Aus der Medizinischen Universitätsklinik Abteilung Innere Medizin III
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
Die Entwicklung einer neuen Strategie zur Herstellung von Antikörpern
gegen konformationsspezifische Epitope
des Leukozyten-Integrins Mac-1 (CD11b/CD18; !M"2)
mittels Einzelketten-Phagen-Display-Technologie:
Neue Möglichkeiten des funktionsspezifischen Monotorings
und der Blockade der Leukozytenfunktion
INAUGURAL – DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2005
von
Steffen Ulrich Eisenhardt
geboren in Lich
Dekan: Prof. Dr. med. Ch. Peters
1. Gutachter: Prof. Dr. med. K. Peter
2. Gutachter: Prof. Dr. med. G. B. Stark
Jahr der Promotion: 2007
INHALTSVERZEICHNIS
3
ABKÜRZUNGEN ....................................................................................................... 8
1
EINLEITUNG..................................................................................................... 11
1.1
Adhäsionsmoleküle..................................................................................................... 11
1.1.1 Einteilung ................................................................................................................. 11
1.1.2
Selektine ................................................................................................................... 11
1.1.3
Immunglobulin-Superfamilie (Ig-Superfamilie) ...................................................... 12
1.1.4
Integrine ................................................................................................................... 12
1.1.5
Adhäsionsmoleküle und Atherosklerose.................................................................. 15
1.1.6
PTCA und die Rolle von Adhäsionsmolekülen bei der Restenose .......................... 16
1.2
Das Integrin Mac-1 (CD11b/CD18, !M"#) ............................................................... 18
1.2.1 Funktion ................................................................................................................... 18
1.2.2
Struktur..................................................................................................................... 20
1.2.3
Die I-Domäne........................................................................................................... 21
1.3
Antikörper................................................................................................................... 23
1.3.1 Struktur..................................................................................................................... 23
2
1.3.2
Rekombinante Antikörper ........................................................................................ 25
1.3.3
Antikörper in Diagnostik und Therapie ................................................................... 27
1.3.4
Selektion von Antikörpern mittels Phagendisplay ................................................... 27
1.3.5
Fragestellung ............................................................................................................ 28
MATERIALIEN.................................................................................................. 30
2.1. Materialien der gentechnischen Arbeiten ..................................................................... 30
2.1.1 Kultivierung von E.coli in Medium ......................................................................... 30
2.1.2
Kultivierung von E.coli auf Agar............................................................................. 30
2.1.3
Glycerolstocks.......................................................................................................... 30
2.1.4
Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli .................................................................... 31
2.1.5
Agarose-Gel-Elektrophorese.................................................................................... 31
2.1.6
DNA-Restriktion ...................................................................................................... 31
2.1.7
Gelelution von DNA-Fragmenten............................................................................ 32
2.1.8
DNA-Konzentrationsbestimmung............................................................................ 32
2.1.9
Dephosphorylierung ................................................................................................. 32
2.1.10
DNA-Ligation ...................................................................................................... 32
INHALTSVERZEICHNIS
4
2.1.11
Herstellung von Hitzeschock-kompetenten E.coli ............................................... 32
2.1.12
DNA-Transformation und Selektion eines Plasmid-positiven Klons .................. 33
2.1.13
Polymerase-Chain-Reaction (PCR)...................................................................... 33
2.1.14
Herstellung einer natürlichen Phagenbibliothek .................................................. 33
2.1.15
Phage-display durch oberflächenverankerte ScFv auf filamentösen Phagen....... 33
2.1.16
Panning................................................................................................................. 34
2.1.17
Screening der amplifizierten Klone/BSTN1-Verdau ........................................... 34
2.1.18
Kultur der Zellen .................................................................................................. 34
2.1.19
Einfrieren von Zellen ........................................................................................... 35
2.2
Materialien der proteinbiochemischen Arbeiten .................................................... 36
2.2.1 Induktion der Proteinexpression............................................................................... 36
2.2.2
Protein-Isolation ....................................................................................................... 36
2.2.3
Protein-Aufreinigung durch Ni 2+-Affinitätschromatographie ................................. 36
2.2.4
Dialyse...................................................................................................................... 37
2.2.5
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................ 37
2.2.6
Coomassie-Färbung und Silberfärbung von SDS-PAGE-Gelen.............................. 38
2.2.7
Western-Blot ............................................................................................................ 38
2.2.8
Immunfärbung der geblotteten Proteine................................................................... 39
2.2.9
Protein-Konzentrations-Bestimmung....................................................................... 39
2.3
Materialien der funktionellen Testung..................................................................... 40
2.3.1 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) .................................................. 40
3
2.3.2
Blutentnahme ........................................................................................................... 40
2.3.3
Isolierung von Monozyten aus Vollblut................................................................... 41
2.3.4
FACSanalysen.......................................................................................................... 41
2.3.5
Messungen mit dem Durchflußzytometer (FACS) .................................................. 41
2.3.6
Zelladhäsion auf immobilisiertem Fibrinogen oder Heparin ................................... 42
2.3.7
Immunpräzipitation .................................................................................................. 42
METHODIK ....................................................................................................... 43
3.1
Methoden der gentechnischen Arbeiten................................................................... 43
3.1.1 Kultivierung von E.coli in Medium ......................................................................... 43
3.1.2
Kultivierung von E.coli auf Agar............................................................................. 43
3.1.3
Glycerolstocks.......................................................................................................... 43
3.1.4
Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli .................................................................... 44
INHALTSVERZEICHNIS
5
3.1.5
Agarose-Gel-Elektrophorese.................................................................................... 44
3.1.6
DNA-Restriktion ...................................................................................................... 44
3.1.7
Gelelution von DNA-Fragmenten............................................................................ 45
3.1.8
DNA-Konzentrationsbestimmung............................................................................ 46
3.1.9
Dephosphorylierung ................................................................................................. 46
3.1.10
DNA-Ligation ...................................................................................................... 47
3.1.11
Herstellung von Hitzeschock-kompetenten E.coli ............................................... 47
3.1.12
Bakterien-Transformation und Selektion eines Plasmid-positiven Klons ........... 47
3.1.13
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction).................... 48
3.1.14
Herstellung einer natürlichen Phagen-Bibliothek ................................................ 50
3.1.15
Phage-display durch oberflächenverankerte ScFv auf filamentösen Phagen....... 51
3.1.16
Panning................................................................................................................. 52
3.1.17
Screening der amplifizierten Klone/BSTN1-Verdau ........................................... 55
3.1.18
Kultur der Zellen .................................................................................................. 56
3.1.19
Einfrieren von Zellen ........................................................................................... 56
3.2
Methoden der proteinbiochemischen Arbeiten ....................................................... 57
3.2.1 Induktion der Proteinexpression............................................................................... 57
3.2.2
Protein-Isolation ....................................................................................................... 57
3.2.3
Protein-Aufreinigung durch Ni 2+ -Affinitätschromatographie................................ 58
3.2.4
Dialyse...................................................................................................................... 60
3.2.5
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................ 60
3.2.6
Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen............................................... 61
3.2.7
Western-Blot ............................................................................................................ 61
3.2.8
Immunfärbung geblotteter Proteine ......................................................................... 62
3.2.9
Protein-Konzentrations-Bestimmung....................................................................... 63
3.3
Methoden der funktionellen Testung ....................................................................... 64
3.3.1 ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) .................................................. 64
3.3.2
Blutentnahme ........................................................................................................... 65
3.3.3
Isolierung von Monozyten aus Vollblut................................................................... 65
3.3.4
FACS-Analysen ....................................................................................................... 66
3.3.5
Messungen mit dem Durchflusszytometer (FACS) ................................................. 75
3.3.6
Zelladhäsion auf immobilisiertem Fibrinogen oder Heparin ................................... 78
3.3.7
Immunpräzipitation .................................................................................................. 79
INHALTSVERZEICHNIS
4
6
ERGEBNISSE................................................................................................... 80
4.1
Ergebnisse der Antikörperselektion ......................................................................... 80
4.1.1 Panningstrategie ....................................................................................................... 80
4.1.2
Screening der Klone durch BSTN1-Verdau............................................................. 82
4.1.3
Sequenzen der CDR3 Region der amplifizierten Klone .......................................... 83
4.2
Umklonierung und Aufreinigung der angereicherten Klone................................. 84
4.3
FACSanalysen der selektionierten Antikörper ....................................................... 87
4.3.1 Bindung der selektionierten Klons MAN-1 auf CHO-Zellen .................................. 87
4.3.2
Bindung des MAN-1 Antikörpers an Monozyten im Vollblut ................................ 88
4.3.3
Bindung der MAS Antikörper an Monozyten im Vollblut ...................................... 90
4.3.4
Bindung des MAN-1 Antikörpers an Granulozyten im Vollblut............................. 92
4.3.5
Antikörpertitration.................................................................................................... 92
4.3.6
Inhibition des ScFv-Antikörpers .............................................................................. 93
4.3.7
Nachweis der Metallionenabhängigkeit der Bindung .............................................. 95
4.4
I-Domänen-ELISA ..................................................................................................... 95
4.5
Funktionelle Testung mittels Adhäsionsassays........................................................ 96
4.6
Paratopmapping ......................................................................................................... 98
4.6.1 Erzeugung von CDR3-Mutationen........................................................................... 98
4.6.2
4.7
5
FACSanalyse der CDR3-Mutationen....................................................................... 99
Immunpräzipitation ................................................................................................. 100
DISKUSSION .................................................................................................. 102
5.1
Selektionsstrategie.................................................................................................... 102
5.2
Funktionelle Charakterisierung.............................................................................. 103
5.2.1 FACSanalyse und I-Domänen ELISA ................................................................... 103
5.2.2
Adhäsionsversuche................................................................................................. 105
5.3
Paratopmapping ....................................................................................................... 106
5.4
Immunpräzipitation ................................................................................................. 107
5.5
Neue Aussichten für Diagnostik und Therapie...................................................... 108
6
ZUSAMMENFASSUNG .................................................................................. 111
INHALTSVERZEICHNIS
7
7
LITERATUR .................................................................................................... 112
8
DANKSAGUNG .............................................................................................. 119
9
LEBENSLAUF ................................................................................................ 120
8
ABKÜRZUNGEN
Abkürzungen
Abb.
