Antimicrobici naturali e colture di biocontrollo per l - stayfresh

STAYFRESH, RICERCA SU IV GAMMA
Antimicrobici naturali e colture di biocontrollo per l’estensione della
shelf-life della valerianella di IV gamma
Rosalba Lanciotti
•Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroalimentari
Università degli Studi di Bologna
•Centro Interdipartimentale di Ricerca Industriale Agroalimentare
Miglioramento della
aumento della sicurezza,
della shelf-life, della
qualità e della
funzionalità dei prodotti
Messa a punto di
metodi alternativi di
sanificazione
Problematiche dei prodotti
alternativi in uso
problematiche
connesse con
disinfettanti a base
di cloro
Bassa efficacia antimicrobica;
corrosivi; irritanti; formazione di
composti pericolosi; patogeni
emergenti resistenti; banditi da
alcuni paesi europei
Utilizzo di
antimicrobici naturali
e colture di
biocontrollo
Componenti essenziali
di una dieta sana ed
equilibrata
PRODOTTI
VEGETALI DI IV
GAMMA
Shelf-life e sicurezza : basate
su riduzione del carico
microbico mediante
lavaggio e mantenimento
della catena del freddo
Mercato con enormi
opportunità di crescita
Shelf-life ridotta;
frequenti
contaminazioni con
microrganismi
patogeni
Unità operativa UNIBO: obiettivo generale
Riduzione della concentrazione di cloro nelle acque di lavaggio e
prolungamento della shelf life di mele (Malus communis, var.
Golden Delicious) e Valerianella locusta Laterr. mediante l’impiego
oli essenziali o loro componenti in combinazione o meno con
colture di biocontrollo specificatamente selezionate
Oli essenziali e loro costituenti
Attività antimicrobica
Ampio spettro d’azione
GRAS secondo FDA, ammessi come
additivi alimentari nel 2011 da EFSA,
consentiti anche dalla legislazione
giapponese
Azione antiossidante
Basso costo
Green consumerism
Nel settore alimentare
vengono usati come
aromatizzanti, antiossidanti e
antimicrobici
Ma impiego subordinato a:
Compatibilità organolettica
Standardizzazione della composizione in termini di molecole attive
Comprensione dei meccanismi d’azione
Valutazione delle possibilità di applicazione nel prodotto (interazione
con i componenti dell’alimento, attività durante la conservazione …) e
nelle condizioni reali di processo e di conservazione
letteratura
evidenzia ottime
potenzialità
applicative in
prodotti di IV
gamma
AGENTI DI BIOCONTROLLO
Colture protettive:
selezionate soprattutto
nell’ambito dei batteri lattici
Inibizione di
microrganismi
patogeni e
degraditivi
Competizione
Produzione di
sostanze
antimicrobiche
Ma
Limitatissimo effetto
sulle caratteristiche
sensoriali; GRAS;
lunga storia d’uso…
Acidi organici, batteriocine,
diacetile, acetoino,
idrossiacidi…
Obiettivi specifici per la valerianella di IV gamma
Valutazione degli effetti di diversi antimicrobici naturali addizionati in fase
lavaggio sulla sicurezza e sulla shelf life di Valerianella locusta Laterr. in rapporto
all’atmosfera di confezionamento e alle condizioni di processo adottate
Isolamento, identificazione e caratterizzazione tecnologica di batteri lattici da
usare come agenti di biocontrollo in combinazione o meno con antimicrobici
naturali
Individuazione delle soluzioni bio-tecnologiche ottimali (agenti antimicrobici più
efficaci, colture di biocontrollo più attive e condizioni di processo più appropriate)
sulla base delle prove di laboratorio
Scaling up a livello aziendale (in collaborazione con SIPO srl)
 Studio dei meccanismi d’azione delle sostanze utilizzate su microrganismi
patogeni, degradativi e agenti di biocontrollo
Protocollo di lavorazione
valeriana
Oli essenziali e loro
miscele utilizzate
• Olio di origano (250ppm)
• Olio di timo (250ppm)
• Olio di origano + Olio di
timo (125+125ppm)
• Olio di origano +
Carvacrolo (125+100ppm)
Valerianella locusta Laterr
reperita sul mercato locale
Lavaggio
2 min con acqua di rete con 120 ppm cloro
Agitazione manuale, 8 °C
(Valeriana:acqua, 1:10 p/v)
Sgrondatura
prelevando la valeriana con il cestello di
una centrifuga domestica
Centrifugazione (30 s)
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Movimentazione manuale della
valeriana posta nel cestello della
centrifuga domestica
Centrifugazione (30 s)
Confezionamento in buste a media permeabilità
(valeriana: spazio di testa, 1:1)
Conservazione, 4-6° C
Analisi effettuate
• valutazione della
microflora naturalmente
presente (degradativa e
patogena)
• Analisi del profilo in
molecole volatili
• Analisi dell’indice di
appassimento e di colore
Risultati:
Nessuna differenza significativa per il carico di microrganismi degradativi (mesofili
aerobi totali, batteri lattici, lieviti, batteri sporigeni) in rapporto alla soluzione di lavaggio
adottata
 Nessuna differenza significativa per presenza di microorganismi patogeni in rapporto
alla soluzione di lavaggio adottata.
