HOGER T E C H N I S C H I NSTI TUUT O O S T E N D E Schooi voor Technische ingenieurs V erhandeling Z < > ui < z lu y Q 4/1 rr 111 ï a — < 0¿ O > 7) V LU X Kwalitatieve en kwantitatieve dunnelaagchromatografie van fosfolipiden z o Ü door u . V V Ui X £ aí 2 ri O Ui 0 z m X Cecile VANSTEELANDT z Onder leiding van de heer W, VYNCKE, Ir. 0 2 Fy» ÜJ Q z < Z X o Ui X D£ ui > Schooljaar 1 9 7 0 -7 1 3H blz. tekst jj figuren HOGER T E C H N I S C H I NSTI TUUT O O S T E N D E School voor Technische Ingenieurs V erhandeling z < > o < < LU O z D ex V o LU X O Ln LU Q Z < > LU Q Kwalitatieve en kwantitatieve dunnelaagchromatografie van fosfolipiden Z z LU z 0 0 E— LU CO X door Cecile VANSTEELANDT Q¿ ELU I E— 0 i— O z i LU Q Z < X D IJU Z LU Onder leiding van de heer O z W . VYNCKE, Ir. X O LO z X O LU 1— ex LU > Schooljaar 1 9 7 0 -7 1 3*i blz. tekst 3 figuren INHOUD . Inleiding 3 Een woord van dank 4 Hoofdstuk I : De fosfolipiden 5 1.1. Overzicht 5 1.2. Voornaamste fosfolipiden 7 Hoofdstuk II : Dunnelaagchromatografie met fosfolipiden 2.1. Dunnelaagchromatografie 2.1.1. Algemene beschouwingen 11 11 11 2.1.2. Factoren waarmee men dient rekening te houden Hoofdstuk III : Kwalitatieve en kwantitatieve analyse 12 14 3.1. Kwalitatieve analyse 14 3.2. Densitometrische analyse 15 3.2.1. Apparatuur 15 3.2.2. Oppervlaktemetingen 15 3.3. Kwantitatieve analyse 3.3.1. Methode zonder extractie 3.3.1.1. Radioaktiviteitsmeting 16 16 17 3.3.1.2. Bepaling van de afmetingen van de vlekken 3.3.1.3. Fotometrische bepaling 3.3.2. Methode met extractie Hoofdstuk IV : Kwalitatief onderzoek 17 17 17 18 4.1. Beschrijving 18 4.1.1. Platen 18 4.1.2. Het klaarmaken van de oplossingen van fosfolipiden 4.1.3. De spot 19 20 4.1.4. Het loopmiddel 21 4.1.5. De looptijd 22 4.1.6. Scheiding van voornaamste fosfolipiden 22 4 .1.7 . Detectiemiddelen 23 - 2 - Hoofdstuk Y : Kwantitatief onderzoek -Densitometrie 28 5.1. Densitometrie 28 5.2, De gebruikte apparatuur 28 5.3. Problemen bij de kwantitatieve analyse bij het scheiden van fosfolipiden door middel van DLC 5.4, Proefnemingen 30 30 Algemeen besluit 33 Bibliografie 34 INLEIDING . Sommige vissen zijn rijk aan vetten, voornamelijk fos folipiden en neutrale lipiden (triglyceriden). Deze verbindin gen zijn voor de kwaliteit van vis belangrijk, omdat ze voor name smaak- en geuroomponenten zijn en daarenboven zeer gevoe lig voor bederf zijn. Daarom is het ook van belang deze stof fen nader te bestuderen. Deze verhandeling vormt een bijdrage tot de dosering van fosfolipiden in vis. Ais scheidingstechniek wordt de kwalitatieve dunnelaag chromatografie aangewend daar deze de laatste jaren meer en meer op de voorgrond getreden is in het gebied van de biochemie. De voornaamste factoren die de kwantitatieve densitometrische dosering beïnvloeden worden bestudeerd. Er mag er op gewezen worden, dat de intensieve toepassing van de D.L.C. een ophelde ring van de samenstelling van deze mengsels kan helpen verwezen lijken. Tegenwoordig is nog altijd weinig bekend over het chromatografisch gedrag van polaire lipiden van zeer ingewik kelde structuur. - 4 - Een woord van dank. Ik houd er aan dr. ir. W. Vyncke oprecht te danken voor de aangename leiding en de zeer gewaardeerde hulp die ik mocht ontvangen. Mijn dankbaarheid gaat ook uit naar dr. P. Hovart, Directeur van het Rijksstation voor Zeevisserij te Oostende en naar ir. M. Doucet, die mij de gelegenheid boden dit werk in de laboratoria van het station uit te voeren. - HOOFDSTUK I ; 5 - DE FOSFOLIPIDEN . 1.1. Overzicht. (1) In levende systemen zijn de structuren van cellen en weefsels gebaseerd op grote moleculen - de proteïnen, polysacchariden en complexe lipiden. Alhoewel de meeste lipidische moleculen niet zeer complex zijn, bestaat er een grote ver scheidenheid van mengsels, waarvan veel van deze slechts in samenstelling verschillen. Het woord ’’Lipid" sluit een uitgebreide groep van meng sels in : a. Neutrale vetten (glycerol esters van grote langketene vetzuren). b. Vaste esters van langketene monohydrische alcoholen. 2. §amengestelde_lipiden. (esters van vetzuren met alcoholen, welke ook een toegevoegde groep bevatten). a. Fosfolipiden (lipiden bevattende een fosfaatgroep). b. Cerebrosiden en gangliosiden (lipiden bevattende carbohydraatgroep). c. Sulfolipiden (lipiden bevattende een sulfaatgroep). Deze groep bevat produkten afkomstig van 1. en 2. welke nog lipidische karakters bezitten. Zij sluiten vetzuren, lange ketens van alcoholen, sterolen in. 4. Trassen. De jongste jaren is de informatie over de structuur en stof wisseling van de fosfolipiden aanzienlijk aangegroeid, meestal ais een resultaat van nieuwe methoden der fractionering, welke gedaan wordt op de bereiding van zuivere substan ties. Deze aangroei volgt ook uit de chemische synthese van geschikte mengsels met parallele kenmerken. Het is niet on waarschijnlijk, dat in de nabije toekomst de meeste fosfoli- - 6 - pidische componenten van weefsels zullen gekarakteriseerd en gesynthetiseerd zijn. De eerste waarneming dat "fosfolipid" beperkt was tot vette substanties werd gedaan op hersenextracten. Deze ontdek king werd gedaan door L.N. Vauquelin in 1811, die ethanol ais extractor gebruikte; ether was geen gekend oplosmiddel in deze tijd en chloroform was nog niet gesynthetiseerd. noemde Gobley (1811-1876) later "lecithin^. Dit laatste In zijn publika- ties van 1850 toonde Gobley ook aan dat glycerofosforigzuur verkregen wordt van lecithine, terwijl Diaconow het bestaan van "choline" demonstreerde in 1868. Door deze observaties waren Diaconow en Strecker in staat de structuur van lecithine na te gaan. Het is echter door J.L.W. Thudichum (1828-1901) dat de fosfolipidische chemie aanzienlijke