Abbildung
BSA
Rinderserumalbumin (bovine serum albumine)
CHO
immortale Epithelzelllinie, die aus einer Ovarienkultur
des Hamsters hervorgegangen ist (chinese hamster
ovary)
DMEM
Nährlösung der CHO-Zellen (Dulbecco’s modified
Eagle’s medium)
DMSO
Dimethylsulfoxid
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGF
endothelialer Wachstumsfaktor (endothelial growth
factor)
ELAM-1
endotheliales Leukozyten-Adhäsionsmolekül-1
ELISA
Enzym-gekoppeltes Immunosorbent Verfahren
(enzyme-linked immunosorbent assay)
ESL-1
E-Selektin Ligand-1
FACS
Fluorescence Activated Cell Scan Durchflußzytometer
Fc
kristallines Fragment eines Antikörpers
FITC
Fluorescein-5-isothiocyanat
FKS
fötales Kälberserum
FSC
Forwardscatter, Vorwärtsstreulicht im FACS, Maß für
Zellgröße
g
Erdbeschleunigung
GPIIb/IIIa
Glycoprotein IIb/IIIa
h
Stunde (hour)
ICAM
interzelluläres Adhäsionsmolekül (intercellular
adhesion molecule)
IDP
I-Domänen Peptid
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
Ig-Superfamilie
Immunglobulin-Superfamilie
IL
Interleukin
LAM-1
leukozytäres Adhäsionsmolekül-1
9
ABKÜRZUNGEN
LB
Luria-Bertani
LDL
Lipoproteine geringer Dichte (low density lipoproteins)
LFA-1
Oberflächenrezeptor der Integrinfamilie (leukocyte
function associated antigen-1)
LPS
Lipopolysaccharid
mAb
monoclonal Antibody, monoklonaler Antikörper
MAN-1
Mac-1
Activationspecific
Antibody
Natural:
aktivationsspezifisches Antikörperfragment aus einer
natürlichen Phagenbibliothek
MAS-1
Mac-1
Activationspecific
Antibody
Synthetic:
aktivationsspezifisches Antikörperfragment aus einer
synthetischen Phagenbibliothek
MCP-1
chemotaktisches Monozytenprotein-1 (monocyte
chemotactic protein-1)
MCS
Klonierungsabschnitt eines Vektor (multiple cloning
side)
NEAA
Nicht-essentielle Aminosäuren (non essential aminoacids)
NF-$B
nucleärer Faktor $B
NK
natürliche Killerzelle
p
Wahrscheinlichkeit (probability)
PBS
Phosphat Buffered Saline, Pufferlösung (pH=7,4)
PE
Phycoerythrine, Fluoreszenzfarbstoff.
PECAM
Plättchen / Endothel-Zelladhäsionsmolekül-1 (platelet /
endothelial cell adhesion molecule-1)
Pen / Strep
Penicillin / Streptomycin
PMA
Phorbol Myristate Acetate, Protein C Kinase Aktivator
zur Leukozytenstimulation
PMN
polymorph-nucleäre Zelle
PSGL-1
P-Selektin Glycoprotein Ligand-1
PTCA
Percutaneous
Transluminal
Coronar
Angioplasty,
Aufdehnung von Engstellen der Koronararterien mit
einem Ballonkatheter
rpm
Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)
10
ABKÜRZUNGEN
RT
Raumtemperatur
SDS
Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
sLe x
sialysierte Lewissäure
SSC
Sidewardscatter, Seitwärtsstreulicht im FACS, Maß für
die Zellgranularität
TAE
Tris-Acetat-EDTA
TNF
Tumor-Nekrose-Faktor
Tris
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
u
Einheit für die spez. Enzymaktivität (unit)
V
Volt
VCAM-1
vaskuläres Adhäsionsmolekül-1 (vascular cell
adhesion molecule-1)
VLA-4
Oberflächenrezeptor der Integrinfamilie (very late
antigen-4)
vWF
von Willebrand-Faktor
EINLEITUNG
11
1 Einleitung
Zielsetzung der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung einer neuen Strategie für
Einzelketten-Phagen-Display und die damit angestrebte Selektion konformationsspezifischer
ScFv- Antikörper aus einer Antikörper-Bibliothek gegen das auf Leukozyten exprimierte
Adhäsionsmolekül Mac-1, einem wichtigen Bestandteil physiologischer, aber auch
pathologischer Vorgänge. Desweiteren die funktionelle Charakterisierung und Austestung
des gewonnenen Antikörpers.
Im Folgenden soll der Rezeptor näher beschrieben und seine Relevanz veranschaulicht
werden:
1.1
1.1.1
Adhäsionsmoleküle
Einteilung
Zelladhäsionsmoleküle lassen sich unterschiedlichen Familien von ZelloberflächenRezeptoren zuordnen:
%& Selektine
%& Immunglobulin-Superfamilie
%& Integrine, zu denen der Mac-1 Rezeptor zählt.
Es sei erwähnt, dass neben den o.a. Familien außerdem Cadherine und verschiedene, nicht
miteinander verwandte Oberflächenmoleküle mit adhäsiven Fähigkeiten existieren.
1.1.2
Selektine
Selektine sind Ca2+ -abhängige transmembrane Glykoproteine, deren Vertreter eine Lektinähnliche aminoterminale Domäne besitzen, der eine variierende Zahl von sich
wiederholenden Einheiten mit Homologie zu regulatorischen Proteinen der
EINLEITUNG
12
Komplementkaskade folgt (Gearing 1993). Ferner sind sie durch das Auftreten eines EGFrepeats (endothelial growth factor) gekennzeichnet (Bevilacqua 1993). Trotz ihrer kurzen
intrazellulären Domäne (Bevilacqua 1993) sind sie in der Lage, nach der Interaktion mit ihren
Liganden kostimulatorische Signale zu generieren, die zu der Aktivierung von Leukozyten
beitragen (Brenner 1996). Sie spielen u.a. eine wichtige Rolle bei der Schmerzkontrolle
während inflammatorischer Prozesse (Machelska 1998). Die Selektine vermitteln darüber
hinaus die schwache, reversible Bindung von Leukozyten an die Gefäßwand (Gearing &
Newman 1993). E-Selektin spielt wahrscheinlich eine wichtige Rolle bei der Entstehung der
Atherosklerose, da es in atherosklerotischen Plaques in erhöhtem Maß exprimiert wird (Abe
and Smith 1998).
