attuato una serie di misure e di metodologie per garantire la
sicurezza degli alimenti “dai campi alla tavola”.
•Regolamento
comunitario
178/2002:
riduzione
ed
eliminazione del pericolo attraverso l’Analisi del rischio,
armonizzazione del Sistema di allerta Europeo, istituzione
dell’EFSA.
•“Pacchetto di igiene” estensione del Controllo Ufficiale ai
mangimi e alle materie prime; validazione dei piani HACCP
(analisi dei punti critici).
La normativa europea 93/43/CEE recepita
dal D.Lgs n.155/1997 ha stabilito che
tutte
le
imprese
(preparazionetrasformazione- trasporto e vendita) del
settore alimentare, debbano adottare una
procedura di autocontrollo nell’ambito della
propria attività.
L’autocontrollo si realizza soprattutto in attività
basate sui principi del sistema HACCP (Hazard
Analysis Critical Control Point).
Elemento-cardine per:
Øridurre
Øeliminare
i rischi microbiologici nell’intera filiera alimentare
riducendo così la perdita e la distruzione dei
prodotti danneggiati o pericolosi.
Sistema rigoroso di contenimento del rischio basato
su misure preventive, che non si affida all’analisi del
prodotto finito
Autocontrollo
D.Lvo 155/97
L’azienda è responsabile
della garanzia igienico
sanitaria dei prodotti
Il responsabile dell’industria deve
garantire che la preparazione, la
trasformazione, la fabbricazione,
il confezionamento, il deposito, il
trasporto, la distribuzione, la
manipolazione, la vendita e la
fornitura,
compresa
la
somministrazione dei prodotti
alimentari siano effettuati in
modo igienico.
Controllo ufficiale
Il controllo ufficiale deve
valutare
le
azioni
che
l’azienda
promuove
per
garantire la “continuità” dei
suoi standard igienici
Prelievo dei
campioni
Ia Analisi dei prodotti
Analisi di revisione
Denuncia
I metodi che offrono sufficienti garanzie per accertare la
sicurezza igienico-sanitaria degli alimenti possono essere
classificati in:
Metodi ufficiali
•metodi da gazzetta ufficiale;
•metodi emanati da enti di normazione (ISO,
CEE)
CEE
AOAC, FDA,
In situazioni particolari che richiedono tempi di risposta rapidi si può ricorrere a:
Altri metodi
•Metodi da letteratura scientifica
•Metodi interni
•Metodi commerciali
ISO 17025/2005; ISO/DIS 7218/2005
ISO 16140:2005
PARAMETRI
FONDAMENTALI
CONCERNENTI
L’AFFIDABILITÀ DI UN METODO
Per verificare l’affidabilità di un metodo è necessario
sottoporlo ad una procedura di valutazione e validazione
durante la quale vengono individuate le caratteristiche del
metodo stesso:
precisione;
accuratezza;
sensibilità;
specificità;
limite minimo di rilevabilità;
limite minimo di quantificazione;
praticabilità ed applicabilità;
possibili condizioni modificative (robustezza).
Un metodo può essere validato mediante confronto con altri
metodi normati e/o mediante l’analisi di materiali di riferimento
certificati. Il metodo deve essere validato mediante saggi
interlaboratorio.
METODICHE APPLICABILI ALLA DETERMINAZIONE DEI PATOGENI
ALIMENTARI
•Metodiche tradizionali affidabili ma lunghe: hanno
l’obiettivo di isolare o numerare, mediante l’impiego di
terreni colturali, i microrganismi presenti nei campioni da
sottoporre ad analisi
•Metodiche rapide presentano il vantaggio di potere
ottenere i risultati in 24 ore e consentono di prendere
misure tempestive, ai fini del rilascio dei prodotti. (ISO
16140/2005)
Tra queste le principali sono:
metodiche molecolari (che impiegano la Polymerase chain
reaction)
metodi immunologici (basati su interazioni Ag-Ab)
METODI COLTURALI CLASSICI
Prearricchimento realizzato in terreno liquido e previsto
quando i germi presenti nel campione sono stressati.
