Methanol-Fixierung

Immunofluoreszenz-Markierung an
kultivierten adhärenten Säugerzellen
– Methanol-Fixierung –
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Materialien
Pinzetten
Für das Handling der Zellen ist es empfehlenswert Pinzetten mit sehr feiner Spitze zu nutzen.
Hier bieten sich Dumont-Pinzette No 5 (gerade) oder Dumont-Pinzette No 7 (gebogen) an (Fig. 1).
Fig.1 Dumont-Pinzetten
„Feuchte Kammer“
Verschiedene Hersteller bieten feuchte Kammern an, welche meist sehr teuer (>50 €) sind.
Alternativ empfehlen wir große Glas-Petrischalen zu kaufen und diese mit einer Auflage für die
Deckgläschen (z.B. den Pipettenspitzenhalter aus einer Pipettenspitzenbox) zu versehen (Fig. 2).
Fig. 2 „Feuchte Kammer“
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Methanol, -20 °C ! GIFTIG !
Zur Fixierung sollte Methanol -20 °C eingefroren werden.
Primär-Antikörper
Als Primär-Antikörper eignet sich eine Reihe von Antikörpern. Zur Herstellung von Test-Proben
könnte man folgende Primar-Antikörper nutzen:
Nuclear Pore Complex (monoklonaler Maus-Antikörper): Anti-Nup153 (Abcam, ab24700)
Tubulin (monoklonaler Maus-Antikörper): Anti-α-Tubulin (SIGMA, T6074)
Sekundär-Antikörper
Farbstoff-gekoppelte Sekundär-Antikörper, je nach Anwendung.
Phosphat-Gepufferte Salzlösung (PBS, pH 7 – 7,5)
137 mM NaCl; 2.7 mM KCl; 10 mM Na2HPO4; 2 mM KH2PO4
Blockierungslösung
Zur Blockierung unspezifischer Bindestellen werden typischerweise Lösungen verwendet die
unterschiedliche Proteine enthalten, welche nicht mit den Antikörpern interferieren (Milchpulver,
Rinder Serum Albumin, Gelatine etc.).
Für die meisten Anwendungen ist folgende Lösung optimal:
PBS + 1% – 5% Rinderserum Albumin
Einbettmedium
Es gibt eine große Zahl unterschiedlicher Einbettmedien, welche auf die unterschiedlichen
Mikroskopie Techniken abgestimmt sind.
Für die STED Mikroskopie empfehlen wir folgende Einbett-Medien:
- Abberior Mount Liquid Antifade  für 3D STED
- Abberior Mount Solid Antifade  für 2D STED
- Mowiol/ DABCO  für 2D STED
- Prolong Antifade  für 2D STED
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Deckgläschen
Als Deckgläschen sollten Glas-Deckgläschen No 1,5 oder No 1,5H verwendet werden diese
passen mit einer Stärke von 170 µm am besten zu den Spezifizierungen der für Superresolution
Mikroskopie zu meist verwendeten Öl-Immersions-Objektive.
Von der Verwendung von Kunststoff-Deckgläschen/ -Probenkammern mit Kunststoffboden ist
abzuraten, da bei Verwendung dieser Deckgläschen oftmals nicht optimale Ergebnisse erzielt
werden.
Von der Verwendung von Deckgläschen mit Vertiefungen, Rastern, Grids etc. ist abzuraten, da
es bei der Mikroskopie mit diesen Deckgläschen zu Bildverzerrungen kommen kann und somit
oft nicht optimale Ergebnisse erzielt werden.
Objektträger
Die Objektträger sollten zum verwendeten Probenhalter passen. Super Frost Objektträger oder
ähnliche Objektträger sind nicht notwendig.
Pipetten
Kunststoff- oder Glas-Petrischalen
Zum Fixieren, Waschen etc.
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Durchführung
1. Kultivierung der Zellen
Die Zellen werden typischerweise 12 – 36 h vor der Färbung auf Deckgläschen ausgesät
(siehe Protokoll Zellkultivierung). (Bemerkung 1)
2.
3. Fixierung, Extraktion, Blockierung
Deckgläschen werden mit der Zellseite nach oben 5 min in Methanol/ abs. / -20 °C fixiert
(Bemerkung 2; 3; 4; 5). Danach werden die Deckgläschen mit PBS gewaschen (Bemerkung
6; 7; 8). Schließlich erfolgt die Blockierung von unspezifischen Bindestellen mit 2% BSA/
PBS für > 5 min bei RT (Bemerkung 9) in einer Petrischale (2x).
4. Inkubation mit erstem Antikörper
Deckgläschen werden aus der Petrischale genommen; überschüssiges BSA/ PBS wird
ablaufen gelassen. Deckgläschen wird anschließend in eine feuchte Kammer gelegt. Dann
wird das Deckgläschen mit 25 µl (für 12 mm Deckgläschen) verdünnter Antikörper-Lösung
(in PBS/ BSA) überschichtet (Bemerkung 10) und 1 h bei RT in der feuchten Kammer
inkubiert.