1.1.3
Immunglobulin-Superfamilie (Ig-Superfamilie)
Die Mitglieder der Ig-Superfamilie sind ebenfalls transmembrane Glykoproteine, welche die
Membran einmal durchspannen (single-pass-Glykoproteine) und vornehmlich eine Ca2+
unabhängige Adhäsion vermitteln (Sluiter 1993; Springer 1994). Sie kommen im Organismus
auf verschiedenen Organen und Geweben vor und besitzen mindestens eine Ig-ähnliche
Domäne, die auch für Antikörper charakteristisch ist (Springer 1990). Die vermittelte Zell Zell-Adhäsion erfolgt sowohl über einen homophilen als auch heterophilen Mechanismus
(González-Alvaro 1996). Den Adhäsionsmolekülen dieser Familie wird u.a. eine große
Bedeutung bei der Entwicklung von Wirbeltieren zugeschrieben.
1.1.4
Integrine
Adhäsionsmoleküle aus der Gruppe der Integrine ermöglichen die Verknüpfung von Zellen
untereinander und das Binden an Oberflächen (Hynes 1992).
Gemeinsamkeit aller Rezeptoren dieser Familie sind zwei nichtkovalent gebundene
Untereinheiten, die !- und die "-Kette. Beide durchdringen einmal die Zellmembran,
bestehen also aus einem intrazellulären, einem transmembranären und einem extrazellulären
Anteil. Die Integrinrezeptorfamilie der Wirbeltiere umfasst bisher 20 verschiedene Komplexe,
aufgebaut aus 16
unterschiedlichen !-Ketten und 8 "-Ketten. Die Kombination der
Untereinheiten hängt ab vom Zelltyp und bestimmt Ligand und Spezifität.
EINLEITUNG
13
Die Klasseneinteilung erfolgt in "1-Integrine, wie z.B. VLA-1 bis VLA-6 (CD49 a-f/CD29),
"2-Integrine, die ausschließlich leukozytär exprimiert werden, wie u.a. LFA-1 (CD11a/CD18)
und Mac-1 (CD11b/CD18), "3-Integrine wie den Vitronektinrezeptor, hier erwähnenswert ist
die exklusive Expression von !IIb"' (GPIIb/IIIa) auf Thrombozyten, sowie "4- und "7Integrine.
Integrine sind an vielen wichtigen Körperfunktionen, wie der haematopoetischen
Zellentwicklung, der Angiogenese, der Zellmigration im Rahmen von Gewebsverletzungen
und entzündlichen Prozessen und dem Aufbau der extrazellulären Matrix. Diese
unterschiedlichen Aufgaben können durch ein breites Spektrum an Liganden, wie z.B.
Fibrinogen, Fibronektin, Vitronektin, Thrombospondin, vonWillebrand-Faktor und Kollagen,
bewältigt werden. Entscheidend für die Ligandenspezifität ist im wesentlichen der
extrazelluläre Teil der !-Kette.
Tabelle1: Übersicht der Adhäsionsmoleküle (Wilson 1996, Hynes 1992)
Vorkommen
Liganden
T-Lymphozyten
Laminin,
Integrine
VLA (Very late ap- !1-6"1
pearing Antigen 1-6)
LFA-1
Kollagen,
Fibronectin,
VCAM-1
!l"2
alle Leukozyten
ICAM-1, ICAM-2
!M"2
Monozyten,
ICAM-1, iC3b, Fibrinogen, Faktor
Neutrophile
X
(CD11a/CD18)
Mac-1
P150 (CD11c/CD61)
!x"#&
Gewebemakrophagen Fibrinogen,iC3b
GPIIb/IIIa
!IIb"3
Thrombozyten
(CD41/CD61)
Vitronectin-Rezeptor
Fibrinogen, Vitronectin, Fibronectin,
vWF
!v"3
Thrombozyten
Vitronectin,
Fibronectin,
Thrombospondin, Osteopoetin
Selektine
vWF,
EINLEITUNG
L-Selectin (CD62L)
14
Alle Leukozyten
GlyCAM,
CD34
(aktivierte
Endothelzellen))
E-Selectin (CD62E)
aktivierte
ESL-1, PSGL-1, sialyl Lewis X
Endothelzellen
(Monozyten, Neutrophile,
Lymphozyten)
P-Selectin (CD62P)
Aktivierte
PSGL-1 (Monozyten, Neutrophile,
Thromozyten
Lymphozyten)
Endothelzellen,
LFA-1, Mac-1
Immunglobuline
ICAM-1 (CD54)
Fibroblasten,
Epithelzellen,
Haematopoetische
Zellen
ICAM-2 (CD10)
Wie ICAM-1
LFA-1
ICAM-3 (CD50)
Alle Leukozyten
LFA-1
VCAM-1 (CD50)
Endothelzellen, glatte VLA-4
Muskelzellen
PECAM-1 (CD31)
Endothelzellen,
PECAM-1, Vitronectin-Rezeptor
Thrombozyten
Zu der Funktion als Adhäsionsmoleküle kommt die Funktion als Signaltransduktoren, sowohl
für „outside-in“-, als auch für „inside-out“-Signale. Beim „outside-in“-Signalweg nehmen
extrazelluläre Matrixproteine über die Bindung an Integrinen Einfluß auf Genexpression,
Zellproliferation und Differenzierung. „Inside-out“-Signale spielen bei der Leukozytenrekrutierung im Laufe von Entzündungsreaktionen eine Rolle. Dabei lösen die lokalen
Entündungschemotaxine in den Leukozyten aktivierende Signale aus, die durch eine
Konformationsänderung des Integrinheterodimers in einem Affinitäts- und Aviditätsanstieg
der Integrine zum entsprechenden Liganden resultiert.
EINLEITUNG
15
Der Nachweis der Beteiligung der Integrine bei Leukozytenextravasion konnte anhand eines
erblichen Defektes erbracht werden. Donald Anderson (Anderson 1987) zeigte, daß der
Leucozyte adhesion deficiency eine Mutation der "2-Integrinuntereinheit (CD18) zugrunde
liegt. Symptome sind Gingivitis, wiederholte Infektionen der Haut und lebensbedrohliche
bakterielle Infektionen auf Grund der Tatsache, daß Leukozyten zwar initial auf dem Endothel
„rollen“, aber nicht in der Lage sind es zu durchwandern, um ihre Funktion in den
Entzündungsgebieten zu erfüllen.
Arfors et al., (1987) zeigten dieses Phänomen in vitro, da dort diese Mutanten nicht zur
Bindung, bzw. Diapedese eines einschichtigen Endothels in der Lage sind.
1.1.5
Adhäsionsmoleküle und Atherosklerose
Atherosklerose
und
die
hiermit
verbundenen
Folgeerkrankungen,
wie
der
akute
Myokardinfarkt, machen einen erheblichen Anteil der Morbitität und Mortalität in unserer
Gesellschaft aus. Ein wesentlicher pathogenetischer Mechanismus hierbei ist die Ablagerung
von Lipiden in der Arterienwand (Atherom). Doch für den weiteren Verlauf der Krankheit
sind entzündliche Reaktionen, wie z.B. das Einwandern von Makrophagen in das
Plaquegewebe, beteiligt, die zu einer Kollagenfaservermehrung der Gefäßwand führt
(Sklerose).
Die durch diverse Adhäsionsmoleküle vermittelte Interaktionen zwischen verschiedenen
Zelltypen, wie Leukozyten, Thrombozyten und Endothelzellen spielt hierbei eine zentrale
Rolle. Beispiele hierfür sind die Integrinrezeptoren GPIIb/IIIa und Mac-1.
Dabei ist die Adhäsion von Leukozyten an das vaskuläre Endothel und ihre darauffolgende
Diapedese eines der ersten Phänomene, die bei akuten Entzündungen oder chronischentzündlichen Krankheiten wie der Atherosklerose beobachtet werden können. Die
Rekrutierung
geschieht
durch
eine
fehlregulierte
Interaktion
endothelialer
Oberflächenmolekülen mit ihren Liganden. Es liegt also eine Dysregulation des Endothels
vor, die zu diesem komplexen Krankheitsbild führt (Ross 1999).