Tale fase è non selettiva e tende ad innalzare il numero
del microrganismo-bersaglio;
Arricchimento serve a limitare lo sviluppo della flora
accessoria ;
Isolamento
permette
l’identificazione
presuntiva
mediante striscio su terreni agarizzati selettivi;
Identificazione
viene
effettuata
biochimiche e sierologiche.
mediante
Langton S.D. et al. Int. J. Food Microb. 2002, 79, 175-181
Orefice L.et al. Industrie Alimentari 2004, 442, 1257-1275
prove
Ricerca della Salmonella negli alimenti: Metodo ISO 6579/2002
Campione 25g
Acqua peptonata tamponata (APT)
225 ml
Sacchetto
sterile
1
0.
1
m
l
Omogenizzazione
in "Stomacher"
per 1'
l
m
Mueller Kauffman
(10 ml)
41.5 °C x 24 h
37 °C x 24 h
37°C x 24 h
Rappaport
Vassiliadis
Soya
broth (10 ml)
1 ansata
1 ansata
XLD
BGA
DES
37°C x 24h
Prelievo
colonie
sospette
XLD
BGA
XLD
BGA
37°C x 24h
Triple
sugar
iron
agar
Test di agglutinazione
BGA
La PCR
•Sistema di amplificazione enzimatica di uno specifico
segmento di DNA ad opera della Taq-polimerasi.
•L’amplificazione ciclica avviene in un Thermal Cycler ed è
resa possibile in quanto i prodotti dell’estensione dei
primers sintetizzati nel ciclo n fungono da ulteriore stampo
per il ciclo n+1.
•La PCR richiede la conoscenza delle sequenze che
delimitano la regione da amplificare (target).
ISO 22174 del 2003 : PCR per la determinazione
dei patogeni negli alimenti
•arricchimento della matrice contenente i germi patogeni
•estrazione e purificazione degli acidi nucleici
•amplificazione del target utilizzando i primers specifici
•determinazione dei prodotti della PCR
Controlli richiesti per l’analisi dei campioni alimentari
Food-PCR.dk
Malorny B. et al. Int. J. Food Microb. 2003, 83, 39-48
Estrazione di DNA batterico
•trattamento termico a elevate temperature
•detergenti ed enzimi (proteinasi K); trattamento con
fenolo-cloroformio
•lisi alcalina
•colonnine nucleospin
Chelex 100
E s e m p i d i p r o c e d im e n ti d i e s tr a z io n e d i a c id i n u c le ic i
D N A B A T T E R IC O
100°C
O m o g e n a t o d e ll'a lim e n t o
in o p p o rt u n o t e rre n o d i c o lt u ra
p o s t o a d in c u b a re
U n 'a liq u o t a d e ll'o m o g e n a t o v ie n e
p o s t a in p ro v e tt a e c e n t r if u g a t a
p e r s e p a r a r e i b a tt e ri d a l t e rre n o
I l p e lle t v ie n e r is o s p e s o in a c q u a e
ris c a ld a t o a b a g n o m a r ia a 1 0 0 ° C
p e r 1 0 ' c irc a
PCR
De Medici et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69: 3456-3461
Hoorfar et al., APMIS, 2004, 112, 808-814.