vooruitgangen gemaakt heeft. In de loop van zijn onderzoekingen op hersenen, zonderde hij vele fosfolipidische fracties af welke hij trachtte te classificeren door zorgvuldige analysen. Veel van deze sub stanties die b.v. "cephaline" bevatten kunnen gescheiden worden van hersenlipiden en onderscheiden worden van lecithine door hun geringe oplosbaarheid in warm ethanol. Hij beschouwde ethanolamine niet ais een normaal bestanddeel van cephaline maar ais een ontledingsprodukt van choline. Thudichum zonderde van de hersenen ook een fosfolipid af welke hij sphingomyelin noemde (sphingein : stevig binden) (myelos : merg, kern). Levene voerde extensieve onderzoekingen uit op de schei ding van een zuivering van sphingomyelin lipiden. en van andere foafo- Hij identificeerde ook sommige bestaande vetzuren. In 1929 toonde Klenk aan dat "sphingosine" een C^g structuur had. Ondanks deze onderzoekingen werd de structuur van sphin gomyelin nog niet bewezen tot 1953. De moeilijkheden liggen meestal in de afwezigheid van geschikte methoden der fractionering en in het verkrijgen van componenten die moeten gekristalliseerd worden. zen Levene en West dat voor sphingomyelin In I9I6 bewe soms 30 herkristal- - 7 - lisaties nodig zijn vooraleer de substantie in een voldoende graad van zuiverheid verkregen wordt. De meeste van de vroegere methoden der fractionering der fosfolipidische mengsels berusten op de verschillende oplos baarheid van hun componenten. Het was duidelijk b.v. dat ■eikeL sphingomyelin íe-cXJtf^L^e- wu/t. e«. in werkelijk onoplosbaar was in-lwarm ethanol dan de componenten van "cephaline". Folch exploiteerde brillante oplossingen in 194-2 wanneer hij met succes "brain cephalin" in 3 fracties scheidde bevattende respectievelijk ethanolamine, serine en inositol. 1.2. Voornaamste fosfolipiden.(2) Fosfolipiden zijn lipiden waarin één van de hydroxyl— groepen van het glycerol molecule veresterd is met een fosforgroep, nl. fosfor choline fosfor ethanolamine fosfor serine De ethanolamine fosfolipiden bestaan in de volgende 3 omen : vormen . 1 H H i i H~C - 0 - C - C - (CH0) - CH, 2, i I 2 X 3 H H HC - 0 - C - (CH0) , - CH, i ¡i 2x 3 f 0 - PE 2. Ether-ester fosfor E0C - 0 - C - (CH0) - CH, 2i o 2 x 3 0 HC - 0 - C - (CH0) . - CH, i h 2 x 3 I 0 - PE 3. Diester fosfor (cephalin) H~C - 0 - C = C - (CH0) - CH-, 2 i i 2 x 3 I H H HC - 0 - C - (CH0) . - CH, i I I! 0 H 2C - PE PE = fosfor ethanolamine Vinyl ether-ester fosfor (plasmalogen) 8 - - Men kan aannemen dat cholinefosfolipiden en serinefosfolipiden ook opkomen in de ether-ester, vinylether-ester en diester vorm. Glyceryl fosforcholine, glyceryl fosforethanolamine, en glyceryl fosforserine, veresterd met slechts de helft van een vetzuur en dus een vrije hydroxy groep bevattende, worden lysomengsels genoemd. Lysolecithine wordt hier ais voorbeeld ge toond : H0C - 0 - C - (CH0) - CH, 2, „ 2x 3 H(? - °H I o H 'f I lysolecithine H i 4 CH- E0G - 0 — P — 0 — C - C - N - CH, 2 I I I x 5 CH0 H H De fosfaatzuren zijn een groep van fosfolipiden die geen basen bevatten. Zij komen in de natuur voor, mogelijks ais hydrolyseprodukten van choline, ethanolamine en serine-fosfaten. H2C - 0 - C - (CH^)x - CH5 0 HC - 0 - C - (CH0) i il -, CH, 3 f 0 0H0C - 0 - P ^ 0 2 v 0 Ct— y phosphaticinezuur Phosphatidyl glycerol, cardiolipin en phosphoinositide bevatten ook geen basen. H: C - o - C - (CH0) - CH, 2i u 2'x 3 0 HC - 0 - C - (CH0) . - CH, II 2 x 3 0 0 H2C - OH HC - OH T h 2c - 0 P I 0 -o -CH. phosphatidyl glycerol 9 - - h 2c -o -c -(c h 2 )xII H,C-(CH0) -C-0—CH0 3 2 x ji 2 0 0 H,C-(CH0) ,-C-O-CH 3 2 x ,, HC-0-C-(CHo) „,-CH, i, ¿X ? o 0 H H H 0 T i i i r o H0C*-0~P—0 -C -C ~C -0 -P-0 -CH0 d i i i i ¿ - H H 0 0 OH h 2c -c h 3 Cardiolipin - o - C - (CH0) - CH, h 2 x 3 0 HC - 0 - o - (CH2 ) II 0 H2C - 0 CH, ¿ X 0 t p S 0 OH OH ./ ■0 o T >- OH ...(- 0 - p P - OR) 0 OH OH phosphatidyl inositol en diphosphatidyl inositol. Een verdere groep van fosfolipiden, de sphingomyelins, zijn samengesteld uit een meerwaardig aminoalcohol, fosforigcholine en een vetzuur. HN - C - (CH0) - CH-, lí 2 x 3 H H,C 3 (CH-).- ¿ c I = c 0 H - H sphingomyelin c I OH - c I H - ch0 I 0 H H CH, i « +X 3 0 - C - C - N - CH, I S CHj H ‘ 10 - - Glycolipiden, als cerobrosiden gangliosiden, bevatten spbingosine en een suiker. HN - C - (CH0) - CHZ ii 2 x 5 0 H H I I CHZ - (CH2)12 - C = C - C - C - C H . i l H OH i Cerebroside t H 0 - glucose HN - C - (CH0) - CH-, Il 2 x 3 0 CH-, - (c h 2)12 C I H H H I I C - C - C - CH~ I I I OH H galactose I glucose - Neuraminic zuur I hexosamine 11 - HOOFDSTUK II : - DUNNELAAGCHROMATOGRAFIE MET FOSFOLIPIDEN . 2.1. Dunnelaagchromatografie (D.L.C.). 2.1.1. Algemene beschouwingen (3). DLC is een analytische methode, waarbij een oplossing met een mengsel van verbindingen, aangebracht op een aangepaste plaat (of folie), met behulp van een geschikt loopmiddel in zijn componenten wordt gescheiden. Die scheiding ontstaat door een verdeling van de compo nenten tussen een stationaire fase en een mobiele fase. biele fase is een vloeistof, het zogenaamde loopmiddel. De mo De stationaire fase, een adsorbens of een vloeistof, is op een glas-, aluminium- of plastiekplaat aangebracht. Bij adsorbentia zoals silicagel verdelen de komponenten zich over de loopvloeistof en het oppervlak van het adsorbens (adsorptiechromatografie). Is de stationaire fase een vloeistof dan spreekt men van een verdeling tussen twee vloeibare fasen (verdelingschromatografie). Deze twee vormen van Chromatografie kunnen echter niet scherp worden gescheiden. Het te onderzoeken mengsel van opgeloste stoffen wordt door middel van een micropipet op een bepaald punt (de start- lijn) van het adsorbens aangebracht, en het oplosmiddel met