Diese endotheliale Dysfunktion zieht kompensatorische Antworten nach sich, durch die sich
die gegebenen homöostatischen Eigenschaften des Endothels verändern:
%& Zunahme
von
adhärenten
Leukozyten
und
Thrombozyten
und
erhöhte
Durchlässigkeit des Endothels für diese Zellen unter dem Einfluß von Chemokinen,
wie z.B. monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1).
EINLEITUNG
16
%& Die Endothelzellen zeigen prokoagulante anstelle antikoagulanter Fähigkeiten und
produzieren vasoaktive Moleküle, Zytokine und Wachstumsfaktoren.
%& Einwanderung von Leukozyten und spezifischen T-Zellen in die Gefäßwand.
Aktivierte Monozyten differenzieren zu Makrophagen und setzen hydrolytische
Enzyme, Zytokine u. Wachstumsfaktoren aus (Libby 1996; Raines 1996), die zu
weiteren Schädigungen und zu fokalen Nekrosen führen können.
%& Fibroblasten werden durch Serum-Wachstumsfaktoren zur Transkription von
immediate-early Genen, codierend für Cyr61 (Cystein-rich 61) und CTGF
(Connective tissue growth factor), angeregt (O'Brien 1990; Ryseck 1991).
%& Im weiteren Verlauf werden glatte Muskelzellen zur Migration und Proliferation
angeregt (Ross 1973).
Letztere geben ihren kontraktilen differenzierten Zelltyp auf und wandern aus der Media
durch die interne elastische Lamina in die Intima. Als dedifferenzierte Muskelzellen bilden sie
dort die Neointima. Die Arterienwand verdickt sich dadurch zunehmend, wodurch das Gefäß
versucht, das Lumen durch graduelle Dilatation (remodeling) konstant zu halten (Glakov
1987). Fibröses, einrißgefährdetes Gewebe bildet sich, der atherosklerotische Plaque (Falk
1996). Im Falle eines Risses deckt ein Thrombus die Stelle ab. An einem bestimmten Punkt
ist das Gefäß zudem nicht mehr in der Lage, die zunehmende Verdickung durch Dilatation zu
kompensieren, woraus eine zunehmende Verengung resultiert, die u.U. bis zum völligen
Verschluss des Gefäßes führen kann.
Die entzündliche Komponente dieser Pathogenese ist wesentlich von der Aktivation und
Transmigration von Monozyten abhängig, vermittelt über das Integrin Mac-1.
1.1.6
PTCA und die Rolle von Adhäsionsmolekülen bei der Restenose
Eine Behandlungsmöglichkeit der verengten Herzkranzgefäße ist die Überbrückung der
Koronarstenose mittels eines Bypasses, meist in Form von körpereigenen Gefäßanteilen. Die
Ergebnisse sind sehr gut, 80% der Patienten sind postoperativ beschwerdefrei, jedoch ist die
Operation mit hohen Risiken und Belastungen für den Patienten und hohen Kosten
verbunden.
Bis Ende der siebziger Jahre stellte die Bypass-Operation die einzige Methode zur
Revaskularisation der Herzkranzgefäße dar. Seit Anfang der achtziger Jahre steht als
EINLEITUNG
17
Alternative die perkutane transluminare coronare Angioplastie (PTCA) zur Verfügung, eine
weniger invasive, nicht-chirurgische Therapiemethode.
Bei dieser Revaskularisationstechnik handelt es sich um eine intravasale Gefäßaufdehnung
unter Verwendung eines Ballonkatheters. Der Ballon sitzt auf der Spitze eines Katheters und
wird im kollabierten Zustand im Bereich der Gefäßstenose plaziert und dort über einen
äußeren Druck entfaltet, wodurch das Gefäßvolumen erweitert und die Gefäßinnenwand
geglättet wird.
Klinisch wurde diese Methode erstmals 1977 von Andreas Grüntzig, einem Kardiologen in
Zürich, für die Wiedereröffnung von Koronargefäßen eingesetzt (Gruntzig 1979). Seitdem hat
die Zahl der mit PTCA behandelten Patienten rapide zugenommen.
Die unmittelbare
Erfolgsquote beträgt inzwischen 90-95%, jedoch stellt eine 30% Restenoserate die
Achillesferse der Methode dar. Ursache für die Restenose der dilatierten Arterie sind die
durch die mechanische Reizung der Gefäßwand einwandernden Entzündungszellen. Daran
entscheidend beteiligt ist die CD11b/CD18 vermittelte monozytäre Adhäsion.
Freisetzung von
Chemotoxinen
Gefäßverletzung
Behinderung des
Blutflusses
Adhäsion
von
Monozyten
Fremdoberfläche
des Stents
Freisetzung von
Wachstumsfaktoren
Neointimahyperplasie
Proliferation der
glatten Muskulatur
Endothel
Glatte Muskelzelle
Restenose
Abb. 1.1: Restenosekaskade
Media
EINLEITUNG
18
Bis zu 30% der Patienten zeigen nach einem Jahr eine Wiedereinengung ihrer Gefäße. Die
Restenoserate läßt sich vermindern durch die zusätzliche mechanische Fixierung des
aufgeweiteten Blutgefäßes durch eine Gefäßstütze, den sogenannten Stents.
1986 setzte Ulrich Sigwart zum ersten Mal Stents in die Koronararterien eines Menschen ein,
um einen akuten Verschluß und eine Restenose nach transluminaler Angioplastie zu
verhindern (Sigwart 1987). Dieser erste Koronarstent war ein selbstexpandierender Wallstent,
der von Sigwart in Zusammenarbeit mit Medinvent, einem lokalen Hersteller aus Lausanne,
entwickelt worden war (Sigwart 1995).
Mehrere umfangreiche Studien haben seitdem bewiesen, daß Stents in der Tat die Häufigkeit
von Restenosen wie auch die von Infarkten und notfallmäßiger Bypassoperation vermindern.
Jedoch sind alle Stents Fremdkörper und führen damit zu einer Problematik, die bis heute mit
dem Einsatz alloplastischer Materialien in der Blutbahn generell verbunden ist.
Hauptproblem ist die unzureichende Biokompatibilität sowie Blutunverträglichkeit der
verwendeten Stentmaterialien. Somit besteht ein hohes Risiko des akuten oder subakuten
Verschlusses (während oder direkt nach der Intervention) und der chronischen
Wiedereinengung des Lumens oder Restenose. Die Restenose wird oft innerhalb des Stents
beobachtet und wird unter anderem durch die Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus den
aktivierten Thrombozyten erklärt.
Diese Risiken limitieren bisher die Sicherheit und
Effizienz der PTCA und erfordern eine aggressive, pharmakologische Begleittherapie
während und nach der Stentimplantation. Dies stellt eine große Herausforderung dar, auf dem
pharmakologischen Weg neue Wirkmechanismen zu untersuchen, um gerinnungs- und
entzündungshemmende Medikamente noch effektiver und mit geringeren Nebenwirkungen
einsetzen zu können. Entscheidende Erkenntnisse sind dabei über den Benefit einer selektiven
Mac-1 Blockade gewonnen worden (Campbell 1998; Simon 2000). Diese Studien legen die
gezielte Suche nach einem therapeutisch einsetzbaren CD11b/CD18 Antagonisten nahe.
1.2
1.2.1
Das Integrin Mac-1 (CD11b/CD18, !M"#)
Funktion
Die biologischen Funktionen dieses Rezeptors liegen im Bereich des Immun- und des
Blutgerinnungssystems:
EINLEITUNG
19
Der aktivierte Mac-1 bindet ICAM-1 und vermittelt so Leukozytenadhäsion an
Endothelzellen als Vorraussetzung für Extravasion im Rahmen der Chemotaxis (Hynes 1992,
Springer 1994). Mac-1 bindet iC3b auf opsonierten Bakterien und dient damit der
Phagozytose
und
Matrixproteinen
Verdauung
dieser
(Fibronektin,
Bakterien.