COMPONENTI di una REAZIONE di PCR
Mg2+
dN
TP
Stampo
DNA a doppio filamento
Primers
Oligonucleotidi complementari a regioni dei filamenti
opposti che fiancheggiano la sequenza DNA bersaglio
Deossiribonucleotidi trifosfati
Tampone contenente
cloruro di magnesio
Enzima
Miscela equimolare di dATP,
dTTP, dGTP, dCTP
Lo ione Mg2+ è essenziale per il
funzionamento dell’enzima
Tradizionalmente viene usata la Taq polimerasi, enzima
termostabile estratto dal batterio termofilo Thermus
aquaticus
Le FASI della PCR
DENATURAZIONE:
Il DNA viene denaturato mediante
riscaldamento in provetta a ~ 92-95°C
ANNEALING:
La miscela viene raffreddata fino a
raggiungere la temperatura che
garantisce la specifica ibridazione dei
primers alle regioni dello stampo ad essi
complementari
Allungamento
(~ 70°C)
Denaturazione
(~ 95°C)
Annealing
(~ 60°C)
ALLUNGAMENTO:
La temperatura della miscela viene portata a 68-72°C
consentendo alla Taq polimerasi termostabile di sintetizzare il
filamento complementare allo stampo a partire dall’innesco
oligonucleotidico
PCR
I°step
regione di interesse
5’
3’
5’
3’
III°step
i filamenti vengono separati
ed i primers si appaiano
5’
3’
primer 1
primer 2
3’
complementarietà
al primer 1
5’
3’
3’
5’
5’
i primers si estendono
5’
3’
complementarietà
al primer 2
II°step
i filamenti vengono separati
ed i primers si appaiano
complementarietà
al primer 1
3’
5’
i filamenti vengono separati
ed i primers si appaiano
3’
5’
5’
complementarietà
al primer 2
i primers si estendono
5’
3’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
3’
Frammenti desiderati
i primers si estendono
3’
5’
filamenti di
lunghezza variabile
5’
filamenti di
lunghezza omogenea
3’
E così via
I FATTORI CRITICI della PCR
…nella miscela di reazione
Non utilizzare quantità eccessive di stampo, primers e/o dNTP
al fine di evitare amplificazioni non specifiche.
Dosare accuratamente la [Mg2+] in funzione della quantità di stampo,
primers e dNTP utilizzata
Ê
Mg2+ è indispensabile al funzionamento della Taq polimerasi,
ma è chelato da stampo, primers e dNTP.
Se in eccesso causa una perdita di fedeltà da parte
dell’enzima.
Selezionare l’enzima più idoneo alle proprie necessità
Ê
Emivita alla temperatura di denaturazione
Capacità di correzione degli errori
Wilson I. et al. Appl. Environ. Microb., 1997, 3741-3751
Taq,
Pfu...
PROGETTAZIONE dei PRIMERS
La scelta dei primers è cruciale per il successo
della reazione.Durante la reazione assumono un doppio ruolo:
•nei primi cicli funzionano da sonda
•quando si sono legati alla regione di amplificare agiscono da vettori
Caratteristiche di un buon primer:
-contenuto in GC compreso tra 45-50%
-Ta primer 1~Ta primer 2
!
Se la Ta dei due primers è molto diversa si possono verificare
amplificazioni asimmetriche o a singolo filamento.
ü
Assenza di sequenze ripetute invertite che possano far ripiegare il
primers su se stesso o di sequenze complementari fra i primers
che causano l’amplificazione di dimeri dei primers
La rivelazione dei prodotti di PCR
Questo stadio riveste una grande importanza per l’accertamento che il
frammento amplificato corrisponda esattamente alla sequenza bersaglio.
I metodi più utilizzati sono:
-elettroforesi su gel che consiste nella corsa elettroforetica in un campo
elettrico a intensità e direzione costante, su gel d’agarosio colorato con
bromuro di etidio e visualizzato agli UV a 302 nm.
-HPLC è un sistema rapido e vantaggioso e il prodotto della reazione è
analizzato utilizzando un’assorbanza di 260 nm. Separa i frammenti da 1 a
20000 bp
-elettroforesi capillare permette la separazione delle molecole
combinando la migrazione elettroforetica e il flusso elettrosmotico . La
rivelazione avviene tramite UV o tramite una “finestra” capillare
Rivelazione dei risultati
• Corsa elettroforetica su gel d’agarosio
bromuro di etidio
• Presenza o meno di bande luminose nei
eventuale presenza di DNA battterico
addizionato di
lanes denota
PCR di S. aureus (102 - 108 cell/ml)
Malorny et al. Int. J. Food Microb. 2003, 83: 39-48
Lofstrom et al. App. Environ. Microb. 2003, 69-75
Li Y. et al. J. Food Prot. 2004, 67: 27-33
Campioni di pollame contaminati da Salmonella- Ricerca
mediante PCR
Marker bp 100, 1-2 campioni positivi, 3-4 campioni negativi, +=controllo
positivo, -=controllo negativo
Multiplex PCR
Vi sono due o più sequenze-bersaglio nel DNA contenuto nel
campione da analizzare
Trova applicazione in varie situazioni diagnostiche:
•Identificare contemporaneamente una specie microbica e la presenza di
uno o più sierotipi (es. Salmonella enterica, S. Enteritidis, S.
