Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés « Traitements des enzymes industrielles » Concepteur du cours: Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Attention ! Ce produit pédagogique numérisé est la propriété exclusive de l'UVT. Il est strictement interdit de le reproduire à des fins commerciales. Seul le téléchargement ou impression pour un usage personnel (1 copie par utilisateur) est permis. Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés Traitements des enzymes industrielles 1. Extraction d’enzymes et traitements possibles ☺ Le degré de pureté d’une enzyme commercialisée varie des préparations enzymatiques jusqu’aux enzymes hautement purifiées, et ce selon l’application envisagée. La matière première pour l’extraction/purification peut être un organe animal, un matériel végétal ou des microorganismes. Le passage d’un procédé d’extraction/purification de l’échelle de laboratoire à l’échelle industrielle doit tenir compte des contraintes économiques et de l’aspect technologique. Lorsque l’enzyme est extracellulaire, elle est généralement libérée dans le milieu avec un petit nombre d’autres molécules. Il suffit donc de séparer le milieu des cellules pour obtenir un extrait enzymatique brut. 2 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés Traitements des enzymes industrielles 1.1. Extraction des enzymes Dans le cas des enzymes animales ou végétales, ou encore les enzymes intracellulaires des microorganismes, une opération supplémentaire est au moins nécessaire pour rompre les barrières cellulaires. Le choix de la procédure d’extraction dépend de la localisation de l’enzyme : Méthodes mécaniques : - Extraction d’enzymes par haute pression suivie de dépression (Frenchpress), - Broyage ou écrasement (éventuellement en présence de billes), - Ultrasons ; à des fréquences déterminées, des trous au niveau de la membrane laissent sortir des protéines. Méthodes non-mécaniques : - Séchage ou traitement par congélation-décongélation pour la destruction des barrières, - Lyse physique des barrières cellulaires par choc osmotique, - Lyse chimique par l’emploi de détergent, - Lyse enzymatique (exemple : lysozyme) : méthode de laboratoire. 1.2. Séparation des enzymes d’une part, des cellules et débris cellulaires d’autre part L’étape suivante consiste à éloigner les solides pour obtenir une préparation enzymatique brute. Cette opération est difficile lorsque la densité des cellules bactériennes de petite taille est proche de la densité du milieu de fermentation. Les méthodes suivantes sont utilisées : o Décantation adaptée aux cellules de grande taille comme les levures, o Filtration continue, largement utilisée en industrie, o Des centrifugeuses continues sont de plus en plus utilisées. 3 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés Traitements des enzymes industrielles 2. concentration et purification d’enzymes ☺ 2.1. Opération de concentration Puisque les enzymes dans les extraits sont souvent insuffisamment concentrées, le volume doit être réduit par concentration. Les méthodes de concentration ne doivent pas altérer l’activité enzymatique. Méthodes utilisées : o Méthodes thermiques, comme la « thin-layer evaporator » : méthodes douces à cause de la thermolabilité des enzymes. o Précipitation aux sels, comme le sulfate d’ammonium entre 20 et 80%. Le sel à forte concentration agit sur les molécules entourant la protéine et change les forces électrostatiques assurant leur solubilité. Plus le sel est concentré plus il cause la précipitation des petites protéines. On peut donc procéder à une précipitation fractionnée. Cette méthode a l’inconvénient d’encourager la corrosion du matériel et de nécessiter un traitement des eaux avant leur rejet. o Précipitation aux solvants organiques comme l’éthanol ou l’acétone. Les solvants affaiblissent la liaison entre l’eau et la protéine et encouragent donc les liaisons entre protéines qui agglomèrent et précipitent. Les solvants présentent cependant une source de toxicité. 