Bio-farmaceutische bepaling van geneesmiddelen Deel IIc

Bio-farmaceutische bepaling
van geneesmiddelen
Deel
llc
H. L i n g e m a n
voorkeur, slechts eenmalig w o r d e n
h y d r o f o b e v e r b i n d i n g e n (b.v. vet,
Afdeling Analytische Chemie en
gebruikt, h i e r d o o r w o r d e n er g o e d -
olie, smeer), p o l y m e r e c o m p o n e n t e n
Toegepaste Spectroscopie
k o p e r e m a t e r i a l e n in S P E c a r t r i d g e s
en vaste deeltjes die na injectie de
Vrije U n i v e r s i t e i t , D e B o e l e l a a n 1083,
gebruikt. O m d a t de lengte v a n het
kwaliteit v a n de analytische kolom
1081 H V A m s t e r d a m
p a k k i n g s b e d in S P E s y s t e m e n a a n -
dramatisch verslechteren.
Vervolg
z i j n e n h e t b e d m i n d e r h o m o g e e n is
z i e n l i j k k o r t e r is, d e d e e l t j e s g r o t e r
2.1
Vanzelfsprekend heeft S P E , en dan
Z o w e l bij S P E a l s L C w o r d e n i n d e r -
g e p a k t , is d e e f f i c i ë n t i e v a n S P E c a r -
met n a m e off-line SPE, ook een aan-
daad dezelfde vaste fasen gebruikt,
t r i d g e s v e e l l a g e r ( N < 100) d a n v a n
tal n a d e l e n . D e b e l a n g r i j k s t e h i e r v a n
alleen zijn er enkele belangrijke v e r -
LC kolommen.
z i j n : niet o p t i m a l e g e v o e l i g h e i d o m d a t
schillen en deze komen met name
slechts een aliquot w o r d t geïnjec-
v o o r t uit het feit dat het d o e l v a n
2.2 P r i n c i p e s e n
e e n S P E a n d e r s is d a n v a n e e n L C
S P E p r o c e d u r e s zijn tamelijk e e n -
b e p a l i n g . D e b e d o e l i n g v a n L C is
voudig: een handmatig of c o m m e r -
b a t c h - t o t - b a t c h v a r i a t i e s in d e c a r -
meestal o m een verbinding, o p een
cieel gepakte cartridge, met hierin d e
tridges, irreversibele adsorptie aan
b e t r o u w b a r e manier, kwantitatief te
juiste hoeveelheid v a n een geschikt
het c a r t r i d g e materiaal en/of d e frits
b e p a l e n . H i e r v o o r is h e t b e l a n g r i j k
sorbens, w o r d t gesolvateerd en
en problemen ten gevolge v a n ver-
d a t d e v e r b i n d i n g e e n k' h e e f t v a n
geconditioneerd met de juiste v l o e i -
ontreinigingen (contaminaties).
2-8. Bij S P E h e b b e n w e e c h t e r t e
stoffen w a a r n a het m o n s t e r w o r d t
A n d e r e n a d e l e n v a n S P E zijn dat
procedures
teerd, monsterverliezen tijdens de
i n d a m p en/of d r o o g d a m p s t a p p e n ,
m a k e n m e t e e n a l l e s o f n i e t s (on/off)
opgebracht. Vervolgens w o r d t de
bevroren en w e e r ontdooide m o n -
m e c h a n i s m e . Bij S P E m o e t d e v e r -
cartridge g e w a s s e n en de analiet(en)
sters s o m s vaste deeltjes (b.v. fibri-
b i n d i n g in e e r s t e i n s t a n t i e v a a k e e n
w o r d e n (selectief) v a n d e c a r t r i d g e
n e uit b i o l o g i s c h e m o n s t e r s ) k u n n e n
k' h e b b e n d i e z o g r o o t m o g e l i j k e n
geëlueerd met (meestal) m i n d e r dan
bevatten die de cartridges v e r s t o p -
v e r v o l g e n s z o k l e i n m o g e l i j k is. S P E
1 m l e l u t i e v l o e i s t o f . In v e e l g e v a l l e n
pen, maar door toepassing van spe-
w o r d t d a a r o m ook w e l digitale LC
w o r d e n de cartridges gepakt v a n
ciale frits kan dit p r o b l e e m tot e e n
g e n o e m d . Een belangrijk gevolg
100-1000 m g s o r b e n s m e t e e n d e e l -
m i n i m u m w o r d e n beperkt.