Typhimurium; Listeria spp. e Listeria monocytogenes; Campylobacter
spp., Campylobacter coli e Campylobacter jejuni)
•Accertamento simultaneo di due o più specie microbiche nel campione
(Salmonella spp., Listeria spp., Campylobacter spp.)
Vengono prodotti contemporaneamente e nella stessa
provetta diversi amplificati, grazie all’impiego di diverse
coppie di primers, ciascuna specifica per un determinato
bersaglio
Controllo Interno
Introduzione di un controllo interno per potere evidenziare
inibizioni della matrice ed evitare i falsi negativi.
Il riscontro della positività dell’IC in assenza della
positività del campione, indica che il campione è veramente
negativo.
L’IC viene prodotto mediante una 1a PCR a partire da:
-DNA plasmidico
-Tratto di DNA dello stesso bersaglio, esterno o interno al
DNA target
Durante una seconda PCR
tale IC viene
coamplificato con il DNA
target; se nel campione
non è presente il
microrganismo bersaglio
verrà amplificato solo
l’IC dimostrando
l’avvenuta reazione e la
mancanza di inibizione da
parte della matrice
PCR di S aureus e controllo interno
Draft ISO/DIS 20838 del 2004
Delibato E. et al. Analytical Letters 2005
Ottimizzazione della concentrazione di MgCl2 nella coamplificazione
dell’IC con il DNA target
Validazione della PCR con controllo interno
per la determinazione della Salmonella nel
pollame
Malorny, 2004. Multicenter validation of PCR-based method for detection
of Salmonella in chicken and pig samples. J AOAC Int 87:861-6.
Campioni di pollame
contaminati da
Salmonella-Ricerca
mediante PCR con
controllo interno
Campioni di caseina
contaminati da Salmonella.
Ricerca mediante PCR con
Controllo Interno
De Medici et al. Industrie Alimentari, 2005, 447, 515-519 ;
Croci et al. Appl.Envir.Microbiol.2004, 70, 1393-1396
Limitazioni del gel d’agarosio
- Bassa sensibilità
- Il sistema non è automatizzato
- I prodotti dell’amplificazione vengono rivelati
solo nella fase di “plateau”
- Il bromuro di etidio non dà una risposta
quantitativa ed è potenzialmente mutagenico
Real Time PCR
Principi della Tecnologia
Metodologia che permette di:
• monitorare la reazione di PCR
mentre questa si verifica
• registrare l’emissione della fluorescenza durante la reazione
PCR Classica
Log [DNA]
Determinazione
dei prodotti di
PCR mediante
Plateau
PCR Real-Time
Fase lineare
Gel-EtBr
Monitoraggio
della reazione
Analisi Ct
Fase esponenziale
Cicli
PCR quantitativa
Sensibile
Specifica
Rapida
Quantifica i microrganismi presenti nel campione
Misura “step by step” la fluorescenza che si genera
durante la reazione utilizzando due diversi sistemi di
rilevamento dell’accumulo dei prodotti di PCR:
-coloranti che si legano ai doppi filamenti di DNA
-sonde legate a molecole fluorescenti
Hoorfar J. et al J. AOAC Int., 2005, 88, 45
SYBR Green
E’ un colorante fluorescente che si lega solo al DNA a doppio
filamento ed emette la fluorescenza solamente in queste condizioni.
DENATURAZIONE
Non viene rilevata fluorescenza
SYBR Green
Primer
ANNEALING
L’intensità della fluorescenza
comincia ad aumentare
Luce emessa
ALLUNGAMENTO
L’intensità della fluorescenza continua
ad aumentare e diventa massima al
termine della fase di allungamento
Polimerasi
L’AUMENTO DELLA FLUORESCENZA E’
REGISTRATO A 530nm
ANALISI della CURVA di MELTING
Consente di identificare il prodotto di amplificazione specifico rispetto
a prodotti aspecifici.
Curva di melting
100
Fluorescenza
80
104 copie
10 copie
0 copie
60
40
20
Al termine della PCR la temperatura viene
lentamente aumentata inducendo un
decremento della fluorescenza.