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Nessuna differenza significativa degli indici colorimetrici dopo 8 giorni di conservazione
in rapporto alla soluzione di lavaggio adottata
Fre
sh
Withe
red
Ma
perdita
di
turgidità
dopo 3
giorni
di
conservazione
nei
campioni lavati con
timo/origano e dopo
5 giorni nei campioni
lavati con origanocarvacrolo.
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Analisi dei dati GC-MS-SPME mediante PCA
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Ottimizzazione del protocollo di lavorazione della valeriana
O
13
°C
Analisi effettuate
• valutazione della microflora naturalmente presente
• Analisi del profilo in molecole volatili e naso elettronico
• Analisi dell’indice di appassimento e di colore
Olio
essenziale di
timo o olio
essenziale di
origano
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Risultati dopo ottimizzazione
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
C map T0
Oregano T0
Thyme T0
C map T3
C map T8
C map T10
Oregano T3
Oregano T8
Oregano T10
Thyme T3
Thyme T8
Thyme T10
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
• L’analisi PCA dei profili rilevati mediante naso elettronico ha raggruppato i campioni
sulla base del tempo di stoccaggio e non in relazione all’olio essenziale impiegato
AGENTI DI BIOCONTROLLO
Isolamento, identificazione e caratterizzazione in vitro,
di potenziali agenti di biocontrollo
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
Isolamento di batteri lattici da prodotti commerciali,
durante lo stoccaggio e alla fine della shelf life
15 isolati da valeriana
a
Symbols: -No inhibition zone; +small inhibition zone (0.5 to 1 mm); ++medium inhibition zone (1 to 2 mm); +++large inhibition zone (>2mm)
Temperature
Strain
Identification
V9
V4B6
V7
V7B3
V4B5
V4B4
L. plantarum / L. pentosus
Lactobacillus plantarum/acidophilus
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
Strain
V7
V4B4
V4B5
V4B6
V7B3
V9
Identification
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus casei
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus plantarum/acidophilus
Lactobacillus plantarum
L. plantarum / L. pentosus
NaCla
pHb
30°C 15°C 8°C 4°C 2% 4% 6% 4,5 4 3,5
Inhibition of indicator strainsa
E.coli Salmonella
Listeria
+
+++
+++
++
++
+++
+++
++
++
++
+++
-
a simboli:
-No alone di inibizione; +piccolo alone di
inibizione (da 0.5 a 1 mm);
++alone di inibizione medio (da 1 a 2 mm)
+++ampio alone di inibizione (>2mm)
6 ceppi identificati (sequenziamento regione 16S rRNA)
Lactobacillus casei/paracasei/rhamnosus (1 ceppo) e Lactobacillus plantarum (5 ceppi).
Nessuno dei ceppi produceva batteriocine ma alcuni erano capaci di inibire S. enteritidis
E5, L. monocytogenes Scott A and E. coli 555.
Le migliori performances: L. casei (V4B4); L. plantarum V7B3 e V4B5
Uso dei batteri lattici selezionati
V7B3 (Lb. plantarum)
V4B4 (Lb. casei/paracasei)
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto
Inoculo del LAB (7 log UFC/ml) e/o dei batteri patogeni (Listeria
monocytogenes e Escherichia coli, 3-4 log UFC/ml) nella fase di lavaggio
Analisi effettuate
• Shelf-life
• Sicurezza
• Colore
•texture
Selezione dell’agente di
biocontrollo migliore
Agenti di biocontrollo
L. casei V4B4 e L. plantarum V7B3 hanno mostrato una eccellente adattabilità
alle condizioni stringenti del sistema (carico costante durante tutto il
periodo di conservazione)
Dopo 9 giorni il carico in mesofili aerobi totali era compreso tra 6.5 and 7.5
log CFU/g. I più bassi livelli sono stati rilevati nei campioni di controllo ed
in quelli trattati con L. plantarum V7B3
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
L’inoculo degli agenti di biocontrollo selezionati non influenza in maniera
significativa colore e texture
Effetto degli agenti di biocontrollo su E. coli (a) L. monocytogenes
(b)
A
VRB7 stesso effetto del
cloro su cinetica di
morte di E. coli ma
maggiore efficacia nei
confronti di L.