Laminin,
Desweiteren
Kollagen
und
eine
Vielzahl
von
Elastase),
Proteine
des
Blutgerinnungssystems (Fibrinogen, FaktorX und Kininogen) und Nichtproteinliganden (LPS,
Zymosan, "-Glykane, Heparin und Proteoglykan) sowie Proteine auf Mikroorganismen.
Diese Vielzahl der Liganden ist auch Vorraussetzung für die Regulation adhesiver und
entzündlicher
Prozesse
nach
vaskulären
Verletzungen.
Durch
seine
Rolle
bei
Entzündungsreaktionen ist Mac-1 somit auch an der Bildung von Intimaverdickungen bei
vaskulären Reparationsvorgängen, z.B. nach PTCA, beteiligt (Simon 2000). Aktivierte
Leukozyten gelten damit als Marker für ein erhöhtes Restenoserisiko nach Angioplastie
(Pietersma 1995).
Autopsien menschlicher Koronararterien nach Stentimplantation zeigen, dass ein Monat nach
Implantation 30% der Neointimalen Zellen aus glatten Muskelzellen hervorgegangen sind
aber 69% von Monozyten/Makrophagen abstammen, was die enorme Bedeutung dieser
Zellen für die Restenoseprävention belegt (Rogers 1998).
Interessant in diesem Zusammenhang ist auch, dass ein aktivations-unspezifischer,
monoklonaler, CD11b blockierender, Antikörper vom Typ IgG2b im Tiermodell (Hase)
Leukozytenrekrutierung
und
Intimaproliferationen
nach
Gefäßverletzungen
durch
Ballondillatation und Stentimplantation signifikant reduzieren konnte (Campbell 1998).
Inoue et al. gelang der Nachweis, dass Stent induzierte Aktivation und erhöhte Expression
von Mac-1 in direktem Zusammenhang mit Neointimalen Verdickungen und Restenose
stehen (Inoue, Uchida et al. 2003).
Durch die Bindung von Cyr61 und CTGF, immediate-early Gen-Produkte, die in
atherosklerotischen Läsionen exprimiert werden, ist eine Beteiligung von CD11b/CD18 bei
der Atherosklerose nachgewiesen (Schober, Chen et al. 2002). Auch bei der Chlamydia
pneumoniae assoziierten Atherosklerose spielt Mac-1 im Rahmen der Differenzierung der
Monozyten zu Makrophagen eine Rolle(Yamaguchi 2001).
Desweiteren wird Mac-1 eine Rolle in der Arteriogenese zugesprochen, die durch eine
höhere Expression des Rezeptors bei Stimulation mit arteriogenese-typischen Chemotaxinen
belegt ist (van Royen 2002). Dies könnte auch den Expressionsanstieg von CD11b/CD18
nach harten körperlichen Belastungen an der anaeroben Schwelle (Jordan 1999), als
Anregung zur Arteriogenese, erklären.
EINLEITUNG
20
Die Vermittlung der festen leukozytärer Ahäsion an das Endothel ist ebenfalls eine Funktion
des Mac-1-Rezeptors. Einige Versuche zeigen jedoch, dass das Integrin dabei teilweise auf
sein Schwesterintegrin LFA-1 (CD11a/CD18) angewiesen ist. So konnte die Arbeitsgruppe
von Rogers (Simon 2000) zeigen, daß Mac-1-defiziente (Mac-1-/-) Mäuse eine verminderte
Leukozytenanreicherung im verletzten Gewebe aufwiesen. Lu und seine Kollegen (Lu H
1997) erhielten mit Mac-1-/- Zellen auch eine defekte Adhärenz von Leukozyten an
Fibrinogenbeschichtete
Oberflächen,
aber
überraschenderweise
war
die
Neutrophilenemigration in das Peritoneum, experimentell hervorgerufen durch zwei
verschiedene Entzündungsstimuli (Thioglycollate Injektion oder Implantation
von
Fibrinogenbeschichteten Scheiben),in diesen Tieren nicht unterdrückt. Verabreichte man den
Mac-1-/- Mäusen jedoch LFA-1-blockierende, monoklonale Antikörper, so konnte die
Neutrophilenemigration um 78% reduziert werden, bei Wildtypmäusen um 58%. Die
Leukozytenemigration in das Peritoneum ist bei LFA-1-defizienten Mäusen ebenfalls
reduziert.
Diese Beobachtungen zeigen, dass sowohl Mac-1 und LFA-1 an der Adhäsion und
Transmigration von Leukozyten beteiligt sind, aber, sich funktionell ergänzend, verschiedene
Aufgaben im Ablauf der Leukozytenrekrutierung übernehmen.
1.2.2
Struktur
Der Mac-1 Rezeptor gehört wie LFA-1 und p150/90 zur Gruppe der Leukozyten-Integrine,
die eine gemeinsame "2-Untereinheit besitzen, sich
in ihrer ! Einheit unterscheiden. Strukturell handelt
es sich bei der CD11b Untereinheit um ein Typ 1
Transmembranprotein
mit
1136
Aminosäuren,
davon 1091 extrazellulär, 26 transmembranär und 19
als cytoplasmatische Region. Das Molekulargewicht
beträgt 165kDa, CD18 hat ein Gewicht von 95kDa.
Abb.1.2:
Schematische
CD11b/CD18.
Darstellung
des
Integrins
EINLEITUNG
1.2.3
21
Die I-Domäne
Die wesentliche Ligandenbindestelle in der !-Kette wurde von Diamond et al. (Diamond
1993; Diamond, Garcia-Aguilar et al. 1993) beschrieben.
Diese Bindestelle, auch I-Domain genannt, ist eingefügt („I“ steht für „inserted“=eingefügt)
zwischen den ß-Faltblatt-Strukturen 2 und 3 des ß-Propellers, der aus einem sieben-blättrigen,
von ß-Faltblattstrukturen gebildeten, Propeller besteht, (Springer 1997) und ist ca. 200
Aminosäuren lang.
Abbildung 1.4: Struktur der I-Domain: Der "-Faltblattbereich mit den 7 „Popellerblättern“ bezeichnet
mit A-F. Umgeben von den !-Helices 1-7. An der Spitze die MIDAS. Auch gezeigt ist die
Verschiebung der !-Helix 7 bei Mn2+-Bindung (blau dargestellt, die Ausgangsstruktur ist rot).
An der Oberfläche befindet sich eine Metallionen abhängige Bindungsstelle, MIDAS (metal
ion-dependent adhesion site), an der ein Mg2+ gebunden ist (Lee 1995). Bei Aktivierung
kommt es zu einer Verschiebung des Metallions innerhalb der MIDAS und damit verbunden
zu einer Bewegung der C-terminalen Helix um 10 Angstroem (Emsley 2000), was sich
experimentell auch durch einen Austausch des Mg2+ durch ein Mn2+ erreichen lässt (Lee
1995). Dies lässt sich auch als aktivierendes inside-out Signal von der Zelle auf den Rezeptor
durch spezifische, z.B. GM-CSF, IL-4, fMLP, und unspezifische Stimulantien, z.B. PMA,
ADP induzieren. Die daraus resultierende Konformationsänderung des Rezeptors führt von
EINLEITUNG
22
einer niederaffinen in eine hochaffinen Form. Diese Konformationsänderung lässt sich
experimentell auch durch die Bindung eines monoklonalen Antikörpers erreichen
(Orchekowski, Plescia et al. 2000).
Die Bindungsstellen innerhalb der I-Domain für die einzelnen Liganden variieren deutlich,
sind teilweise völlig unabhängig voneinander, z.B. im Falle von Fibrinogen und Faktor X
(Mehdi 1998), ebenso die von Mac-1 gebundenen Sequenzen innerhalb der Liganden. So
wurde berichtet, dass Mac-1 RGD-ähnliche Sequenzen bei einigen seiner Liganden bindet
(Wright 1987; Wright 1989). Dabei handelt es sich um ein Tripeptid mit der Sequenz ArgGly-Asp, das gehäuft bei Proteinen der extrazellulären Matrix vorkommt, über das die
Bindung mit Integrinrezeptoren der Zellmembran erfolgt. Die Liganden Fibrinogen und iC3b
binden jedoch nicht mit RGD-Sequenzen an Mac-1 (Altieri 1988; Altieri 1990). Anhand von
Bindungsversuchen mit Antikörpern auf Zellinien die unterschiedliche Mutationen der
CD11b Untereinheit exprimierten sind die Bindungsstellen der Liganden iC3b, Fibrinogen
und ICAM-1 näher beschrieben worden (Diamond, Garcia-Aguilar et al. 1993).