h i e r v a n is d a t b i j L C g e w e r k t w o r d t
t j e s g r o o t t e v a n 40-80 jum e n e e n p o r i e
met g o e d gedefinieerde fasen (b.v.
g r o o t t e v a n 600 n m . E e n a l g e m e n e
E r is d e a f g e l o p e n j a r e n v e e l g e p u -
silanol g r o e p e n die a f g e s c h e r m d
r e g e l is d a t o p c h e m i s c h g e b o n d e n
bliceerd over de principes, uitvoe-
zijn) o m te v o o r k o m e n dat er e e n
s i l i c a f a s e n o n g e v e e r 1-5% v a n h e t
ring en t o e p a s s i n g e n v a n S P E . De
complex retentiemechanisme ont-
sorbent gewicht aan v e r b i n d i n g e n
meeste fabrikanten van SPE mate-
staat w a a r d o o r p i e k v e r v o r m i n g (b.v.
kan w o r d e n v a s t g e h o u d e n , dat m a x i -
rialen h e b b e n ook h a n d b o e k e n o p
t a i l i n g ) k a n o p t r e d e n . B i j S P E is h e t
m a a l 20 b e d v o l u m i n a ( c a . 120 jil
de markt gebracht waarin veel infor-
e n i g e d a t v a n b e l a n g is d a t e e n v e r -
p e r 100 m g s o r b e n s ) a a n w a s v l o e i -
m a t i e is t e v i n d e n . E n k e l e w i l l e k e u r i -
binding w o r d t v a s t g e h o u d e n en het
stof m o g e n w o r d e n gebruikt en dat
ge v o o r b e e l d e n hiervan zijn:
maakt niet uit h o e dat g e b e u r t . H e t
elutie kan g e b e u r e n m e t m i n d e r d a n
g e v o l g is d a t h i e r v a a k n i e t o f s l e c h t
vijf bed v o l u m i n a .
-
afgeschermde fasen gebruikt w o r -
Sorbent
Extraction
Handbook,
d e n . E e n a n d e r v e r s c h i l is d a t bij L C ,
SPE procedures kunnen v o o r een
in p r i n c i p e , a l l e e n s c h o n e m o n s t e r s
aantal d o e l e i n d e n w o r d e n gebruikt:
ration
-
Products,
Sorbent
Technology
Varian
Sample
Harbor
Extraction
for
m o g e n w o r d e n b e p a a l d , t e r w i j l bij
monster concentrering (verrijking),
Preparation,
SPE smerige monsters behandeld
m o n s t e r opzuivering d o o r het v e r -
burg,
NJ
m o e t e n w o r d e n . H e t g e v o l g is d a t i n
wijderen van interfererende v e r b i n -
Solid
Phase
Extraction
L C 3-5 J i m d e e l t j e s w o r d e n g e b r u i k t
dingen en 'kolom vernielers', ont-
Guide
and
Bibliography,
met e e n relatief kleine p o r i e d i a m e -
zouten van monsters, bewaren en
Chromatography,
t e r e n d a t i n S P E 40-80 jum d e e l t j e s
opslag v a n monsters, fase v e r a n d e -
-
J.T.