monocytogenes
4.0
3.5
pathogens
2.5
V4B4+pathogens
V7B3+pathogens
2.0
chlorine+pathogens
1.5
1.0
0
2
5
time (d)
7
9
B
4.0
3.5
log cfu/g
3.0
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
log cfu/g
3.0
pathogens
2.5
V4B4+pathogens
V7B3+pathogens
2.0
chlorine+pathogens
1.5
1.0
0
2
5
time (d)
7
9
Impiego dell’agente di biocontrollo selezionato e di olio di timo
V7B3 (Lb. plantarum) o olio di timo 250 ppm
Inoculo del LAB (7 log UFC/ml) e/o dei batteri patogeni (Listeria
monocytogenes e Escherichia coli, 3-4 log UFC/ml) nella fase di lavaggio
Analisi effettuate: analisi microbiologiche (microrganismi degradativi e
patogeni); colore; profili in molecole volatili; naso elettronico; panel test
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
Protocolli di lavaggio precedentemente messi a punto
Mesofili aerobi totali
Agente di biocontrollo e olio essenziale di timo
di timo
•
Mesofili aerobi totali : soglia di 7 log UFCg dopo 7 giorni nei campioni di
controllo e nei campioni addizionati di agente di biocontrollo e dopo 15 gg
in presenza dell’olio essenziale di timo.
•
Analisi sensoriale dopo 5 gg di stoccaggio: nessuna differenza significativa
per odore, colore, texture..)
V7B3+ timo stessa efficacia del cloro nei confronti di E. coli e L.monocytogenes
A 4.5
B 5.0
4.0
4.5
3.5
4.0
Chlorine+pathogens
2.0
V7B3+thyme EO+pathogens
Thyme EO+pathogens
1.5
pathogens
1.0
V7B3+thyme EO+pathogens
2.5
Thyme EO+pathogens
2.0
1.5
pathogens
1.0
0.5
0.0
log cfu/g
log cfu/g
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
2.5
Chlorine+pathogens
3.0
0.5
0
2
5
7
time (d)
E. coli
12
15
0.0
0
2
5
7
12
time (d)
L. monocytogenes
15
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
3.5
3.0
Uso combinato di antimicrobici naturali con un ceppo di Lactococcus lactis produttore di
nisina per migliorare la sicurezza e la shelf life delle mele di IV gamma
Screening per la selezione di un ceppo di Lc. lactis produttore di nisina Z
Caratterizzazione tecnologica e valutazione dell’attività antimicrobica del ceppo
Lc. lactis CBM21
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
Analisi effettuate: analisi microbiologiche (microrganismi
degradativi e patogeni inoculati); colore; profili in molecole
volatili; naso elettronico
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Effetti della combinazione Lc. lactis CBM21 + olio essenziale di timo sulla qualità di
valerianella di IV gamma
Risultati più significativi:
la presenza della coltura di biocontrollo e dell’olio essenziale di timo non influiscono
significativamente sul colore del prodotto e sulle caratteristiche organolettiche del
prodotto
Prove di Laboratorio –
oli essenziali
Prove di LaboratorioAgenti di Biocontrollo
 Riduzione del carico dell’agente di biocontrollo durante la conservazione
(circa 1 ciclo log dopo 10gg)
 Ma effetto significativo sul carico dei mesofili aerobi totali: questi non
superavano 7 log UFC/g dopo 15 gg di conservazione in presenza
dell’agente di biocontrollo
 Anche la presenza di olio essenziale di timo incrementava la shelf-life
(soglia di alterazione superata dopo 14 gg)
 Nei controlli la soglia di alterazione veniva superata dopo 7 gg
 Stessa efficacia del cloro nei confronti di E. coli e L. monocytogenes
deliberatamente inoculati
SCALING UP presso SIPO
Condizioni adottate nella fase di lavaggio:
1) LAVAGGIO CON 120 PPM DI CLORO
2) USO COMBINATO LC. LACTIS CBM21 (7 log ufc/mL ) E OLIO ESSENZIALE DI
TIMO
3) OLIO ESSENZIALE DI TIMO UTILIZZATO SINGOLARMENTE
4)LC. LACTIS CBM21 UTILIZZATO SINGOLARMENTE
Scaling up- Agenti di
Biocontrollo
Analisi effettuate: analisi microbiologiche (microrganismi degradativi
e patogeni naturalmente); colore; profili in molecole volatili; naso
elettronico; panel test
Scaling up– oli essenziali
• Valutazione comparativa tra i diversi campioni
Colore e indice di appassimento
Nessuna differenza significativa neppure per a* e b*, tra i diversi campioni durante
l’intero periodo di stoccaggio a 6°C
Nessuna differenza per indice di appassimento
Carico dei lattici durante la conservazione refrigerata
Lieviti e coliformi totali: nessuna differenza significativa: carico sempre minore di
3 e 2 log ufc/g rispettivamente
Scaling up- Agenti di
Biocontrollo
Scaling up– oli essenziali
Mesofili aerobi totali: nessuna differenza significativa nel CARICO durante la
conservazione in rapporto alla soluzione di lavaggio adottata
Test di preferenza
I campioni addizionati con timo e/o
lattico risultavano preferiti dagli
assaggiatori indipendentemente dal
tempo di stoccaggio considerato rispetto
ai controlli trattati con cloro
MECCANISMI DI RISPOSTA DEI PATOGENI E DEGLI AGENTI DI
BIOCONTROLLO RISPETTO AGLI ANTIMICROBICI NATURALI
Importanza applicativa  evitare meccanismi di resistenza  individuazione dei
meccanismi di risposta  uso consapevole degli antimicrobici naturali a livello
industriale
• Determinazione dei cambiamenti
nelle membrane citoplasmatiche
• Determinazione delle molecole
volatili rilasciate
• Espressione genica
• Effetto di concentrazioni subletali di
olio essenziale di timo, olio essenziale
di origano, carvacrolo e timolo su
composizione degli acidi grassi di
membrana e sul rilascio di molecole
volatili da parte di L. monocytogenes,
E. coli e S. enteritidis
• Studio dei cambiamenti
nell’espressione genica di E. coli e Lc.