Auch die beiden Sequenzen in der (-Kette der D-Domäne des Fibrinogens, die an der
Bindung an den Mac-1 beteiligt sind, wurden identifiziert (Ugarova, Solovjov et al. 1998),
P1: (190-202 und P2: (377-395, wobei das Peptid P2 10-15fach potenter bei der Blockade der
Adhäsion von CD11b/CD18 exprimierenden Zellen auf der D-Domäne des Fibrinogens ist.
Der COOH-terminale Anteil (P2-C: (383TMKIIPFNRLTIG395) enthält die wesentliche
Bindungssequenz (Ugarova, Solovjov et al. 1998).
Abbildung 1.5:
(-Kette des
Fibrinogens
Hervorgehoben sind
Die P1-Region (190202
und
die
P2-
Region (377-395.
Diese wird erst zugänglich nach Proteolyse (Von D-100 zu D-98), Immobilisation des
Fibrinogens auf Plastik oder Ablagerung von Fibrinogen in der extrazellulären Matrix (Lishko
2002). Vermutlich spielen in vivo Prozesse im Rahmen von Gewebsverletzungen oder
Entzündungen eine Rolle bei der Aktivation der !M"2-Bindungsstelle im Fibrinogen.
EINLEITUNG
23
Nach Identifikation der !M"2-Bindungsstelle im Fibrinogen ließ sich mit Bindungsassays von
Peptidfragmenten der I-Domäne das genaue Paratop mit der Aminosäuresequenz: KFGDPLGYEDVIPEADR- bestimmen. Die erste Aminosäure Lysin ist an Position 245, das
abschließende Arginin an Position 261 der !-Kette zu finden (Yakubenko, Solovjov et al.
2001).
Die I-Domäne ist aber nicht für die strukturell richtige Faltung, die Heterodimerbildung und
die Oberflächenexpression der Integrine notwendig (Yalamanchili, Lu et al. 2000).
In der ~700 Aminosäurereste langen extrazellulären Domäne der ß-Untereinheit des Mac-1
befindet sich eine hochkonservierte Struktur, bestehend aus 250 Aminosäuren, die der IDomain strukturell ähnelt (siehe auch Abbildung 1).
1.3
1.3.1
Antikörper
Struktur
Antikörper (Immunglobuline) sind der Hauptbestandteil des humoralen Abwehrsystems
unseres Körpers. Durch die Kombination verschiedener Genabschnitte ergibt sich eine
ernorme Variabilität, die uns ermöglicht körperfremde Epitope zu erkennen. Das genetische
Material dafür sitzt in dem B-Zellen Pool des lymphatischen Gewebes.
Strukturell bestehen Immunglobuline aus zwei identischen schweren Ketten (heavy chains
H;ca. 440 Aminosäuren; 50-75 kDa je nach Isotyp) und zwei identischen leichten Ketten
(light chains L; 210-220 Aminosäuren; konstant ca. 22,5kDa) (Porter 1973).
Kovalente Disulfidbindungen und non-kovalente Bindungen, wie z.B. Wasserstoffbrückenbindungen) verbinden die Ketten. Sie falten sich zu diskret strukturierten Domänen 8ca. 110
Aminosäuren), die eine relativ konservierte dreidimensionale Konformation (Tertiärstruktur)
annehmen (Schiffer 1973) ;(Bird 1988).
EINLEITUNG
24
Fab-Fragment
Fv
Antigenbindung
Variable
Region
CDR’s
(hypervariable Domänen)
leichte Kette
IgG
schwere Kette
Fab
hingeRegion
Komplementaktivation
Fc
ScFv-Fragment
Peptidlinker
Makrophagenbindung
tag
Abbildung 1.6: Das Immunglobulin mit seinen Proteindomänen und synthetische Antikörper.
Die Ketten bestehen aus den exonal separat codierten Proteindomänen V, C, D und J.
N-terminal liegen die variablen V-Regionen, die die Antigenspezifität des Antikörpers
bestimmen, bestehend aus den Subtypen VH und VL. Diese bilden zusammen die
epitopbindende Domäne, das Paratop. V-Regionen bestehen aus stark konservierten FWRegionen (Framework) und den hypervariablen Bereichen (CD-Regionen: complementary
determining regions) (dePreval 1976); (Kabat 1987); (Padlan 1977). Die Cd-Regionen und
Teile der Fw-Regionen interagieren bei der Antigenbindung mit dem Epitop. Dabei bilden die
FW-Regionen ein ß-Faltblattgerüst, das die CD-Regionen auf der Proteinoberfläche zur
Annahme einer definierten Konformation zwingt, die komplementär zum Antigen ist (Bird
1988). Die äußerste Vielfalt der Antigenspezifitäten erklärt sich durch Exon-Rearrangements
der CD-, FW-, J- und D-Regionen (VHDJH-Regionen, VLJL-Regionen) und somatische
Mutationen (Additionen, Deletionen und Substitutionen bei der Fusion von Exons).
EINLEITUNG
25
Den C-Terminus, die schweren Ketten und jeweils einen Teil der leichten, bilden die CRegionen, die den Isotyp des Immunglobulins mit dem konstanten Teil für Makrophagen- und
Komplementbindung darstellen (Bird 1988). Die Subtypen der konstanten schweren Kette CH
definieren die Einteilung in die Ig-Klassen !=IgA, )=IgD, *=IgE, (=IgG, +,IgM.
Unterschiede liegen in Struktur und Funktion und äußern sich u.a. durch Antigenität, die
elektrophoretische
Mobilität,
das
Molekulargewicht,
den
Glykosielierungs-
und
Polymerisationsgrad, die Kinetik der Moleküle, die Verteilung in verschiedenen
Kompartimenten des Organismus, die Plasmakonzentration, die biologische Halbwertszeit
und die Funktion. Die Fc-Region ist, durch die Fähigkeit Makrophagen (mittels
Makrophagozytärer Fc-Rezeptoren) und Komplementfaktoren zu binden und zu aktivieren,
zugleich die Effektorregion des Antikörpers (Davis 1983; Bird 1988).
Die Subtypen $&und -&der konstanten leichten (CL) Kette definieren Subklassifikationen.
Durch die hohe Konservation der genetischen Information der C-Regionen sind diese in
verschiedene Spezies weitestgehend identisch.
Hochkonserviert sind auch die C-terminalen Bereiche der J-Regionen. Die N-terminalen
Bereiche der H-Kette entstehen durch das Rearrangement eines D- und eines JH-Gens zu
einem DJH-Gensegmentes, welches, verknüpft mit einem VH-Gens, ein VHDJH-Gensegment
bildet. Der N-Terminus der L-Kette dagegen besteht aus der Rekombination eines VL-Gens
mite einem JL-Gen zu einem VLJL-Gensegment. Funktionell betrachtet beeinflussen die J- und
D-Regionen im wesentlichen die Konformation des Paratopes.
1.3.2
Rekombinante Antikörper
Rekombinante Antikörper sind Antikörper, deren Struktur und/oder Sequenz verändert wurde
um sie experimentell, diagnostisch oder therapeutisch nutzen zu können.
Zunächst wurde zur Erzeugung spezifischer Antikörper das Antigen Tieren injiziert um deren
Immunsystem zur Antikörperbildung anzuregen. Da dabei viele Plasmazellen Antikörper
gegen das Antigen produzierten, erhielt man ein Gemisch aus polyklonalen Antikörpern. Erst
Georges Köhler und Cesar Milstein lösten dieses Problem mit Hybridom-Zellklonen. Diese
entstanden durch die Verschmelzung einer Plasmazelle, die einen gewünschten Antikörper
produzierte, mit einer Tumorzelle, die sich durch unbegrenzte Teilungsfähigkeit auszeichnete.
Alle Nachfahren dieser Mischzelle hatten dasselbe Erbgut, produzierten denselben, also
EINLEITUNG
26
monoklonalen Antikörper. (Georges Köhler und Cesar Milstein erhielten für die Entwicklung
dieser Methodik 1984 den Nobelpreis für Medizin).