PrepaCity,
Baker,
CA
Sample
PhillipsApplication
Milford,
Waters
MA
w o r d e n toegepast met een grotere
ring of uitwisseling v a n o p l o s m i d -
D e m e e s t r e c e n t e h a n d b o e k e n o p dit
p o r i e diameter. Dit laatste o m v e r -
del, bescherming van chromatogra-
g e b i e d w a a r i n bijzonder veel prakti-
s t o p p i n g e n te v o o r k o m e n . E e n
f i s c h e s c h e i d i n g s k o l o m en/of d e t e c -
s c h e i n f o r m a t i e is t e v i n d e n z i j n :
a n d e r v e r s c h i l is d a t L C k o l o m m e n
tiesysteem en dragermateriaal v o o r
v o o r vele analyses moeten w o r d e n
in situ
g e b r u i k t e n dat S P E c a r t r i d g e s , bij
' K o l o m v e r n i e l e r s ' zijn o n d e r m e e r
derivatiseringen.
-
N. Simpson,
Extraction:
Solid
Principles,
Phase
Strategies,
and Applications,
-
New
York,
E.M.
Thurman,
Phase
M.S.
Extraction:
Practice,
New
Marcel
Dekker,
1997
Wiley
York,
Mills,
Solid-
Principles
and
Interscience,
1998
2.3 U i t v o e r i n g e n
apparatuur
tractie C-10 tot C-28 alkenen (resten
w o r d e n u i t g e v o e r d . In d e v a c u ü m
v a n het p o l y m e r i s a t i e proces) kan
manifolds kunnen meestal verschil-
a f g e v e n . V e r d e r blijkt d a t o p s i l i c a
l e n d e rekjes / b a k j e s w o r d e n g e p l a a t s t
gebaseerde materialen, behalve s p o -
w a a r m e e de vloeistoffen w o r d e n op-
ren verontreinigingen, ook een rede-
g e v a n g e n . In d e w a t m e e r g e a v a n -
lijke h o e v e e l h e i d d i m e t h y l o c t a d e c y l -
c e e r d e s y s t e m e n is e e n k r a a n s y s -
silanol kan a f g e v e n . Deze silanol
teem aanwezig w a a r d o o r de stroom-
v e r b i n d i n g , en kleinere h o e v e e l h e -
s n e l h e i d o v e r alle c a r t r i d g e s hetzelf-
S P E c a r t r i d g e s z i j n in e e n g r o t e v e r -
d e n v a n andere silanol v e r b i n d i n g e n
d e is e n s o m s is e r e e n t w e e d e
scheidenheid aan v o r m e n , maten en
zijn waarschijnlijk tijdens de extrac-
v a c u ü m v a t aanwezig dat gebruikt
uitvoeringen verkrijgbaar. De meest
tie d o o r h y d r o l y s e ontstaan. V e r d e r
kan w o r d e n o m s p o e l - en w a s v l o e i -
t o e g e p a s t v o r m is in F i g u u r 1 t e
is a a n g e t o o n d d a t d e h o e v e e l h e d e n
stoffen af te v o e r e n .
zien. Behalve deze 'spuit-vormige'
die vrijkomen v a n deze storende v e r -
(syringe) cartridges zijn er ook c y l i n -
b i n d i n g e n , niet alleen sterk a f h a n g t
der-vormige cartridges, schijf-vormi-
v a n de fabrikant maar ook v a n de
g e (disks) S P E s y s t e m e n e n g e c o a t e
b a t c h d i e w o r d t g e b r u i k t . D a a r o m is
het uitvoeren v a n blanco extracties
fibers verkrijgbaar.
een noodzaak tijdens de ontwikkeling
v a n iedere SPE procedure.
Sample Reservoir
(Polypropylene) —
O n d e r a a n een cartridge bevindt zich
een universele luer tip zodat de cartridge met veel van de beschikbare
v a c u ü m s y s t e m e n kan w o r d e n g e c o m b i n e e r d . Het gebruik v a n luer
tips biedt tevens de mogelijkheid dat
Fritted Disk
(20 \im Polypropylene)
er een injectienaald o p aangesloten
kan w o r d e n o f dat d e cartridge direct
Sorbent Bed
(40 Jim)
kan w o r d e n g e k o p p e l d met e e n filter
of een andere container. De hoeveel-
Fritted Disk
Luer Tip
h e i d s o r b e n s in e e n c a r t r i d g e v a r i e e r t
v a n 10 m g t o t 10 g e n h e t v o l u m e
—
dat o p e e n c a r t r i d g e g e b r a c h t kan
Figuur
1: Vaste-fase
extractie
cartridge.
w o r d e n l o o p t u i t e e n v a n 1 t o t 25 m l .
