CINETIQUE ENZYMATIQUE PAR OXYMETRIE : vi=f (pH) SE La glucose-oxydase (GOD) catalyse l’oxydation du glucose (substrat) en le transformant en gluconolactone (produit) selon la réaction enzymatique ci-dessous : GOD GLUCONOLACTONE + PEROXYDE D’HYDROGENE (le gluconolactone se transforme spontanément en acide gluconique) GLUCOSE + O2 + H2O C6H12O6 + O2 + H2O GOD C6H12O7 + H2O2 Il s’agit d’étudier l’influence du pH sur l’activité enzymatique par le dosage indirect du substrat (glucose) en mesurant la disparition du dioxygène, grâce à une sonde adaptée PROTOCOLE PRODUITS ET MATERIEL PRODUITS : SUBSTRAT Préparer une solution de glucose à -1 20g.L à différents pH : pH=2.6 /pH=7 /pH=9.6* ENZYME Glucose-oxydase : dissoudre une pointe de spatule de GOD dans 5ml de chaque solution tampon respective* (A préparer au moment du TP.) MANIPULATION. LOGICIEL : ATELIER SCIENTIFIQUE (version 2.3) PARAMETRAGE DE L’ORDINATEUR………………………… EAU DISTILLEE MATERIEL SONDE DIOXYGENE Choisir « ENZYMOLOGIE » dans « Atelier scientifique » Enceinte du bioréacteur Cliquer sur l’onglet « concentration en O2 » bioréacteur BIOREACTEUR Choisir le paramètre étudié : « variation pH » Cocher les grandeurs à mesurer Entrer au clavier la valeur de la concentration de la 1ère dilution et son unité devient actif La courbe d’apparition du produit est calculée à partir de la précédente. Ce calcul doit tenir compte des coefficients stœchiométriques de la réaction étudiée REGULATEUR DE VITESSE Le rapport Produit/Substrat est ici égal à 1 Le coefficient stœchiométrique est paramétré par défaut à 1. Il n’y a pas de modification à apporter (dans le cas contraire, cliquer sur pour modifier le coefficient) Consommation : Affiche la disparition du substrat en fonction du temps. Production : Affiche l’apparition du produit en fonction du temps. DEROULEMENT DE LA CINETIQUE………………………… T.A.E + portoir Pipette de 5 ml et propipette Micropipette + cônes ou microseringue Tube à hémolyse pour l’enzyme Matériel expérimental assisté par ordinateur adapté: Sonde à dioxygène/ bioréacteur/logiciel d’enzymologie *voir notes de fin Introduire 5ml de solution glucosée dans l’enceinte du bioréacteur Mettre sous agitation Attendre quelques secondes (homogénéisation du milieu) Introduire la sonde oxymétrique dans le bioréacteur Lancer l’acquisition Après 1 minute, injecter 200µl de GOD avec la microseringue ou micropipette/ insérer un repère en cliquant sur Recommencer de la même façon pour chaque dilution (commencer par la dilution la plus faible, ce qui évite de rincer la pipette entre chaque manipulation) Enregistrer les données acquises (fichier / enregistrer sous) A chaque nouvelle acquisition, entrer la nouvelle valeur du paramètre étudié dans le menu « paramètre » CONSTRUIRE UNE COURBE PARAMETRIQUE COURBE PARAMETRIQUE : vi = f[S] vi (vitesse initiale) = pente de la courbe où la pente est maximum Sélectionner, dans le tableau, la première ligne avec un clic gauche La ligne sélectionnée affiche la couleur correspondant à la courbe sur le graphique Déplacer la souris dans la fenêtre graphique Le curseur de la souris change d’aspect : l’outil "droite" est activé Tout en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé, positionner le curseur sur la portion de la droite où la pente est maximale Sans lâcher le clic gauche, valider la droite en appuyant sur entrée La valeur de la vitesse initiale correspondante (pente de la droite) s’affiche à droite dans le tableau Recommencer l’opération pour chacune des courbes (commencer par la [S] la plus faible, ce qui évite de rincer la pipette entre chaque manipulation) devient actif Cliquer sur ce bouton pour obtenir la courbe vi=f[S] RESULTATS Représentation graphique Courbe paramétrique NOTES La GOD, comme toutes les enzymes, doit être stockée au froid. Les solutions de glucose peuvent être préparées la veille et conservées au réfrigérateur *préparation des solutions tampon : SOLUTIONS TAMPON Tampon citrate pH 2.6 Tampon phosphate 7 Tampon borate 9.6 PRODUITS 1 Na2HPO4 (anhydre à 71.01 g.L- ) -1 C6H7O8 (ac. citrique à 105.06 g.L ) -1 Na2HPO4 (anhydre à 9.47 g.L ) -1 KH2PO4 (à 9.08 g.L ) -1 -1 H3BO3 (12.41 g.L )+ KCl(14.91 g.L ) -1 NaOH ( à 8 g.L ) QUANTITE 8.72ml 35.64ml 122ml 78ml 50ml 36.85ml Eau distillée + QSP 200ml Volume total 200ml 200ml + QSP 200ml 200ml
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