een warme luchtstroom verdampt. Voor de scheiding van de componen ten (ontwikkeling) wordt de plaat vertikaal in een cuvet ge plaatst (zie fig. 1, 2, 3, A). Dit is een glazen cuvet met dek sel die hermetisch afgesloten is van de buitenlucht en waarin zich ongeveer 1 cm loopvloeistof bevindt. De loopvloeistof be vochtigt het adsorbens en wordt door capillaire werking opgezo gen. Na ontwikkeling wordt de plaat uit de cuvet genomen, het loopfront wordt aangetekend, en de loopvloeistof verdampt in een droogstoof bij 60° C, voorzien van ventilatie. Slaagt de eerste scheiding er niet in alle componenten te verdelen, dan wordt de plaat over de 90° gedraaid en met een tweede loopmiddel behandeld (ééndimensionale en tweedimensiona- - 12 - le chromâtografie) (A). Na de scheiding kunnen de niet gekleurde componenten zichtbaar worden gemaakt met behulp van een eenvoudige techniek : besproeien met een reagens, dat aanleiding geeft tot kleurvorming met de componenten, bestralen met U.V. licht of in contact brengen met iodiumdampen (revelatie). Zowel een kwalitatieve ais kwantitatieve analyse kan nu uitgevoerd worden. 2.1.2. Factoren waarmee men dient_rekening_te houden. De kleurintensiteit evenals de kleur van de besproeide vlekken hangt af van de omstandigheden vóór, tijdens en na de revelatie. 2.1.2.1. Revelatietemperatuur en revelatieduur. De aangewende temperatuur varieert van sproeimiddel tot sproeimiddel. Wel blijkt er een verband te bestaan tussen temperatuur en tijdsduur enerzijds, en temperatuur en soort oplosmiddel van het sproeireagens anderzijds. 2.1.2.2. Bewaartemperatuur. Men bemerkt een verandering in kleurintensiteit bij het bewaren van de gereveleerde Chromatogrammen. De temperatuur heeft ook wel een invloed, omdat de activiteit van het adsor bens afhangt van de temperatuur. 2.1.2.3. Vochtigheidsgraad. De relatieve vochtigheid heeft eveneens een invloed op de kleurintensiteit. 2.1.2.A. Aard van het oplosmiddel. De aard van het oplosmiddel voor het sproeimiddel is eveneens van belang. Een bepaalde revelatietemperatuur wordt ook aangegeven bij een bepaald oplosmiddel. 2.1.2.5. De aangewende concentratie van het te onderzoeken mengsel in een oplossing. Een grote concentratie geeft een intenser kleur dan een kleine. Hier moet op gewezen worden dat het gebruik van micro- pipetten ook niet heel nauwkeurig is, alhoewel de fout eerder miniem is. - 13 - 2.1.2.6. De ti,jd na revelatie. De kleurintensiteit van de gereveleerde Chromatogrammen vermindert gewoonlijk met de tijd na revelatie, vooral wanneer ze in contact zijn met de lucht en aldus oxidatie mogelijk is. 2.1.2.7. Hoedanigheid van het adsorbens. De hoedanigheid van het adsorbens verschilt heel dikwijls van plaat tot plaat of van plaats tot plaats. Daarom is het aangeraden een reeks onderzoekingen uit te voeren om reprodu ceerbare resultaten te bekomen. 2.1.2.8. Verzadiging van de cuvet. De verzadigingsgraad van de atmosfeer in de cuvet oefent een sterke invloed uit op de kleurintensiteit en ook op de Rfwaarde. 2.1.2*9« Besluit. Men dient al deze factoren zo constant mogelijk te houden voor een goede reproduceerbaarheid, die dan ook voor de kwanti tatieve analyse van groot belang is. - HOOFDSTUK III : 14 - KWALITATIEVE EN KWANTITATIEVE ANALYSE . 3.1. Kwalitatieve analyse. (5) De kwalitatieve analyse is gewoonlijk gebaseerd op de me ting van de Rf—waarden, Per definitie is dit de verhouding van de afgelegde afstand van de component en de loopafstand van de loopvloeistof, gerekend vanaf het startpunt. Bij de chromâtografie op papier of dunnelaag blijkt, dat ook de Rf-waarden van een component, die onder gelijke condi ties een chromatografisch proces heeft ondergaan, niet dezelfde zijn. De onderlinge verhouding van Rf-waarden van diverse com ponenten blijkt echter gewoonlijk wel gelijk te zijn voor ver schillende Chromatogrammen. Omdat de mogelijkheid bestaat, dat 2 verschillende aomponenten op een chromatogram gelijke Rfwaarden hebben, zal men uit de gegevens van één chromatogram geen conclusies mogen trekken aangaande de zuiverheid van een stof of de identiteit van 2 componenten. Wil men wel gerecht vaardigde conclusies trekken, dan zal men Chromatogrammen moeten maken met verschillende loopvloeistoffen en adsorbentia of sta tionaire fasen. De Rf-waarde hangt hoofdzakelijk af van de aard van de loopvloeistof, het sorbens, de temperatuur, hoe veelheid van het substans en van de verzadiging van de cuvet. De vorm van een chromatografische vlek is niet altijd rond. Dit kan verschillende oorzaken hebben : a. De hoeveelheid stof, die opgebracht is, is te groot (over belasting van de stationaire fase). Het resultaat is dan dikwijls een langwerpige vlek, waarvan de juiste Rf-waarde moeilijk te bepalen is. b. Doordat tijdens het opbrengen de dunnelaag gemakkelijk enigszins beschadigd kan worden, is de elutie van een vlek niet meer gelijkmatig. Afwijkende vlekvormen zijn ook hier het resultaat. c. Door het optreden van meer dan één vloeistoffront, kan er frontaalanalyse optreden, waardoor de vlekken ais zeer - 15 - smalle bandjes zichtbaar zijn. d. Afwijkende vormen kunnen ontstaan door "randeffecten” of door een niet-homogene verzadiging van de ruimte met de damp van het elutiemiddel. Meer dan één vloeistoffront kan optreden bij het gebruik van elutievloeistoffen, die samengesteld zijn uit componenten met een verschillende polariteit. 3.2. Densitometrische analyse. 