De meeste cartridges kunnen, via
I e d e r e c a r t r i d g e b e s t a a t uit e e n h o u -
een speciale adaptor, w o r d e n uitge-
d e r ( b o d y ) d i e m e e s t a l g e m a a k t is
rust met reservoir zodat v o l u m i n a
van medisch zuiver polyethyleen of
t o t o n g e v e e r 100 m l in b e w e r k i n g
p o l y p r o p y l e e n . V e r d e r zijn er m e e s t -
kunnen worden genomen.
al e e n t w e e t a l f r i t s (10-20 |im p o r i ë n )
aanwezig, eveneens gemaakt van
S P E c a r t r i d g e s z i j n in h e t a l g e m e e n
Figuur
polyethyleen / polypropyleen. Teflon
o p een zodanige manier gepakt
over
2: Transport
SPE
van
vloeistoffen
cartridges.
of roestvast staal, w a a r t u s s e n het
dat de vloeistoffen, die tijdens een
s o r b e n s is g e p a k t . D e f r i t s z i j n z o
extractie w o r d e n gebruikt, niet d o o r
Het nadeel v a n het gebruik v a n een
gemaakt dat ze weinig w e e r s t a n d
middel van de zwaartekracht d o o r
v a c u ü m m a n i f o l d is d a t i n h e t a l g e -
hebben. Behalve de polyethyleen /
d e cartridge l o p e n . Dit betekent dat
m e e n m a x i m a a l 16-24 m o n s t e r s
p o l y p r o p y l e e n cartridges zijn er ook
of met behulp van positieve druk
g e l i j k t i j d i g in b e w e r k i n g k u n n e n
glazen cartridges verkrijgbaar met
(b.v. g a s d r u k , plastic spuit) of n e g a -
w o r d e n g e n o m e n . Dit p r o b l e e m kan
Teflon of titaan frits. Deze cartridges
tieve druk (b.v. v a c u ü m , plastic spuit)
w o r d e n opgelost d o o r een 96-well
w o r d e n m e t n a m e t o e g e p a s t als d e
of door centrifugeren de vloeistoffen
microtiterplaat systeem te g e b r u i -
w e e k m a k e r s ( a a n w e z i g in k u n s t s t o f
d o o r de cartridge geperst moeten
k e n . M i c r o t i t e r p l a t e n w o r d e n al
materialen) de bepaling kunnen v e r -
w o r d e n ( F i g u u r 2). D e e l u t i e o n d e r
sinds jaar en dag gebruikt v o o r
storen of w a n n e e r er irreversibele
v a c u ü m k a n w o r d e n u i t g e v o e r d bij
immunoassays, maar de toepassing
adsorpties aan polyethyleen / poly-
e e n d r u k v a n c a . 25 m m H g . D o o r
b i j S P E p r o c e d u r e s is r e l a t i e f n i e u w .
Het zal duidelijk zijn dat d e z e s y s t e -
p r o p y l e e n p l a a t s v i n d e n . E r is a a n -
het gebruik v a n speciaal ontwikkelde
g e t o o n d dat de p o l y m e e r h o u d e r ,
s y s t e m e n , k u n n e n bij a l l e d r i e d e
m e n h e t m o g e l i j k m a k e n o m 96
behalve weekmakers, tijdens de ex-
m e t h o d e n , m e e r v o u d i g e extracties
extracties gelijktijdig uit te v o e r e n .