Dieses Verfahren ist noch gebräuchlich, hat aber den Nachteil, dass es auf die Maus als
Wirtsorganismus zurückgreift, d. h. bei den so gebildeten Antikörpern handelt es sich um
komplette Mausantikörper. Diese werden diagnostisch eingesetzt, haben jedoch entscheidende
Nachteile im therapeutischen Einsatz. Tierhaltung und Screening der Tiere, nach einem
nutzbaren monoklonalen Antikörper, machen dieses Verfahren sehr aufwendig und
kostenintensiv.
Neuere Ansätze gehen dahin, kleinere Antigen-bindende Fragmente, bestehend aus dem Faboder Fv-Teil der Antikörper (siehe Abb. 1.6), zu nutzen. Diese lassen sich auch in fremden
Organismen herstellen, da die Effektorfunktionen durch das Fehlen des FC-Teiles, wegfallen.
Die kleinste Einheit stellt dabei das FV-Fragment da. Es lässt sich sowohl enzymatisch
(Hochmann, 1973; Sen, 1986) als auch gentechnisch herstellen. Werden die Antigenbindenden Regionen der leichten und schweren Kette (VH und VL) durch eine
Verbindungssequenz (Linker) von 15-18 Aminosäuren verbunden, spricht man von einem
„Single Chain Fv Fragment“ (ScFv). Es stellt die minimal Form eines funktionellen
Antikörpers da. Die Konstruktion als eine Kette stabilisiert das Protein und gewährleistet eine
gleichmäßige Expression beider Regionen in heterologen Organismen, wie z.B. E. coli. Diese
Immunglobulinderivate haben entscheidende Vorteile im pharmakologischen Einsatz
gegenüber dem kompletten Antikörper: sie können in prokaryontischen Systemen exprimiert
werden, die sich durch schnelle, ergiebige und stabile Expression auszeichnen. Die
Bakterienklone sind in ihrer Handhabung, Kultur, Analyse und Lagerung meist einfacher und
billiger als die entsprechenden Wirtsorganismen für komplette Antikörper.
Die geringe Größe der ScFv als kleinste Paratop tragende Antikörpereinheit führt im
Vergleich zu Ig, bzw. F(ab’)2, Fab’, oder Fab-Fragmenten zu kürzeren Retentionszeiten in
Nicht-Zielgeweben, besserer Penetration in Zielgeweben (Haber 1986) und höherer
Plasmaclearance (Laroche 1991). Desweiteren ist ihre immunogene Potenz gering (Rodwell
1989), aufgrund der Abwesenheit der Komplement-System aktivierenden Fc-Region (Bird
1988). Deren Fehlen erhöht eventuell auch die Spezifität, da die Fc-Region auch zu
unspezifischen Bindungen führen kann (Wahl 1983; Harwood 1985).
Die Halbwertszeit rekombinanter Antikörper wie z.B. Fab’, oder F(ab’)2 beträgt nur 1% der
eines vollständigen IgG (Waldmann 1969), auch auf Grund des fehlenden Fc Teiles, dass über
Interaktion mit FcRn in vivo die Lebenszeit der Antikörper verlängert (Medesan 1997).
EINLEITUNG
27
Ist eine längere Halbwertszeit erwünscht, lässt sich dies durch in vitro Konjugation mit
Polyethylenglykol erreichen (Chapman 1999) oder durch die Konjugation an Albumin (Smith
2001).
ScFv Antikörper sind durch die genannten Eigenschaften günstig und variabel einsetzbar und
anderen Antikörperderivaten überlegen.
1.3.3
Antikörper in Diagnostik und Therapie
Rekombinante Antikörper sind heute aus der medizinischen Diagnostik nicht mehr
wegzudenken. So dienen z.B. Antikörper, die mit radioaktiven oder fluoreszierenden Stoffen
verbunden sind, dem Nachweis oder der Konzentrationsbestimmung von Substanzen und
Zellen. Auch der Nachweis von Virusinfektionen, z.B. HIV oder Hepatitis, basiert auf dem
Einsatz von Antikörpern.
Sie werden radiologisch genutzt, wie z.B. bei der Immunszintigrafie, die Tumorherde im
Körper markiert, basierend darauf, dass maligne Zellen häufig ein spezielles RezeptorenExpressionsmuster zeigen.
Der therapeutische Ansatz erwies sich lange Zeit als schwierig. Erst mit der Entwicklung des
GPIIb/IIIa-Blockers Abciximab kam der Durchbruch der neuen Medikamentenklasse der FabFragmente. Heute werden diese bereits in der Brustkrebstherapie als Human-EpithelialGrowth-Factor2-Receptor-Antikörper
Trastuzumab,
in
der
Therapie
entzündlicher
Darmerkrankungen als TNF-Antikörper Infliximab und zur Therapie von Lymphomen als
CD20-Antikörper Rituximab, eingesetzt.
Abciximab brachte eine Wende in der Pharmakologie kardiologischer Erkrankungen und wird
heute mit großem Erfolg zur Gerinnungshemmung bei PTCA-Patienten eingesetzt.
Die Vorteile, die ScFv-Antikörper gegenüber Fab-Fragmenten besitzen werden bisher in der
Kardiologie noch nicht nutzbar gemacht. Es bieten sich hier noch zahlreiche Epitope, die an
pathologischen Prozessen beteiligt sind, wie z.B. der Mac-1 Rezeptor.
1.3.4
Selektion von Antikörpern mittels Phagendisplay
Das „single-chain“ Antikörper Fragment eignet sich hervorragend zum Phagendisplay. Dabei
handelt es sich um eine Methode zur Selektion von Antikörpern, die ein bestimmtes Epitop
EINLEITUNG
28
binden. Vorraussetzung dafür ist eine sogenannten Phagenbibliothek aus der der passende
Antikörper herausgesucht werden muß.
Potentiell universelle Phagenbibliotheken mit eine Komplexität von über 109 können
entweder durch Rekombination natürlicher humaner Antikörpersequenzen, oder durch
Insertion randomisierter Sequenzen in einen Antikörper Rahmen (synthetische Bibliothek)
hergestellt werden. Durch eine Fusion des single chain Antikörpers mit dem PhagenHüllprotein p3 wird der Antikörper an der Spitze des Phagen exprimiert, der gleichzeitig die
das Protein kodierende DNA-Sequenz enthält. Die Suche nach passenden Antikörpern für
spezifische Antigene kann dann durch Exposition auf entsprechenden Zelloberflächen
erfolgen. Eine Trennung der auf der Oberfläche gebundenen Phagen und er in der Flüssigkeit
befindlichen Phagen kann durch mehrfache Zentrifugation erfolgen. Nicht bindende Phagen
im Überstand werden so eliminiert und gebundene Phagen werden weiterverarbeitet. Eine
Anreicherung spezifischer Phagen kann allerdings nur in mehreren Phagen-Display Runden
erfolgen, zwischen denen immer eine Vermehrung der gewonnen Phagen in E.coli Bakterien
stattfindet. Um nun selektiv Phagen zu erhalten, welche an spezifischen Zellzuständen oder
sogar Proteinkonformationen binden, besteht die Möglichkeit vor der Selektion eine
Depletion der Bibliothek an den entsprechenden komplementären Zuständen durchzuführen
und die hier bindenden Phagen zu verwerfen.
Somit bietet Phagen-Display also die
Möglichkeit humane ScFv-Antikörper auf humanen Zellen oder auf humanen Rezeptoren in
rekombinanten
Expressionsmodellen
zu
zu
selektionieren
und
so
den
in
vivo
Immunisierungsprozess in einem komplett humanen System durchzuführen.
1.3.5
Fragestellung
Da das Leukozytenintegrin Mac-1 sowohl aus therapeutischen als auch diagnostischen
Gründen von hohem Interesse für die Kardiologie ist, ist es Ziel dieser Doktorarbeit, einen
Antikörper gegen diesen Rezeptor herzustellen.
Besondere Beachtung soll dabei dem Konformationswechsel des Rezeptors unter Aktivierung
entgegengebracht werden, da dieser entscheidend für die Bindung seiner Liganden und zum
Aktivitätsmonitoring von mononukleären Zellen ist.