3.2.1. Agp aratuur. De apparatuur bestaat uit 2 delen : - een automatische densiteitsmeter. - een registreerapparaat. De optische densiteit van de vlekken wordt door het re gistreerapparaat omgezet in pieken, waarvan de oppervlakte recht streeks evenredig is met de stofhoeveelheid van de vlek. 3.2.2. O p p e r v l a k t e m e t i n g e n . (5) Voor de kwantitatieve analyse van een mengsel wordt ge bruik gemaakt van de eigenschap, dat in een min of meer beperkt concentratiegebied de oppervlakte van een piek recht evenredig is met de hoeveelheid van de betreffende component. We dienen dus de oppervlakten van de pieken in het chromatogram te meten. Voor de berekening hieruit van de hoeveelheid stof moeten even eens de evenredigheidsfactoren bekend zijn ofwel bepaald worden. Het bepalen van de oppervlakte van de piek kan gebeuren op verschillende manieren. - Het produkt h met Vm• Het produkt van de piekhoogte en de breedte op halve hoogte is voor een Gauss-vormige piek evenredig met de opper vlakte. Voor de oppervlakte van een Gauss-vormige piek geldt : h . W = 0,94- A Wordt een asymmetrische piek vergeleken met een Gauss-vormige piek, dan wijkt voor de asymmetrische piek de evenredigheidsfactor af van de waarde 0,94- en vindt men dus niet de juiste oppervlakteverhouding. Een ander bezwaar is, dat van smalle - 16 - pieken w}£ niet voldoende nauwkeurig kan worden gemeten. - Trianguleren. - Uitknippen en wegen. Deze methode is tijdrovend, maar kan vooral voor asymme trische pieken vrij nauwkeurige resultaten opleveren. Een be zwaar is, dat het chromatogram verloren gaat. De dikte en het vochtgehalte van het registreerpapier moeten constant zijn. - Planimetreren. De planimeter is een eenvoudig mechanisch rekeninstru ment* Het meet de piekoppervlakte ais men een fijne stift langs de omtrek leidt. Het aantal oppervlakte-eenheden kan op een telwerkje worden afgelezen. De planimeter werd in het onder zoek aangewend. - Integratie. De integratie van de piekoppervlakte is minder tijdrovend dan de andere methoden voor het meten van de piekoppervlakten. Het nadeel is echter dat een integrator een rechtlijnig verlo pende basislijn vereist, wat vaak niet het geval is bij DEC, gezien de onmogelijkheid volledig uniform te besproeien. De in te gr at or-waarde zou geen lineair verband meer geven met de op pervlakte van de piek. 2,3. Kwantitatieve analyse. (2) Hier kunnen we onderscheid maken tussen de methode zonder extractie en de methode met extractie. 2.3.1. Methode zonder extractie Deze methode wordt ook de bepaling op de dunnelaag zelf genoemd. Deze methode biedt het voordeel, dat er geen vooraf gaande bewerkingen nodig zijn, en dat de plaat kan bewaard wor den voor b.v. latere vergelijking met andere proeven. We moeten hier een onderscheid maken tussen het niet of wel radioactief zijn van de component. - 17 - 3.3.1.1. Radioactiviteitsmeting. Dit gebeurt door meting van een zwarting van röntgenfilm, die op het chromatogram werd gelegd. voelig, maar soms erg langdurig. Deze meting is zeer ge Een andere methode is directe meting met telbuizen, eventueel met automatische registratie. Men maakt ook gebruik van scintillatiemeting. 3.3.1.2. Bepaling van de afmetingen van de vlekken. Volgende relatie werd vooropgesteld : de wortel uit de vlekoppervlakte is evenredig met het logaritme van de stofhoeveelheidi Het blijkt dat de relatie minder nauwkeurig is dan de fotometrische bepaling en afhankelijk is van de combinatie drager-component-detectiemiddel. 3.3.1.3. Fotometrische bepaling. We kunnen aan de hand van de hoeveelheid gereflecteerd of doorgelaten licht kwantitatieve bepalingen uitvoeren, omdat de ingestraalde hoeveelheid licht door de component voor een deel gereflecteerd, geadsorbeerd of doorgelaten wordt. Zo kan men reflectiemetingen en transmissiemetingen uitvoeren. Daar- we deze laatste analysemethode toepassen, gaan we op deze tech niek dieper in. 3.3.2. Methode met_extractie. Deze methode wordt ook nent genoemd. worden. bepaling na elutie vande compo Hiermee kunnen nauwkeurige resultaten bekomen De gekleurde of met U.V.-licht behandelde component wordt van het dragermateriaal geëxtraheerd. Het oplosmiddel wordt verdampt en een kleurreactie wordt zo nodig uitgevoerd. Langs optische weg (spectrofotometrisch) wordt een ijkkurve opgesteld. Aan de hand van deze ijkkurve kan men onbekende hoe veelheden van de component kwantitatief bepalen. Bij foliën kan de vlek ook kan de vlek uitgekrabd en worden uitgesneden en opgelost; opgelost worden. Deze bepaling kan eveneens langs titrimetrische en polarografische weg worden uitgevoerd. - HOOFDSTUK IV : 18 - KWALITATIEF ONDERZOEK . 4.1. Beschrijving. 4.1.1. Platen. Volgens de literatuur zijn de platen verkrijgbaar in de handel meer betrouwbaar dan de zelf bereide platen, gezien hun grotere reproduceerbaarheid, hetgeen essentieel is voor kwanti tatief onderzoek. Men raadt meestal aan de platen eerst 30 minuten bij 110° C te activeren om een betere scheiding te ver krijgen. In de proeven werd echter ondervonden, dat deze acti- vatie in geen geval noodzakelijk is. Het onderscheid tussen de geactiveerde en niet-geactiveerde plaat is het volgende : de geactiveerde mag vlugger uit het loopmiddel gehaald worden, terwijl de niet-geactiveerde een betere scheiding geeft en dus een grotere Rf—waarde, zodat men aan de laatste de voorkeur geeft. Dit werd vastgesteld in een proef met een mengsel van neutrale lipiden. In volgende tabel geeft men de Rf-waarden van de stoffen aan vermenigvuldigd met 100. Stof Geactiveerd Glyc eroltri oleaat 10 Oliezuur 13 Methyloleaat 10 Niet geactiveerd 24 14 34 18 61 13 81 Volgens E. Stahl moeten de verschillende klassen van fosfolipiden, sulfolipiden en glycolipiden gechromatografeerd worden op silicagel bevattende CaSO^ (silicagel G) of op ge woon silicagel (silicagel H). Platen bedekt met cellulose worden toegepast voor verdelingschromatografische scheidingen van fosf'oriden en andere polaire lipiden. - 19 - Bij de scheiding van fosfolipiden werden een vijftal platen bebroefd, 1, Schleicher_imd__Schüll platen_silicagel_met_zetmeel_als_bindmiddel¡_ Die platen geven geen goede scheiding : de vlekken liggen te laag en er is een groot randeffect. Men kan enkel dampen gebruiken ais revelatiemiddel. 