E r w o r d e n in dit g e v a l b l o k k e n o f p l a -
E e n S P E kan zoals g e z e g d o m v e r -
tridge, o p b r e n g e n v a n het monster,
t e n g e b r u i k t die disks o f kleine c a r t r i d -
schillende redenen w o r d e n uitge-
w a s s e n (opzuiveren) v a n het m o n -
g e s b e v a t t e n in e e n m a t r i x v a n 8 bij 12.
v o e r d . H e t is d a a r o m v a n g r o o t
ster en elueren v a n de analiet(en).
belang dat alvorens een S P E proceDe snelheid w a a r m e e de verschillen-
d u r e w o r d t ontwikkeld het doel v a n
D e v o l g o r d e v a n h a n d e l i n g e n in e e n
de vloeistoffen door de verschillen-
d e e x t r a c t i e d u i d e l i j k is. I n d i e n e e n
S P E p r o c e d u r e is n a g e n o e g a l t i j d
d e S P E s y s t e m e n w o r d e n g e p e r s t is
SPE w o r d t gebruikt o m een monster
hetzelfde, o n g e a c h t het feit o f polaire
in e e n a a n t a l g e v a l l e n e e n k r i t i s c h e
t e c o n c e n t r e r e n kan d e v o l g e n d e
of apolaire sorbentia w o r d e n gebruikt
parameter v o o r het verkrijgen v a n
procedure w o r d e n gevolgd: de
en onafhankelijk v a n de procedure
hoge recoveries en reproduceerbare
analiet w o r d t zo g o e d mogelijk v a s t -
die w o r d t toegepast.
r e s u l t a t e n . H e t is d a a r o m v e r s t a n -
g e h o u d e n o p het s o r b e n s , de analiet
De g e n o e m d e vijf basisstappen zijn:
dig, zeker indien relatief h o g e s n e l -
w o r d t v e r v o l g e n s g e ë l u e e r d in e e n
heden w o r d e n gebruikt een grafiek
z o klein m o g e l i j k v o l u m e e n het
Activering
te maken w a a r i n het debiet w o r d t uit-
eluens w o r d t tot slot v e r d e r g e c o n -
met een o r g a n i s c h o p l o s m i d d e l (b.v.
gezet tegen de recovery. Vuistregels
centreerd.
(wetting)
van de
cartridge
m e t h a n o l ) . D e z e s t a p is n o o d z a k e l i j k
bij h e t g e b r u i k v a n S P E s y s t e m e n
o m d a t S P E c a r t r i d g e s in h e t a l g e -
zijn dat d e v e r s c h i l l e n d e activerings,
I n d i e n h e t v o o r n a a m s t e d o e l is o m
m e e n in e e n v a c u ü m v e r p a k k i n g ,
conditionerings, w a s en elutie v l o e i -
e e n m o n s t e r o p te s c h o n e n kan
en dus droog, w o r d e n afgeleverd.
s t o f f e n m e t e e n d e b i e t v a n 5-10 m l /
dezelfde procedure w o r d e n g e v o l g d ,
Activering van een chemisch g e b o n -
m i n o v e r N P en RP fasen k u n n e n
m a a r nu kunnen een drietal p r o c e -
d e n ( h y d r o f o b e ) silica fase heeft als
w o r d e n g e l e i d e n d a t bij IE m a t e r i a -
dures w o r d e n gevolgd: interferende
d o e l d e l u c h t d i e n o g in d e c a r t r i d -
l e n e e n d e b i e t v a n 1-5 m l / m i n is a a n
verbindingen worden vastgehouden
g e s a a n w e z i g is t e v e r w i j d e r e n e n
te b e v e l e n . Het o p b r e n g e n v a n het
terwijl de analiet g e e n retentie v e r -
v e r v o l g e n s o m de koolstofketens te
m o n s t e r kan het b e s t e g e b e u r e n bij
t o o n t , analiet w o r d t v a s t g e h o u d e n
solvateren. O p deze manier w o r d t
e e n d e b i e t v a n 1-2 m l / m i n . E e n s t e l -
terwijl de interfererende verbindin-
een groot oppervlak g e v o r m d waar-
r e g e l is v e r d e r d a t b i j g e b r u i k v a n
g e n g e e n retentie v e r t o n e n en z o w e l
d o o r een efficiënte extractie kan
membranen hogere debieten kun-
d e analiet als d e i n t e r f e r e r e n d e v e r -
plaatsvinden.