lactis esposti a concentrazioni
subletali di olio essenziale di timo e
carvacrolo.
Determinazione dei cambiamenti nelle membrane citoplasmatiche
Determinazione delle molecole volatili rilasciate
Le molecole testate inducono chiare modificazioni sia al profilo degli acidi
grassi di membrana che al rilascio di specifiche molecole volatili.
I cambiamenti avvengono durante la crescita microbica e dipendono dalla
molecola testata, dalla sua concentrazione e dal microrganismo testato
 Risposta comune: incremento degli acidi insaturi e di specifici acidi grassi
liberi
Espressione genica
Studio dei cambiamenti nell’espressione genica di E. coli e Lc. lactis esposti
a concentrazioni subletali di olio essenziale di timo e carvacrolo.
I cambiamenti nell’espressione genica di Lc. lactis e E. coli sono stati
studiati tramite microarray.
Stress applicato: ½ del valore della MIC
Principali classi dei geni up regolati o down regolati in E. coli e Lc. lactis :
Ribosomi
Sintesi degli acidi grassi
Metabolismo energetico
Metabolismo e trascrizione di purine e pirimidine
Proteine ipotetiche
Proteine associate agli stress (termico e acido), detossificazione e protezione delle
cellule
Proteine di trasporto
Metabolismo degli amminoacidi
Metabolismo secondario
CONCLUSIONI
Prove di laboratorio
L’olio essenziale di timo ha dimostrato un’attività antimicrobica
assolutamente comparabile con quella del cloro senza significativi
peggioramenti dei parametri di colore e dell’indice di appassimento.
L’ottimizzazione delle condizioni di processo e l’inclusione di colture di bio
controllo hanno consentito di migliorare ulteriormente la qualità dei prodotti
in termini di shelf-life e di sicurezza.
L’associazione dell’olio essenziale di timo con batteri lattici è risultata quella
migliore accelerando le cinetiche di morte di L. monocytogenes e E. coli
quando deliberatamente inoculati nei prodotti e dimostrando un efficacia
analoga a quella del cloro.
Prove in azienda
Olio essenziale di timo e coltura di biocontrollo: effetti non significativamente diversi
dal cloro su microrganismi patogeni e degradativi ma prodotti più apprezzati dagli
assaggiatori!!!!!
Conclusioni
Nell’ambito del progetto Stayfresh sono state individuate soluzioni
biotecnologiche di lavaggio di valerianella idonee alla sostituzione
del cloro
Ma le condizioni di lavaggio
individuate possono essere
migliorate con ulteriori studi:
 Per ottimizzare le modalità di inoculo degli agenti
di biocontrollo
 per comprendere appieno interazioni tra agente
di biocontrollo e/o olio essenziale di timo e
microbiota (pirosequenziamento)
 Per comprendere i meccanismi di azione nei
confronti di altri microrganismi patogeni e
degradativi
Ringraziamenti
• Dr M. Ceccarini e L. Alessandrini Sipo srl
• Gruppo della prof.ssa S. Torriani (Departmento di
Biotecnologia dell’Università di Verona)
• Gruppo del prof. J. KoK (Department of Genetics of Groningen
University)
• Gruppo di Dr L. Putignani (Bambin Gesù, Roma)
• Gruppo del prof. M. Dalla Rosa (Campus di Scienze degli
Alimenti - Università di Bologna)
Gruppo di Microbiologia degli Alimenti
Campus di Scienze degli Alimenti, Università di Bologna
Grazie per l’attenzione

Download Report