2 . _^Merck^ platen_silicagel_zuurbestendig^ Deze plaat geeft het beste resultaat. Elke spot van le cithine geeft 4 vlekken (3 kleine en één grote van lecithine zelf). Het loopfront van de "Merak"plaat is veel hoger dan van de gewone silicagelplaat. 3» Schleicher_und_Schüll silicagel zuurbestendig. De scheiding is niet zo goed ais met de "Merck"platen, De vlekken liggen dicht opeengehoopt bij het loopfront en er is ook een randeffect. De silicagelbekleding van de plaat is zeer broos, zodat ze bij aanraking gemakkelijk afschilfert. 4, Schleicher_und_Schüll plastiekplaten_silicagel_zuurbestendig_j_ De plastiekplaten zijn mechanisch sterker. van De plaats devlekken wordt bepaald door de concentratie en het rand effect , zodat de vlekken niet op een horizontale lijn liggen. 5# S e£ 5.e¿m£ e¿ (Schleicher und Schuil). Dit geeft in iodiumdampen een slecht resultaat; enkel lecithinevlekken zijn te bespeuren. 4,1.2. Het_klaarmaken_van_de_oplossingen yan_fosfolipiden. Er werd gezocht naar de voorwaarden om een optimale scheiding van de voornaamste fosfolipiden te bekomen, namelijk : - Geschikte concentratie. Een te grote concentratie geeft te langgerekte vlekken na looptijd en revelatie en de scheiding is niet duidelijk, door dat de verschillende componenten van de spot min of meer dooreengelopen zijn. Een te kleine concentratie heeft het nadeel, dat de componenten te weinig waarneembaar zijn en zelfs achterwege blijven, - Geschikt loopmiddel. - Looptijd. - 20 - - Revelatiemethode. De voornaamste fosfolipiden voor vis zijn : 1. Lecithine 2. Type I, phosphatidyl inositide 3. Type V, phosphatidyl ethanolamine 4. Sphingomyelin 5. Lysolecithine. Het onderzoek bleef tot deze verbindingen beperkt. 4.1.3. De spot werd aangebracht met geijkte capillairen (z.g. “microcaps"). Dit zijn glazen capillaire buisjes van hoge pre cisie, welke zo zijn gekalibreerd dat zij, indien geheel gevuld, een bepaald volume vloeistof bevatten, nauwkeurig op 1 % of be ter, De prijs is zo laag, dat zij na gebruik weggeworpen kunnen worden. Men bespaart dan de moeite en tijd van het reinigen, wanneer gevaarlijke vloeistoffen behandeld worden. 5e_ge^ruiksaanwijzing van_een_microcap. Zie fig. 5. De pipet wordt door het gummikopje A gestoken, zodat hij door het glazen gedeelte B zichtbaar wordtf In het gummiballon- netje C is een opening, zodat de pipet zichzelf door capillaire werking vult. Zodra de pipet gevuld is, plaatst men een vinger op de opening in het gummiballonnetje en knijpt de inhoud uit. Op de plaat werden de stoffen gegeven in 4.1.2. ais spot aangebracht. Er werden oplossingen van 1,25 % bereid. Uitgaande hier van werden gelijke volumes van de bovenstaande fosfolipiden aan gewend om een bepaald mengsel te bereiden. Spots van 1 ƒ! 1 en 2 ƒ! 1 werden aangebracht. De cuvet werd omgeven met filtreerpapier, ten einde een verzadiging te verwezenlijken. - 21 - 4.1.4. Het_loopmiddel. (2 ) Vooral mengsels van chloroform en methanol met een wei nig water zijn geschikte oplosmiddelsystemen voor D.L.C. van fosfolipiden. Deze laatsten worden sedert jaren al gebruikt voor het scheiden van fosfolipiden op cellulose papier behan deld met kiezelzuur, op glazen plaat, en op kiezelzuur kolommen. Wagner, alsook H'órhammer en Wolfi bevelen het oplosmiddel chloroform, methanol, water (65-25-4) aan voor het scheiden van ester bevattende fosfolipiden volgens klassen van samenstelling. Schlemmer gebruikt ook chloroform-methanol-water voor het scheiden van fosfolipiden. 75-22-5 en 65-30-5 aan. Hij beveelt verhoudingen van Dain, Weicher, Schmidt en Thannhauser verkiezen ammoniumhydroxide mengsels van chloroform-methanol, alsook chloroform-methanol (25+75) of (75+25) met NH^. Jatzkewitz was de eerste die D.L.C. toepaste voor het scheiden van fosfolipiden, sulfolipiden en glycolipiden. Hij geeft de voorkeur aan een mengsel van NH^ en n-propanol ais oplosmiddelsysteem. In volgende tabel worden de oplosmiddelsystemen beschre ven voor de scheiding van polaire en ionische lipiden.. chloroform - methanol - water LTN OJ 75 + 22 + 3 65 + 30 + 5 + 4 65 + benzeen - ammoniumhydroxide 1 N alkalisch chloroform - methanol 40 ml ammoniumhydroxide/1 - 14 N zure chloroform - methanol (methanol bevattende 5 % zwavelzuur 0,1 N) 60 + 35 + 8 10 + 1 75 + 25 25 + 75 97 + 3 80 + 20 aeeton - ammoniumhydroxide 14 N 10 + 1 n-propanol — water 70 + 30 n-propanol - HHJ3H 12 N 80 + 20 n-propanol - NH^OH 14 N 70 + 30 n-butanol - pyridine — water 60 + 40 + 20 - 22 - Resultaten. Ais loopmiddel heb ik chloroform - methanol - water in de verschillende verhoudingen gebruikt, en hieruit ttleek dat de verhouding ( 6 5 - 2 5 - 4 - ) de beste scheiding gaf. Dittmer raadt aan niet 4- ml water te nemen, maar wel 2 ml water en 2 ml pyri dine. In dit geval komen de vlekken goed uit big detectie in I2 dampen, terwijl de achtergrond in geen geval homogeen is» Ais laatste heb ik nog n-propanol met water beproefd, wat lang uitgerekte vlekken geeft. Voor dit laatste loopmiddel bedraagt de looptijd 3 uren, waar het in de voorgaande gevallen slechts 2 uren is. 4-,1 .5 . De_looptijd. Deze bedraagt over 't algemeen 2 uur, maar verschilt van loopmiddel tot loopmiddel en vooral van plaat tot plaat. - Schleicher und Schüll silicagel : 2 uur - Schleicher und Schüll plastiekplaten : 1.4-0 h - Schleicher und Schüll plastiekplaten silicagel+ 15 geacti i veerd : 1.30 uur - Schleicher und Schüll plastiekplaten silicagel + 30 minuten geactiveerd : 1.30 uur - Schleicher und