n e n w o r d e n (20-50 m l / m i n ) g e b r u i k t
bindingen w o r d e n vastgehouden, en
E e n d e r d e b e l a n g r i j k e r e d e n is h e t
d a n bij t r a d i t i o n e e l g e p a k t e c a r t r i d -
met behulp v a n een geschikte w a s -
v e r w i j d e r e n v a n allerlei resten die
g e s . In T a b e l 1 (zie h i e r o n d e r ) z i j n
vloeistof w o r d e n of de analiet of the
tijdens het p r o d u c e r e n v a n de car-
enkele a l g e m e n e richtlijnen g e g e v e n
interferende verbindingen verwijderd.
tridges k u n n e n zijn a c h t e r g e b l e v e n
v o o r de debieten die gebruikt kunnen w o r d e n .
en de bepaling zouden kunnen verH i e r u i t blijkt d a t h e t d u s n i e t a l t i j d z o
storen. Een eerste visuele controle
is d a t d e a n a l i e t v a s t g e h o u d e n m o e t
v a n de cartridges alvorens aan de
O m s c h o n e r e extracten te verkrij-
w o r d e n o p h e t s o r b e n s . In h e t g e v a l
a c t i v e r i n g w o r d t b e g o n n e n k a n al
g e n , o f o m v e r s t o p p i n g e n te v o o r k o -
sterk polaire v e r b i n d i n g e n m o e t e n
veel problemen voorkomen. Alle op
m e n k u n n e n filters w o r d e n gebruikt.
w o r d e n b e p a a l d is h e t n i e t a l t i j d
silica g e b a s e e r d e fasen h o r e n w i t te
Deze filters k u n n e n v a a k rechtsreeks
mogelijk o m deze g o e d v a s t te h o u -
zijn terwijl o p S D B (styreen d i v i n y l -
aan de luer tip v a n de cartridge w o r -
d e n , zeker niet o p een h y d r o f o b e
benzeen) gebaseerde fasen slechts
den gekoppeld. O m storende deel-
f a s e . In d a t g e v a l is h e t b e t e r o m
e e n licht g e l e tint m o g e n h e b b e n .
t j e s t e v e r w i j d e r e n k u n n e n 0,45 jum
eerst de interfererende v e r b i n d i n g e n
Het niet o p d e juiste w i j z e u i t v o e r e n
N y l o n A c r o d i s c s y r i n g e filters g o e d e
te v e r w i j d e r e n e n e v e n t u e e l in e e n
v a n deze stap heeft meestal lage
d i e n s t e n b e w i j z e n . In c o m b i n a t i e v a n
t w e e d e stap het m o n s t e r te c o n c e n -
recoveries tot gevolg, d o o r een ver-
membraan-extractie disks kunnen er
treren.
m i n d e r d e retentie v a n de analiet(en)
o p d e c a r t r i d g e en/of interferenties
dieptefilters ( d e p t h filters) w o r d e n
in h e t c h r o m a t o g r a m d i e n i e t i n v e r -
toegepast die er v o o r z o r g e n dat
2.4 V o l g o r d e v a n
vaste deeltjes en m a c r o m o l e c u l e n
In p r i n c i p e b e s t a a t i e d e r e S P E p r o c e -
de p o r i ë n v a n het m e m b r a a n niet
d u r e uit v i j f s t a p p e n : a c t i v e r e n v a n d e
het o o r s p r o n k e l i j k e m o n s t e r . Bij het
kunnen verstoppen.
cartridge, conditioneren van de car-
g e b r u i k v a n h y d r o f o b e s o r b e n t i a is
handelingen
band gebracht kunnen w o r d e n met
methanol z o n d e r m e e r de beste keus,
t e r w i j l bij p o l a i r e s o r b e n t i a b e h a l v e
Tabel 1
Richtlijnen v o o r debieten tijdens vaste-fase extracties
m e t h a n o l o o k h e x a a n g e b r u i k t kan
w o r d e n o m onzuiverheden van de
kolom te v e r w i j d e r e n .

Download Report