4 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés Traitements des enzymes industrielles o Précipitation aux polymères comme les polyéthylenimines et les polyéthylène glycols entre 15 et 20%. o Précipitation au point isoélectrique. La solubilité d’une protéine est minimale au pH où leur charge nette est nulle. o Ultrafiltration utilisant une membrane semi-perméable laissant passer des molécules inférieures à une certaine taille. Les membranes disponibles ont des pores qui laissent passer des molécules de 1000 à 300 000 Da. 2.2. Purification des enzymes Dans certains domaines comme celui médical ou analytique, les enzymes doivent être hautement purifiées. Dans d’autres domaines industriels les enzymes peuvent être partiellement purifiées. Méthode de cristallisation ; c’est la formation de particules solides de l’enzyme de forme et taille définies, sous certaines conditions du milieu qui favorisent les intéractions protéine-protéine. La cristallisation d’enzymes sert plus pour les analyses par diffraction aux rayons X plutôt qu’un procédé de purification. On note cependant la commercialisation de certaines enzymes sous forme cristallisée comme des cellulases ou alcool-oxydase. Electrophorèse ; utilisée pour isoler des enzymes pures à l’échelle de laboratoire. Les méthodes utilisées sont de type électrophorèse zonale, isotachophorèse ou gradient de porosité. Le Scale-up de l’électrophorèse est limité par le chauffage généré par le procédé et l’interférence causée par la convection. La chromatographie est d’une importance fondamentale dans la purification d’enzymes : 5 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Génie de la biocatalyse et génie des procédés Université Virtuelle de Tunis Traitements des enzymes industrielles Méthodes chromatographiques Type de chromatographie principe Séparation suivant : adsorption Liaison à la surface Affinité de surface distribution équilibre de distribution polarité échange d’ions liaison ionique Charge Filtration sur gel Diffusion dans les pores Taille et forme moléculaires Affinité Adsorption spécifique Structure moléculaire Hydrophobe Interactions hydrophobes Structure moléculaire Covalente Liaison covalente polarité Milieux de gel filtration commercialisés (exemples) Nom commercial (fabricant) Matrice Domaine de fractionnement (MM) Biogel (Biorad) Polyacrylamide (P-type) 100-400000 Agarose (A-type) 1000-150 106 Ultrogel (LKB) Agarose 25000-20 106 Sephadex (Pharmacia) Dextran 50-600000 Sepharose (Pharmacia) Agarose 10000-40 106 6 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Génie de la biocatalyse et génie des procédés Université Virtuelle de Tunis Traitements des enzymes industrielles (A) (B) Schémas de procédures de purification d’enzymes par : (A) : chromatographie d’affinité, (B) : chromatographie convalente. 3. Formulation et suivi de la pureté ☺ 3.1. Forme de commercialisation Les.enzymes sont commercialisées sous forme de concentré liquide stabilisé ou de solide (poudre ou particules). La formule de la préparation enzymatique comporte différents éléments à objectifs différents : Stabilisation : la formulation a comme première tâche de minimiser la perte d’activité enzymatique durant le transport, le stockage et l’utilisation. 7 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés Traitements des enzymes industrielles o Certains producteurs d’enzymes ajoutent à l’enzyme séchée un sucre, un alcool polyhydrique ou bien des sels pour s’associer avec l’eau qui hydrate la surface de la protéine et rendre ainsi la protéine plus rigide donc plus stable. o Le meilleur moyen de combattre l’inactivation du site actif est d’ajouter à la formule un cofacteur ou un inhibiteur réversible qui s’associent au site actif et limitent sa transformation essentiellement par oxydation. Préservation contre la contamination microbienne. Eviter la précipitation Minimiser la formation de poussière. Optimisation de critères esthétiques. Une standardisation du produit industriel est nécessaire pour garder la même qualité d’une même préparation enzymatique. 3.2. Mesure de l’activité enzymatique Activité (A) : nombre de moles de substrat transformé (ou de produit apparu) par unité de temps. Unité internationale (UI) : quantité d’enzyme susceptible de transformer 1 micromole de substrat par minute ( mole min-1). Activité spécifique (AS) : nombre de micromoles de substrat transformé par minute, par mg de protéine (UI mg-1). La cinétique enzymatique peut être suivie par des méthodes de détection optiques, électrochimiques ou radio-actives. La quantité en protéines est déterminée essentiellement par des méthodes spectrophotométriques. Facteur de purification : ASaprès/ASavant purification Rendement de purification : Aaprès/Aavant purification x 100. 8 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés Traitements des enzymes industrielles Nous pouvons analyser ce tableau en vérifiant les différents calculs. UVT | Cours | ENT | Médiathèque | Bourse virtuelle |C2i |Sites de l'UVT 9 Prof. Dr. Mohamed GARGOURI
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