Schüll plastiekplaten silicagel + 3 uur geac tiveerd : 1.4-0 uur - Merckplaten silicagel zuurbestendig : 2 uur 4-.1,6. Scheiding_van_voornaamste_fosfolipiden. a. Proefomstandigheden. Op een "Merck11 plaat silicagel zuurbestendig worden de stoffen gegeven in 4-,1.2. (phosphatidyl inositide, phosphatidyl ethanolamine, lysolecithine, sphingomyelin, mengsel) in concen traties van 1,25 % en 2,5 % op de plaat aangebracht. Een verzadigd loopmiddel van een mengsel chloroform methanol - water in de verhouding 65 - 25 - 4- wordt voor de ontwikkeling van de plaat gebruikt. De looptijd bedraagt 2 uur, vooraleer de loopvloeistof ongeveer 10 cm boven de startlijn opgezogen wordt. - 23 - Als revelatiemiddel gebruikt men iodium. Dit is nog maar een nieuwe methode, die nog niet helemaal op punt gesteld is, en nog verder dient onderzocht te worden. b. Rf-waarden : zie figuur 7« Rf-waarde Stof 1,25 % 2,5 % Phosphatidyl inositide 44 51 Phosphatidyl ethanolamine 43 49 58 78 84 41 52 63 75 84 Lysolecithine 24 17 Sphingomye1in 44 39 Mengsel 15 29 39 45 66 13 29 41 48 68 78 74 42 51 c. Besluit. De Rf-?/aarden zijn weinig reproduceerbaar. Er bestaat geen overeenkomst tussen de Rf-waarden en de concentratie. Eenmaal neemt de Rf-waarde toe bij grotere concentratie en de andere maal neemt ze af. Bijvoorbeeld voor phosphatidyl ethanol amine is de Rf—waarde bij 2,5 % voor de eerste vlek kleiner dan de Rf-waarde bij 1,25 % terwijl ze voor de tweede vlek bij 2,5 % groter is dan deze bij 1,25 %• 4.1,7. Detectiemethoden, a. Overzicht. E. Stahl (2) geeft verschillende detectiemiddelen aan die toegepast worden in papierchromatografie en aldus ook in D.L.C. 1. i Ninhydrine oplossing voor de detectie van aminefosfaten. 2, Rhodamine B oplossing (alcoholisch) is een algemene indica tor voor fosfolipiden. 5. Iodhumdampen : algemene indicator voor lipiden. 4. Dichloorfluoresceïne sproeireagens. - 24 - 5. Verbrandingstechniek met namelijk : - chroomzuuroplossing (zwavelzuur 40 % + dichromaat) - zwavelzuuroplossing 10 % - zwavelzuuroplossing 50 %. 6. "Dragendorff" reagens voor de detectie van choline fosfolipiden. Dittmer (6) geeft de volgende specifieke detectiemiddelen voor fosfolipiden. 1. Het ammoniummolybdaat perchloorzuur reagens, dat kan toege past worden voor al de fosfolipiden bij papierchromatografie maar niet bij D.L.C. 2. Het molybdeenblauw reagens van Zinzadge. 5. Het rhodamine 6 G sproeimiddel. b. Bespreking. - Algemene indicatoren voor lipiden zijn de alcoholische "Rho damine B" oplossing en iodiumdampen. Met rhodamine B sproei- reagens 0,25 % onder U.Y.-licht zijn heel wat componenten niet zichtbaar. Met iodiumdampen krijgt men een goede revelatie. Na de detectie werd het wegsterven van de vlekken door subli meren van het iodium tegengewerkt door twee platen boven el kaar te leggen in dè frigo, of door de platen te beplakken met doorschijnend kleefplastiek (van het type gebruikt voor het beschermen van documenten). Een andere methode is de plaat bespuiten met een lak "FISONS SCIENTIFIC APPARATUS LTD". Dit laatste is niet al te best, doordat de vlekken uiteenlopen en de achtergrond niet homogeen is. - Met dichloorfluoresceïne sproeireagens, wat groene vlekken geeft op donker violette achtergrond onder U.V.-licht (270 nm), bekomt men geen goed resultaat. - De verbrandingstechniek is o.a. besproeien met 50 % of 10 % zwavelzuur, of chroomzuur oplossing (40 % zwavelzuur + dichro maat), gevolgd door verwarming van de plaat. Dit wordt toe gepast bij de detectie van fosfolipiden alsook van de meeste andere organische samenstellingen. zwarte vlekken. De fosfolipiden vertonen De samenstelling en de gebruiken van deze - 25 - sproeireagentia zijn uitgebreid. Hieronder geef ik enkele voorbeelden die ik toegepast heb : a) Na besproeiing met zwavelzuur 10 %, de plaat direct op de verwarmingsplaat leggen bij 130° C. Na een paar minuten plaatst men ze in de droogstoof bij 110° C gedurende 45 minuten. Resultaat : Men ziet slechts één grote vlek van lecithine met daaronder een langgerekte vlek. b) Na besproeiing met chroomzuur oplossing (zwavelzuur 40 % + dichromaat) is de plaat na verwarming en droging helemaal bespot met bruin-zwarte stipjes. e) Na besproeiing met zwavelzuur 10 %, de plaat eerst drogen bij 100° C gedurende 30 à 40 seconden. Daarna legt men ze op de verwarmingsplaat bij 200° C gedurende 15 minuten. Resultaat : Scheiding is goed maar de achtergrond is niet homogeen. Door glazen staven aan te brengen tussen verwarmingsplaat en besproeide plaat is de achtergrond meer homogeen geworden, alhoewel er nog altijd bruine stipjes te bespeuren zijn. Hierop heb ik ook een blancoproef uitgevoerd om te weten of de niet homogene achtergrond te wijten is aan het sproeimid del, loopmiddel of aan de plaat. 1°_Proef : Na besproeien van de blancoplaat met zwavelzuur 10 % is er niets waar te nemen. Dit laat besluiten, dat de plaat en het plastiek van de sproeibus niet de oorzaak zijn van de niet homogene achtergrond. 