Biología del pez cebra y su uso en la investigación

Biología del pez cebra y su uso en la
investigación
Paola Lepanto
LGMH- LBDN
Instutit Pasteur de Montevideo
Reino :
Animalia
Filo :
Chordata
Subfilo:
Vertebrata
Clase:
Actinopterygii
Infraclase:
Teleostei
Orden
Cypriniformes
Family: cyprinidae
Danio rerio
Características
• Adultos miden 2 – 5 cm
• Ovíparos (fecundación y desarrollo externo)
• Centenas de huevos y embriones por día
• Crecimiento rápido (3 meses hasta alcanzar madurez sexual)
• Omnívoros (zooplancton e insectos)
• Reproducción anual, previo al monzón (alta temperatura y disponibilidad de
comida)
• embriones ~ 0,7mm,
• activación por contacto con el agua
• 72hpf: se infla vejiga natatoria
• nado, alimentación, huida
Machos
– Forma de torpedo
– Aletas anal y caudal con tintes amarillos
Hembras
– Generalmente abdomen más redondeado
– Menor variación de color
– Es más grande en comparación
George Streisinger
1970
¿Porqué usar Zb como modelo de laboratorio?
• vertebrado relativamente simple (reducción filogenética)
• fácil de mantener y bajo costo
• cada hembra produce >200 huevos
• fecundación externa y desarrollo rápido
• embriones transparentes
• genoma secuenciado
 Secuenciación completa del genoma
Genoma duplicado
 Generación de mutantes y knock-down (morfolinos)
 Expresión transitoria y transgénicos (ARN, ADN,
marcadores lipofílicos)
 Transplante de blastómeras
 Observación de embriones in vivo y fijados
Falta de anticuerpos
 Bases de datos abierta: ZFIN
 Repositorio de líneas y anticuerpos: ZIRC
¿ En que tipo de proyectos se utiliza ?
Biología del desarrollo y genética
Medicina regenerativa
Oncología comparada
Genómica comparada
Toxicología (ambiental & fármacos)
Modelo para diversas patología humanas
Estudios de conducta
Laboratorio Zebrafish
2011…
Unidad de Animales Transgénicos - IPMon
Colaboración Fcien - IPMon
• Condiciones estandarizadas
• % de agua se recambia a diario automáticamente (10%)
• Monitoreo y suplemento para calidad de agua permanentes
• Filtrado mecánico, biológico, químico y esterilizado
Calidad del agua
Procedencia
• Sistema de osmosis inversa
Oxigenación y Temperatura
• 28°C (25-31ºC)
• Oxigenador (si T↑, %O2↓)
PH y Conductividad
• pH: 7,5
• Conductividad entre 400 -700 µS (reproducción: máx 500 µS)
NH₃/NH₄ 0 mg/ml
NH₂ 0 mg/ml
NH₃ <25 mg/ml
Biofiltro (nitrosomas,nitrobacter)
Al sobrepasar estos limites señales de estrés son detectados en los animales,
su reproducción y desarrollo se ven comprometido y los animales se tornan
mas vulnerables a infecciones
Densidad de población
 Pez social, vive en grupos, sufre estrés si es mantenido en solitario
 Densidad depende de la calidad del agua y la eficiencia del sistema de filtrado
Jóvenes:
o 5-14 días: 25/L
o 14-30 días: 12/L
Adultos:
o Racks: 6-10/L
Luminosidad
 La luminosidad influencia la mayor parte de los procesos biológicos
y comportamentales de los peces; crecimiento, desarrollo y
reproducción
 Ciclo 14/10 (hábitat natural)
 Deben evitarse alteraciones de luminosidad brusca y exceso de
estímulo visual
 Luminosidad también puede afectar otros organismos del acuario
(algas)
 La postura de huevos ocurre conforme a la hora del día (primeros
minutos de luz)
Registros de parámetros de
mantenimiento
Alimentación
 Ración comercial de buena calidad y complementos
nutritivos y proteicos (daphnias, artemias, drosófilas)
 Larvas:
- hasta el 6º día: c/vitelo
- 5º día: paramecios + ración bb
- 13º día: paramecio/artemias + ración bb
- 30º: ración comercial adultos + ración bb
 Frecuencia: 3 veces por día
( ración seca + artemia)
Sistemas de reproducción
Cruzas