0
65
70
75
80
85
90
95
Temperatura (°C)
Derivata negativa della curva di melting
100
104 copie
10 copie
0 copie
prodotti non
specifici
80
-dF/dT
La temperatura in corrispondenza della
quale si ha un repentino decremento della
fluorescenza corrisponde alla Tm del
prodotto.
60
TM
40
20
0
65
70
75
80
85
Temperatura (°C)
90
95
Curva di melting degli ampliconi specifici per S. aureus
6.0E-02
4.0E-02
2.0E-02
0.0E+00
70
80
76.5
90
Curva di melting degli ampliconi specifici per Campylobacter spp.
Perelle S. et al. Mol. Cell. Probes 2004, 18, 321-327
Josenfen M. et al. Appl. Envir. Microb. 2004, 70, 4379-4383
Curva di Melting di DNA di Salmonelle nonEnteritidis in presenza di primers Styinva-JHO
e SefA.
Styinva
SefA
0.0E+00
70
77.1
80
Hoorfar J. J. Clin. Microbiol., 2000, 38, 3429-3435
90
Curva di Melting di DNA di Salmonella Enteritidis in
presenza di primers Styinva-JHO e SefA.
SefA
Styinva
0.0E+00
70
77.0
80
83.2
90
PCR duplex SYBR Green per la determinazione di Salmonella spp.
Listeria spp.
Listeria spp.
Curva di Melting di Listeria spp.
1.6E-02
1.2E-02
8.0E-03
4.0E-03
0.0E+00
70
80
75.1
90
Curva di Melting di Salmonella spp.
Salmonella spp.
1.6E-02
1.2E-02
8.0E-03
4.0E-03
0.0E+00
70
80
81.2
90
Làzaro et al. Appl. Environ. Microb. 2004, 70, 6299-6301
SYBR Green Salmonella con IC costruito utilizzando
il pUC19
1.2E-01
Salmonella
9.0E-02
6.0E-02
3.0E-02
0.0E+00
70
80
80.5
90
1.2E-01
Salmonella e 1°
IAC
9.0E-02
6.0E-02
3.0E-02
0.0E+00
70
80
90
81.3
1.2E-01
Salmonella e 2°
IAC
9.0E-02
6.0E-02
3.0E-02
0.0E+00
70
80
90
82.6
1.2E-01
Salmonella e 3°
IAC
9.0E-02
6.0E-02
3.0E-02
0.0E+00
70
80
90
84.2
Determinazione della Salmonella in campioni di carne contaminati
utilizzando il SYBR Green real Time PCR dopo 24 h di prearricchimento
S.
S.
S.
S.
S.
Enteritidis
Derby
London
Thypimurium
Anatum
L. ivanovi
L. monocytogenes
L. innocua
S. aureus
Campylobacter Jejuni
Campylobacter coli
8.0E-02
6.0E-02
4.0E-02
2.0E-02
0.0E+00
70
80
80.3
90
Sonde Fluorescenti
Il secondo sistema di rivelazione utilizza sonde fluorescenti, che
si legano al DNA (in una zona interna al DNA target) poco prima
della coppia di primers e durante l’amplificazione costituiscono
un sistema di rilevamento altamente specifico.
Le sonde sono marcate con un reporter fluorescente all’estremità
5’ e un “quencher”, capace di assorbire la radiazione emessa dal
“reporter”, all’estremità 3’.
Reporter
FAM
VIC
TET
Quencher
Energia Trasferita
5’
3’
Raggio Laser
Quando la sonda è intatta, la fluorescenza del “reporter” è
soppressa dalla vicinanza del “quencher” limitando l’emissione da
parte del “reporter”, cosicché il segnale risulta essere molto basso.