5. Waschen
Die Deckgläschen werden aus der feuchten Kammer genommen. Die Antikörper-Lösungen
werden seitlich auf ein Filterpapier ablaufen lassen. Anschließend werden die Deckgläschen
in eine frische Petrischale mit PBS gelegt (Bemerkung 8; 11). Inkubation für > 5 min bei RT
(2x).
6. Inkubation mit zweitem Antikörper
Deckgläschen werden aus der Petrischale genommen. Überschüssiges PBS wird ablaufen
gelassen. Deckgläschen wird anschließend in eine feuchte Kammer gelegt. Dann wird das
Deckgläschen mit 25 µl (für 12 mm Deckgläschen) verdünnter Antikörper-Lösung (in PBS/
BSA) überschichtet und 1 h bei RT in der feuchten Kammer inkubiert.
7. Waschen
Die Deckgläschen werden aus der feuchten Kammer genommen. Die Antikörper-Lösungen
werden seitlich auf ein Filterpapier ablaufen lassen. Anschließend werden die Deckgläschen
in eine frische Petrischale mit PBS gelegt (Bemerkung 8; 11; 12). Inkubation für 3x > 5 min
bei RT.
8. Einbettung, Lagerung, Stabilität
Schließlich wird das Deckgläschen aus der Petrischale genommen. Überschüssiges PBS
wird ablaufen gelassen. Die Deckgläschen werden in Einbettmedium ein gedeckelt.
Außerdem werden sie an zwei Stellen am Rand mit Nagellack befestigt. (Bemerkung 13)
Die Lagerung der fertigen Proben sollte bei 4 °C erfolgen. Eine große Zahl von Proben ist
nicht ‚dauerstabil‘. Daher sollten sie nicht länger als eine Woche verwendet werden.
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Bemerkungen
Die wichtigste Regel bei Antikörperfärbungen ist, dass die Zellen zu keinem Zeitpunkt
austrocknen dürfen.
1. Die Aussaat der Zellen kann auch früher erfolgen, falls es nicht anders möglich ist. Je nach
Wachstumsgeschwindigkeit, Dauer der Kultivierung und Zelldichte können die Zellen in
‚Mikrokolonien‘ wachsen. Sobald die Zellen konfluent sind, ist oftmals ein hoher Hintergrund
in den Zellen sichtbar.
2. Im angegebenen Protokoll werden die Deckgläschen im Gegensatz zu einer Vielzahl von
anderen Protokollen NICHT mit PBS gewaschen.
3. Es erfolgt KEINE Präextraktion o.ä..
4. Die Fixierung erfolgt in einem Überschuss an Fixativ (> 1 - 2 mL/ Deckgläschen).
5. Zur Fixierung können die Deckgläschen in eine ‚frische‘ Petrischale mit kaltem MeOH gelegt
werden. Alternativ kann die Fixierung auch in der Petrischale erfolgen in der die Zellen
gewachsen sind. Hierzu wird das Medium vollständig verworfen und die Zellen werden mit
Methanol überschichtet.
6. Zwischen Fixierung und Waschen mit PBS kann noch eine KURZE Extraktion in PBS/ 0,1%
Triton-X-100 erfolgen. Dies erleichtert später oftmals das Benetzen der Deckgläschen mit
den Antikörper-Lösungen.
7. Deckgläschen mit fixierten Zellen können auch eine gewisse Zeit ~1 - 2 Tage bei 4 °C Die in
PBS gelagert werden.
Die Qualität der Färbung könnte aber durch die Lagerung negativ beeinflusst werden.
8. Die PBS-Waschschritte sollten mit einem Überschuss an PBS erfolgen (> 1 - 2 mL/
Deckgläschen).
9. Die Blockierung sollte mit einem Überschuss an BSA/ PBS erfolgen (> 1 - 2 mL/
Deckgläschen).
10. Bei der Antikörper-Inkubation sollten die Deckgläschen nicht mit der Zellseite nach unten
auf Parafilm o.ä. gelegt werden. Dies reduziert zwar die notwendigen Antikörper-Mengen –
jedoch können die Zellen beim Abziehen vom Parafilm beschädigt werden.
11. Nach den Antikörper-Inkubationen sollte die Deckgläschen in unterschiedlichen Petrischalen
gewaschen werden, da sonst Kreuzkontaminationen erfolgen könnten.
12. Falls der Hintergrund einer Färbung zu hoch ist kann dieser am Ende der Färbung noch
durch Inkubation mit PBS/Triton-X-100 oder PBS/BSA reduziert werden.
13. Falls ein Einbett-Medium verwendet werden soll, dass nicht aushärtet, muss das
Deckgläschen vollständig mit Nagellack oder Twinsil umrandet werden.
Bei der Verwendung von TDE als Einbett-Medium kann Twinsil nicht verwendet werden.
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Referenzen
Wurm, C. A., D. Neumann, R. Schmidt, A. Egner, S. Jakobs: "Sample Preparation for
STED Microscopy" Methods Mol. Biol. 591, 185 – 199

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