2°_Proef : De blancoplaat wordt eerst gedurende 2 uur in con tact gebracht met het loopmiddel alvorens te be sproeien. Gezien er ook niets waar te nemen is, is het loopmiddel er ook niet de oorzaak van. d) Door besproeien van de plaat met zwavelzuur 50 % en ver warming bij 160° C gedurende 20 minuten, krijgt men geen goede scheiding en is de achtergrond bruin verbrand. Besluit : De verbrandingstechniek kan niet gebruikt worden ais een optimaal detectiemiddel, alhoewel de vlek ken niet gemakkelijk wegsterven na detectie. - 26 - - Het "Dragendorff" reagens wordt gebruikt voor de choline fos folipiden. Bereiding : 8 gram bismuth subnitraat worden opgelost in 20 à 25 ml HNO^ (30 %, d=1,18). Deze oplossing wordt traag en onder roeren toegevoegd om een oplossing bevattende 28 g KI en 1 ml HOI 6 N in ongeveer 5 ml water. Het donker neerslag lost terug op, en geeft een oranje rode oplossing* Na afkoelen tot 0° C, wordt getitreerd en aangelengd tot 100 ml met water. De oranje rode oplossing is stabiel gedurende enkele weken indien ze bewaard wordt in een donkere fles in de frigo. De ontwikkelde oplossing (KBil^ reagens) bestaat uit 20 ml water, 5 ml HOI 6 N, 2 ml Dragendorff oplossing en 5 ml NaOH 6 N, toegevoegd in deze volgorde. Enkele druppels HOI 6 N kan toegevoegd worden indien al het Bi(OH)^ niet oplost onder het schudden. Het KBil^ reagens is stabiel gedurende 10 dagen wanneer het bewaard v/ordt in de frigo. Resultaat : Nadat de plaat besproeid is met het bereide "Dragendorff" rea gens, wordt ze gedroogd in de droogstoof bij 110° C. Binnen een half uur ziet men het goede resultaat, namelijk een roze homogene achtergrond met oranje vlekken, maar na een tijdje verdwijnt alles langzamerhand zoals met iodiumdampen. — Rhodamine 6 G sproeimiddel ; een 0,005 %ige oplossing van Rhodamine 6G in water wordt gesproeid op een plaat tot ze uniform vochtig is. Daarna bekijkt men de plaat onder U.V.— licht, terwijl ze nog nat is. ken op een groene achtergrond. Er ontstaan oranje-purper vlek Hoe heviger men besproeit, hoe intenser de kleur. Verscheidene reagentia kunnen toegepast worden op één chromatogram, zodat geen enkel substantie overblijft die niet gedetecteerd wordt. Dit wordt aangetoond in volgende tabel, die van een publikatie van Wagner, H’ órhammer en Wolff genomen wordt. (2 ) - Substantie Rf-waarde Aminozuren 27 - AmmoniumNinhydrin Dragendorff molybdaat reagens Perchloornr. 108 zuur 0 - 0,10 - - Lysolecithin 0,21 + 0,037 - + + Lecithin 0,39 + 0,055 - + + Sphingomye1in 0,29 + 0,055 - + + Colaminecephalin 0,57 + 0,075 + - - Cerebroside 0,78 + 0,075 - - + Cardiolipin 0,92 + 0,015 - - + + positieve reactie - negatieve reactie Volgens Dittmer is de meest bevredigende procedure, de plaat besproeien met Rhodamine 6G^ (algemeen sproeimiddel voor het reveleren van lipiden) en de vlekken rondstippelen met een donker potlood* Nadat de plaat volledig droog is, besproeien met ninhydrin (specifiek detectiemiddel-voor aminogroepen) en de vlekken welke positieve reactie geven worden genoteerd. Ein delijk wordt de plaat dan behandeld met molybdeen-sproeimiddel, zodat de reactie met fosfaatesters ogenblikkelijk is. De volgende mengsels bevattende fosforzuur, cardiolipin, sphingomyelin, phosphatidyl ethanolamine, -serine, -choline, -inositol, en -inositol diphosphate geven positieve reacties met molybdeen sproeimiddel, terwijl vetzuren, vetzuurmethylesters, triglyceriden, langketene alcoholen, cholesterol, cceramide, sphingosine cerebroside, cerebroside sulfaat geen positie ve reacties geven. HOOFDSTUK V ! KWANTITATIEF ONDERZOEK DENSITOMETRIE. (7) t 5.1. Densitometrie. De densitometrische analyse werd verricht met de automa tische uitrusting Photovolt TLC 530 voorzien van een registreerapparaat Varicord 42 (Photovolt Corp. New York) (fig. 5). bezigden een filter van 445 nm. We Dit toestel wordt aangewend bij de opname van Chromatogrammen, gezien het belang van de nauwkeu righeid bij de kwantitatie van de oppervlakken. 5.2. De gebruikte apparatuur. T De TLC Densitometer Model 530. (zie fig. 6.1) Uitrusting bestaat úit volgende onderdelen : - een Multiplier Photometer Model 520-A - een lichtbron - eenheid 52-C - de TLC Stage uitrusting. Aan de hand van fig. 5 kunnen we de apparatuur beschrij ven. Fig. 6.1 toont een TLS Stage uitrusting met lichtbron. A. Plaat waarop de gereveleerde dunnelaagplaat wordt aangebracht B. Klemmen om de gereveleerde dunnelaagplaat vast te maken. C. Regelknop. D. Arm die met regelknop C kan ingesteld worden, zodat het coili matisch diafragmasysteem op + 1 mm van de plaat komt. E. Kollimatisch diafragmasysteem. F. Fotoceleenheid, die op de arm D aangebracht wordt. G. Spleet, waar het licht van de lichtbron die zich bevindt on der de plaat A doorgezonden wordt op de dunnelaagplaat. Het doorgelaten licht wordt door de fotocel F opgevangen. H. Knop, waarmee de plaat A van links naar rechts en omgekeerd kan verplaatst worden. I. Automatische installatie die toelaat de plaat bij constante snelheid te verplaatsen. J, Regelingsknoppen voor de nulinstelling. Fig. 5.2 stelt een fotometer voor, die met de fotocel F - verbonden is langs K. 29 - Dit toestel bevat volgende delen : L. Knop om het toestel aan te zetten. Er is een opwarmingsduur van 15 à 20 minuten nodig, vooraleer het toestel gestabili seerd is. M. Knop om de nulinstelling te regelen. N. Schaal die onderverdeeld is zowel in densiteits- ais in transmissieeenheden. P. Knop die instaat voor de regeling van de gevoeligheid. Q. Knoppen die toelaten de gevoeligheid zo te regelen, dat de naald binnen de schaal blijft. ”2" en "3". Q bestaat uit knop "0", "I", Wanneer knop Q op "0" ingesteld is 4 dient de aflezing op de fotometrische schaal met 1000 vermenigvuldigd te worden, op ”1 n met 100, op "2" met 10. Op "3" krijgen we de gevoeligste metingen en dit vooral voor de hoogste densiteiten. Hoe gebeurt nu de nulinstelling van fig. 6.1 en fig. 6.2? De lichtspot wordt gericht op de dunnelaagplaat, waarop zich geen gereveleerde bestanddelen bevinden. steld. Q wordt op "0 " inge De naald wordt binnen de schaalboog gebracht met M. Nulinstelling gebeurt met de regelingsknoppen J. Kan men de naald niet op “O" instellen, dan wordt Q op "1 " ingedrukt. Eig. 6.3 stelt een registreerapparaat voor. ste delen zijn De voornaam ï A. Papierhouder. B. Glazen staaf. C. Tekenpen, die tegenover een densiteitsschaal van 0 tot 100 beweesgt. D. Tandradjes, die inhaken in de perforaties van papier, zodat het papier