Quando la sonda, viene degradata dall’attività 5’-esonucleasica della
Taq polimerasi, il “reporter” viene separato dal “quencher” e quindi
può emettere piena fluorescenza alla sua specifica lunghezza
Reporter
(Fluoresceina)
FAM
VIC
TET
5’
Quencher
(Rodammina)
Sonda tagliata
3’
Raggio Laser
QUANTIFICAZIONE del PRODOTTO di PCR
Il ciclo della PCR in cui si ha un incremento significativo
della F viene definito Ct. Tale Ct è inversamente
proporzionale alla concentrazione del DNA
106
105
Estrapolazione della curva standard
106
104 copie
105
104 copie
linea di base
Numero cicli
Riportando in grafico il valore dei Ct in
funzione del Log della concentrazione
iniziale di ciascun campione si ottiene la
curva standard da cui si può estrapolare
il valore della concentrazione
campioni a titolo ignoto.
di
N. cicli
Fluorescenza
Curva di fluorescenza di campioni
a concentrazione nota
Log concentrazione
Amplificazione di differenti concentrazioni di
Salmonella
108 cel/ml;
cel/ml; 107 cel/ml
cel/ml;; 106 cel/ml
cel/ml;; 105 cel/ml
cel/ml;; 104 cel/ml
cel/ml;; 103 cel/ml
cel/ml;; 102 cel/ml
cel/ml;; 101 cel/ml
cel/ml;;
Hein I. et al., Appl. Environ. Microb. 2001, 3122-3126
Brakstadt o. et al., 1992, 30: 1654-1660
Retta Standard
SYBR Green I
• Può essere applicato ai protocolli sperimentali che
sono già in uso per l’esecuzione della PCR classica
apportando solo piccole modifiche.
• Più di una molecola di SYBR Green I si può legare
alla doppia elica di DNA, in modo che, gli ampliconi
prodotti dalla PCR generino un segnale molto intenso.
• Poiché il SYBR Green I si lega indiscriminatamente
ad ogni doppio filamento di DNA, la specificità della
reazione deve essere determinata dalla temperatura di
melting (Tm) dell’amplicone ottenuto
Sonda
• Ha un’elevata specificità
• In una singola reazione di PCR Real time si
possono utilizzare più sonde, in grado di
discriminare differenti ampliconi, in quanto
ciascuna sonda può legare molecole fluorescenti
diverse
• I protocolli che sono già in uso per la PCR
classica non possono essere utilizzati
• Ogni filamento di DNA sintetizzato può legare
solo una sonda fluorescente
Saggi ELISA
Sono dosaggi di legame basati sulle interazioni antigene-anticorpo,
che utilizzano come traccianti reazioni enzimatiche. L’anticorpo o
l’antigene sono infatti coniugati con un enzima in modo che l’antigene
da dosare possa essere determinato mediante una misura di attività
enzimatica.
¯
¯
¯
+
lavaggio
+
¯
¯
Antigene (standard o campione)
P
S
lavaggio
+S
¯
S
P
¯ Anticorpo specifico e conigato
con enzima (generalmente PAb)
Anticorpo specifico per
l’antigene (generalmente
MAb)
S = substrato, P = prodotto
Misura dell’attività
enzimatica
S. Aureus Saggio sandwich
IgG immobilizzate su supporto solido e interazione con antigene
(proteina A)
Interazione con anticorpi primari monoclonali
Rivelazione con anticorpi secondari coniugati con AP
Misurazione del prodotto di reazione per via spettrofotometrica.
prodotto
IgG
substrato
AP
antigene
Mirhabibollahi B. et al.
Appl. Biotechnol. 1990, 34:242-247
MAb (da “mouse”) o
PAb (da “rabbit”)
Ab2-AP
PARTICELLE MAGNETICHE
Le particelle magnetiche, sono particelle costituite da una dispersione
di materiale magnetico (Fe2O3 and Fe3O4) ricoperta da un sottile
guscio polimerico che provvede a definirne l’area superficiale per
l’immobilizzazione di una grande varietà di molecole.
Buoni risultati in campo immunologico
Ø 1-5 µm
Misure su campioni reali
ELIMC
IgG = 10 µg/ml
MAb = 1:50000
Ab2-AP = 1:300
4-nitrofenolo
Ab2-AP
AP
ELIMC
2.0
4
IgG
S. aureus
Anticorpo primario
ABS@ 405 nm
4-nitrofenilfosfato
1.5
3
1.0
2
1
0.5
Dynabead Tosylactivated
0.0
0
1.e+4
1.e+5
1.e+6
S.aureus (cell/mL)
LOD
7 x 104 cell/mL
Sensibilità
2 x 105 cell/mL
1.e+7
Le tecniche di rilevamento più comunemente
determinazione dell’attività enzimatica sono:
usate
per
la
Øla spettrofotometria
Øla fluorimetria
Øla chemiluminescenza
Øpiù recentemante l’elettrochimica
IMMUNOSENSORI
Saggi ELISA in cui il materiale biologico viene accoppiato
ad un trasduttore di segnale.