• feromonas macho → ovulación
• feromonas de la hembra →
apareamiento
• machos son esenciales para el desove
• ocurre en las primeras horas de luz
•
•
•
•
Dar de comer mas temprano y colocar en
individuales con o sin división machos y
hembras
9 am del próximo día se prende luz y se
retira división
Se dejan 40 min (1 ½ por seguridad)
Los huevos caen al fondo del acuario, se
devuelven adultos a la pecera
día 0
día 1
250μm
día 3
250μm
500 μm
Mantenimiento de líneas
 Se colocan hasta 50 por placa de 10cm
de diámetro
 Desinfección: entre epibolia y 28hpf, con
hipoclorito
 Decorionar 72 hrs después de la cruza
 Incubación a 28.5°C hasta 5dpf
 Incorporación al rack a los 9dpf (6dpf15dpf período crítico – calidad del agua y
alimentación)
Manipulación
 Manejo por personal entrenado, monitoreando percepciones de
estrés o enfermedad siempre que sea posible
fisiología
comportamiento
• cortisol, adrenalina, noradrenalina
• movimiento excesivo de operculos
• ↑ glucosa, electrolitos, tiempo de
coagulación, recuento de leucocitos
• movimiento excesivo o falta de
movimiento
• reducción crecimiento,
reproducción, resistencia a
enfermedades, sobrevida
• cambio de color
• se esconde
Manipulación
• Manipular a través de redes adecuadas para el tamaño del animal
• Mantener el animal en gasa humedecida y no mas de 30 segundo afuera
del agua
• Todas las rutas de administración de sustancias para mamíferos son
válidas para peces (i/v, i/m, ip, vo)
• La vía mas usada es la de inmersión del animal en la concentración
deseada de fármaco – análogo a inhalación en animales terrestres
• Para inyecciones en embriones y larvas se inmovilizan en agar y se
utilizan microjeringas asociadas a micromanipuladores
Anestésicos
• Inmersión: Tricaina metanosulfato (MS222), Quinaldina, 2-fenoxietanol,
barbitúricos, Imidazole , benzocaína y lidocaína
• Inyección IM: Ketamina, agonistas alfa-2, propofol. Menos frecuentes
barbitúricos y benzodiacepinas
• Crioanestesia: enfriamiento intenso
Analgesia
• Opioides y antiinflamatorios no esteroideos
• Con restricciones: crioanalgesia o electroanestesia
• Son los probados al momento (Stoskopf M, Posner LP, 2008)
Eutanasia
 Sobredosis de barbitúricos, anestésicos inhalables, CO2 , MS222 (tricaína 200300 mg7ml), benzocaína, fenoxietanol (al menos 10 minutos de inmersión)
 Inmovilización por inmersión en agua helada seguida de concusión o
decapitación
 Crioeutanasia : anestesia (MS222 168mg/ml) seguido de rápida inmersión en
nitrógeno liquido
Actualmente
• Caracterización del rol biológico de proteínas asociadas con la ciliopatía
Bardet-Biedl - IPMon- Dr. J. Badano, Dra. V. Prieto, Dra. M. Cardenas, Mag. R.
Novas
• Aspectos Moleculares de la Polaridad Neuroepitelial - Rol de las cilias a nivel
neuronal – IPMON - Dr. J. Badano, FCien-IPMon - Dr. F. Zolessi, Lic. G. Aparicio, C.
Davison, Mag. P. Lepanto
• Estudio del patrón de expresión y efecto de la pérdida de función de hig1 (hypoxia-induced gene 1) en el desarrollo del pez cebra - FCien – I. sosa, Dr. F.
Zolessi, Dra. G. Bedo
• Screening de toxicidad de nuevas drogas en embriones de zebrafish - FCien – E.
Cruces, Dr. G. Alvarez, Dr. F. Zolessi, Dr. H. Cerecetto, Dra. M. Gonzáles
Referencias:
• Spence et al. The behaviour and ecology of the zebrafish, Danio rerio.
Biol. Rev. (2008) 83:13-34
• Grunwald & Eisen. Headwaters of the zebrafish – emergence of a new
model vertebrate. Nat. Rev. Gen. (2002) 3:717-724
• Matthews & Varga. Anesthesia and Euthanasia in Zebrafish. ILAR J. (2012)
53:192-204
• Nusslein-Volhard & Dahm. Zebrafish - Practical Approach. 2002

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