kan voortbewegen. E. Densiteitsschaal van 0 tot 100. F. Mechanisme om het papier voort te bewegen. G. Zet de pen in actie. H. Knop om de pen op 100 in te stellen. I. Knop om de pen op 0 in te stellen. K,L. Knoppen om eventuele trillingen van de pen te compenseren. - 30 - Opmerking : De stabiliteit van het registreerapparaat of Varicord is aanneembaar gedurende een aanzienlijke tijdsduur. Toch dient men regelmatig de instelling op "0" met I en op 100 met H op nieuw te regelen. Ook kan men gebruik maken van een automatische integra tor. 5.3. Problemen bij de kwantitatieve analyse bij het scheiden van fosfolipiden door middel van DLC. - Het_ontwijken__van de_vlekken_van_de_dunnelaagplaat. De intensiteit van de kleur vermindert onder invloed van het licht. Oxidatie is dan ook mogelijk. - Het_¿uist_plaatsen_van de vlek onder_de_lichtspot Y^n_de_densitometer. - De_revelatiemethode moet een homogene_achtergrond geven. - De_werkomstandigheden moeten zo_strikt mogelijk_gestandardiseerd zijn. Deze omvatten namelijk : - het gebruik van microcaps - de verzadigingsgraad in de cuvet - dezelfde werktemperatuur - Het_meten_van de piekoppervlakte. De planimetrische methode wordt aangewend gezien zijn grotere reproduceerbaarheid. Met de Aristo nr. 1137 L plani- meter werd elke piekoppervlakte tenminste 3 maal afgelezen. 5.4. Proefnemingen. Twee proefnemingen met lecithine werden uitgevoerd ten einde het verband te kennen tussen de "Duur blootstelling I^ dampen" en de concentratie. - Spot : lecithine. - De "Merck" plaat wordt voor de eerste reeks gedurende een half - 31 - uur in iodiumdampen gehouden en voor de tweede reeks gedurende één uur. Na de ontwikkeling wordt de plaat beplakt met plas- tiekfolie. - Resultaat : zie figuur 8 en 9* Oppervlakte in cm Aantal fl 1 1 uur y¿ uur 1 2 8,4 8,5 8,3 8,5 8,3 Gemiddeld 2 8,3 12,5 11,2 12,5 11,2 Gemiddeld 8,5 Gemiddeld 11,2 Gemiddeld 12,6 Gemiddeld 17,4 12,4 Gemiddeld 12,5 3 14,3 12,6 14,3 12,6 14,2 Gemiddeld 14,3 4 17,5 17,4 17,5 17,4 17,4 17,3 Gemiddeld 17,4 Besl-irxt_met_^be‘b;r?e!k:lc±ng duur blootstelling ^ “dampen. De duur van de blootstelling in iodiumdampen heeft wei nig invloed. Men kan volgens proef één en twee dus niet zeg gen, dat de duur van de blootstelling evenredig of omgekeerd evenredig is met de concentratie. Uit figuur 8 en 9 kan men besluiten, dat het verband 2 tussen concentratie en piekoppervlakte in cm bevredigend blijkt te zijn. 32 - - 3°_Proef. Een derde proef op lecithine werd uitgevoerd ten einde het verschil te kennen tussen twee piekoppervlakten, uitgaande van twee dezelfde concentraties. - Spot : lecithine -3/11 -3/11 - De "Merck" plaat wordt gedurende 24 uur in ^-dampen gehouden en wordt daarna beplakt met plastiekfolie. - Resultaat. Eerste vlek 20,2 cm 2 20,3 cm2 20,1 cm2 Gemiddeld : 20,2 cm2 Tweede vlek 20,4 cm 2 20,7 cm2 20,5 cm2 Gemiddeld : 20,5 cm2 - Besluit. De oppervlakten van deze 2 vlekken zijn bijna identisch. Dit verschil kan afkomstig zijn van de nauwkeurigheid van de mi— cropipetten bij het spotten, ofwel nog van de niet homogene achtergrond. Daar het moeilijk is om een homogene achter grond te verkrijgen, is het onmogelijk een homogeniteit van de vlekken te bekomen. - 33 - ALGEMEEN BESLUIT . In het onderzoek van een 5-tal fosfolipiden (phospha tidyl inositide, phosphatidyl ethanolamine, lysoleadthine, sphingomyelin, lecithine), gescheiden met dunnelaagchromatografie, worden de meest bevredigende resultaten verkregen onder de volgende voorwaarden : - Plaat : "Merck" plaat silicagel zuurbestendig. - Spot : oplossingen van 1,25 % of van 2,5 %• - Loopmiddel : mengsel van chloroform - methanol - water (65-25-4). Voor de ontwikkeling van de plaat dient het loopmid del verzadigd te zijn. - Revelatiemiddel : iodiumdampen gedurende ongeveer 30 mi nuten. - Plaat beplakken met kleefplastiek en daarna de vlekken dadelijk registreren aan de hand van een densitometer. - 34 - BIBLIOGRAFIE . (1) '.N. Hawthorne en G.B. Ansell, Phospholipids, metabolism and function, Vol. 3, biz. 1-9, 1964. (2 ) !. Stahl, Thin-Layer Chromatography, a laboratory Handbook, biz. 47-53, biz. 160-154, biz. 137-141, Springer Verlag, Berlin - Heidelberg - New York, 1965- (3) :. Randerath, Chromatography sur couches minces (in verta ling), biz. 5-86, blz^ 110-131, Gauthiers-Villars, Paris, 1964. (4) •G. Parsons en Stuart Patton, Two dimensional thin-layer chromatography of polar lipids from milk and mammary tissue. J. Lipid Research, Vol. 8, biz. 696, 1967. (5) . Vorstenburg en J.P.J. van Dalen, Chromatografie, Techni sche Hogeschool, Delft, Laboratorium voor Instrumentelé (6) analyse, onuitgegeven, biz. 64-70, blzv 159-161, 1969- • j .C. Dittmer en Robert L. Lester, A simple, specific spray* for the detection of phospholipids on T.L. Chromatogram!». Vol. 5, biz. 126, 1964. (7) O .S. Privett, M.L. Blank, D.W. Codding en E.C. Nickel., Lipid Analysis by quantitative Thin-Layer Chromat ograrphA Journal of the American Oil Chemists1, Society, Vol. 42, biz. 382-392, 1965. 2 F'S Ú F,, F., 3 íLAI e^L.r #—*r O N T W lK k E U N 6 S C U V B 7 M'Utn dd * ditn u hmiJ¿ Ftq . s. lW lkkE L IN GGSSCU C U VVET E T M E T GLEUVEN F,3 U GLAZEN O N TW IkkELIN n.cropip TLC Pensive nitertío del T L S Stage uitrusting F¿g 63. Fl j 62. Vár icord ti u.ltLpL¿crPhotcmeter^ (nooEL 250-A) [o O O o) tt-ß F ifU U R ? a.. Ph.ospha.t¿dyL ¿nos ¿tide Scheidin b. van ; ethanoioLfnine Cn...:.t/s°Le.c Ct h i n d. _ fhospfta-tcdvl 5pb t n j ö f n y e it n. M enosel n o J.;L Loopfr-oh. é ■:üt îttttîTt 1( 5U U R Cm...i o c L ti/m c L a .m p e n verband en heeveeLheicL ito/netn aa-rde y vuR l/t codium cLà-mpen^ verband, tussen hoeve?¿heioL ¿bof i en cien. si-Lome t e i sc he. tvaurcie. cm
© Copyright 2024 ExpyDoc