Gli immunosensori elettrochimici permettono di combinare
l’ELEVATA SELETTIVITA’ della reazione antigeneanticorpo con un’ECCELLENTE SENSIBILITA’ ed un
AMPIO INTERVALLO LINEARE DI MISURA che sono
caratteristici dei metodi elettrochimici .
SAGGIO
S.aureus
SAGGIO per
per la
la determinazione
determinazione dell’
dell’S.aureus
Beads tosilattivate
ELIME
ELIME S.aureus
S.aureus (enzyme
(enzyme
linked
linked immunomagnetic
immunomagnetic
electrochemical
electrochemical assay)
assay)
O
O
S
CH3
O
H
R
N
H
O
H
O
S
CH 3
O
N
H
R
La proteina A, situata sulla parete dell’S.aureus, è
stata utilizzata come antigene della reazione.
Tale proteina è stata estratta mediante bollitura.
E.L.I.M.E. Assay: Enzyme Linked Immunomagnetic
Electrochemical Assay
ØSelettività degli anticorpi;
ØSensibilità della rivelazione elettrochimica;
ØPossibilità di concentrare
superficie dell’elettrodo.
le
particelle
magnetiche
sulla
α-naftolo
OH
AP
ONa
Rappresentazione schematica
dell’E.L.I.M.E :
O
P
O
O
α-naftilfosfato
+
Elettrodo Ausiliario
Elettrodo di Lavoro
Magnete
Elettrodo di
Riferimento
ELIME
α-Naftilfosfato
AP
Potential
anti-mouse IgG-AP
δ2
α-Naftolo
MAb
δ1
Proteina A
RE
∆Ep
Tp
-
T
∆Es
Time
IgG
WE
CE
α-Naftolo
IMB
Current
2e-
N
Magnete
Elettrodo di lavoro
S
Potential
-
intervallo di potenziale:
velocità di scansione:
ampiezza dell’impulso:
durata dell’impulso:
frequenza dell’impulso:
0-500 mV
100 mV/s
50 mV
60 ms
0.16 s
12
10
Corrente (µA)
8
Tempo totale di analisi =3 ore
6
4
2
0
1.e+1
1.e+2
1.e+3
1.e+4
1.e+5
Staphylococcus aureus (cell/mL)
1.e+6
LOD:10 cell/mL
Sensibilità: 5ּ x102 cell/mL
SISTEMA IMMUNOELETTROCHIMICO MULTICANALE
Anticorpi monoclonali e policlonali-HRP, specifici per salmonella, sono
stati impiegati in un “format” di tipo sandwich utilizzando una piastra
da 96 pozzetti.
Ig-G antimouse
MAb di mouse
Salmonella
PAb di rabbit-HRP
Piastra a 96 pozzetti: sul fondo
di ogni pozzetto è localizzato
elettrodo “screen printed”
Curva di calibrazione
nelle condizioni ottimizzate
Al termine della catena immunologica la piastra
Corrente (µA)
30
viene collegata ad un potenziostato e l’attività
20
della
perossidasi
(HRP)
viene
misurata
elettrochimicamente utilizzando come substrato
10
la 3,3’,5,5’-tetrametilbenzidina.
0
1 ,e + 4
1 ,e + 5
1 ,e + 6
1 ,e + 7
1 ,e + 8
1 ,e + 9
S . E n t e r it i d is U F C / m L
Il prodotto di reazione è rivelato mediante amperometria
intermittente ad impulsi
•I metodi rapidi solo dopo accurata validazione potranno
essere utilizzati come metodi di screening per il
controllo delle derrate alimentari nell’ambito dei piani
HACCP e dei controlli ufficiali
•Sono soprattutto utili nel monitoraggio di alcuni CCP
per consentire l’adozione di rapide azioni correttive in
caso di positività
Produzione primaria
Trasformazione
Fabbricazione
Trasporto
Distribuzione
Confenzionamento
Deposito

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