Dabei stellen sich folgende Fragen:
%& Ist die Methode des ScFv-Phagedisplays geeignet einen Antikörper mit den Vorteilen
eines ScFv Antikörperfragmentes zu selektionieren, der spezifisch die hochaffine
Konformation des Leukozytenintegrins Mac-1 erkennt und bindet?
EINLEITUNG
29
%& Mit welchen Mitteln lässt sich ein solcher Antikörper in ausreichenden Mengen
produzieren und aufreinigen.
%& Ist mit einem solchen Antikörper ein funktionelles Monitoring des Aktivitätszustandes
von mononukleären Zellen möglich.
%& Ist ein so selektionierter und hergestellter Mac-1 Antikörper in der Lage die Bindung
von Liganden des Rezeptors zu inhibieren, und ermöglicht er so einen therapeutischen
Einsatz.
MATERIALIEN
2
30
Materialien
Alle Lösungen (z. Bsp. Medien oder Puffer) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit Aqua
destillata angefertigt.
2.1. Materialien der gentechnischen Arbeiten
2.1.1
Kultivierung von E.coli in Medium
LB Medium
Luria Broth Base (Miller´s LB Broth Base)
GIBCOBRL, Paisley, Scotland, #12795-027
Ampicillin
GERBU Biotechnik, Gaiberg, Deutschland, #1046
Glucose
ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #6887.1
TG1 E.coli
TG1 Electroporation Competent Cells
Stratagene, La Jolla, USA, #200123
XL1-Blue E.coli
XL1-Blue Competent Cells
Stratagene, La Jolla, USA, #200249
2.1.2
Kultivierung von E.coli auf Agar
LB Agar
GLB AAR (LENNOX L AGAR)
GIBCOBRL, Paisley, Scotland, #22700-025
Ampicillin
s.u. 2.1.1.1.
Glucose
s.u. 2.1.1.1.
2.1.3
Glycerol
Trockeneis
Glycerolstocks
SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland, #G5516
MATERIALIEN
Ethanol
2.1.4
31
Mallinckrodt Baker BV, Deventer, Holland, #8006
Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli
QIAprep-spin.-Plasmid-Preparation-Kit, QIAGEN, Hilden, Deutschland, #27106
2.1.5
Agarose-Gel-Elektrophorese
Agarose
Agarose NEEO Ultra-Qualität
ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #2267.2
50 x TAE Stammlösung
2M Tris (SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland, #T-6791)
5mM EDTA (ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #8040)
5,5 % vol % conc. Essigsäure (MERCK, Darmstadt,
Deutschland, #1.00063.1011)
Ethidiumbromid
GERBU Biotechnik, Gaiberg, Deutschland, #3041
6x DNA-Ladepuffer
Blue/Orange 6x Loading Dye
0,03 % Bromphenolblau, 0,03 % Xylencyanol, 0,4 % Orange G,
10 mM Tris HCl, 50 mM EDTA, pH 8,0
Promega, Madison, USA, #G1881
DNA Marker
SmartLadder, EUROGENTEC, Seraing, Belgien, #MW-170002
(200-10000 bp)
2.1.6
Enzyme
DNA-Restriktion
Typ-II-Restriktionsendonukleasen der Firma Roche, Mannheim,
Deutschland
Puffer
spezielle 10x-Puffer Systeme, kompatibel zu den jeweiligen
Endonukleasen, Roche.
MATERIALIEN
2.1.7
32
Gelelution von DNA-Fragmenten
QIAquick.-Gel-Extraction-Kit, QIAGEN, Hilden, Deutschland, #28704
2.1.8
DNA-Konzentrationsbestimmung
Es wurden die gleichen Materialien wie zu Agarose-Gel-Elektrophorese benutzt.
2.1.9
Dephosphorylierung
AP-ase (CIP)
Alkalische Phosphatase (calf intestine phosphatase)
10x Puffer, zur AP-ase kompatibel, Roche, Mannheim,
Deutschland, #713023
2.1.10
DNA-Ligation
Rapid DNA-Ligation Kit, Roche, Mannheim, Deutschland, #1635379
2.1.11
Herstellung von Hitzeschock-kompetenten E.coli
LB-Medium
siehe 2.1.1.
TG-1 Bakterien
siehe 2.1.1.
MATERIALIEN
33
Transformationspuffer
25ml 1M CaCl2
(ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #A.119.1),
150ml 50% Glycerol (Sigma-Aldrich, Steinheim, Deutschland,
#G-5516), 50ml 0,1M PIPES pH 6,6 (Carl Roth, Karlsruhe,
Deutschland, #9156.1)
275ml a.d.
2.1.12
DNA-Transformation und Selektion eines Plasmid-positiven Klons
SOC-Medium
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, #15544-034
TG1 Bakterien
s.u. 2.1.1.1.
2.1.13
Polymerase-Chain-Reaction (PCR)
PFU Polymerase
QIAGEN, Hilden, Deutschland, #201443
dNTP Mix
Roche
Primer
MWG Biotech, Ebersberg, Deutschland
2.1.14
Herstellung einer natürlichen Phagenbibliothek
Die Phagenbibliothek wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von der Firma Affimed
Therapeutics, Heidelberg, Deutschland.
2.1.15
Phage-display durch oberflächenverankerte ScFv auf filamentösen Phagen
HEPES modifizierte Tyrode HEPES (ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #9105.2), 150 mM
NaCl (MERCK, Darmstadt, Deutschland, #106400), 2.5 mM
KCl (MERCK, Darmstadt, Deutschland, #1.05.001.1000), 1.2
mM NaHCO3 (ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #8551.1 , 2 mM
MgCl2 (SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland, #M-8266),
MATERIALIEN
34
2 mM CaCl2 (ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #A.119.1), 0.1 %
BSA (SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland,
#11930), 0.1 % Glucose (ROTH, Karlsruhe, Deutschland,
#6887.1)
M13K07 Helfer Phagen
Amersham Pharmacia Biotech Inc, Piscataway, NJ, USA, #271524-01
PVP
Phagenverdünnender Puffer
10 mM Tris (SIGMA – Aldrich), 20 mM NaCl (MERCK), 2mM
EDTA (ROTH), pH 7,5
Elutionspuffer
0,1 M Glycin (GERBU Biotechnik, Gaiberg, Deutschland,
#1023), ph 2,2
Neutralisationspuffer
2 M Tris (SIGMA – Aldrich), pH 8
Tetracycline
SIGMA-Aldrich, Steinheim, Deutschland, #T-7660
Kanamycin
Invitrogen, Karlsruhe, Deutschland, #55-0204
PEG
Polyethylenglykol, ROTH, Karlsruhe, Deutschland, #0158.1
s. u. 2.1.1.
2.1.16
Panning
Siehe 2.1.14
2.1.17
Screening der amplifizierten Klone/BSTN1-Verdau
Siehe 2.1.6 DNA Restriktion.
2.1.18
Kultur der Zellen
MATERIALIEN
35
Zellkulturmedien
CHO
DMEM 500ml
10% FCS
1% Penicillin-Streptomycin
1% Glutamin
1% Non-Essential Amino Acids
Mac-1-Zellen
DMEM 500ml
10% FCS
1% Penicillin-Streptomycin
1% Glutamin
1% Non-Essential Amino Acids
700µg Geneticin
250µg Zeocin
Monozyten
RPMI 1640
10% FCS
1% Penicillin-Streptomycin
1% Glutamin
.
2.1.19
Einfrieren von Zellen
Cell Culture Freezing Medium
Gibco BRL, USA, #11101-011
MATERIALIEN
2.2
2.2.1
36
Materialien der proteinbiochemischen Arbeiten
Induktion der Proteinexpression
TG1 Bakterien
s.u. 2.1.1.1.
Vector
pHog21
LB Medium
s.u. 2.1.1.1.
2.2.2
Protein-Isolation
BugBuster Protein
Novagen, Inc., Madison, US, #70921-4
Extraction Reagent
Benzoase Nuclease
2.2.3
Novagen, #70746-3
Protein-Aufreinigung durch Ni 2+-Affinitätschromatographie
Ni+ NTA Agarose
QIAGEN, Hilden, Deutschland, #30210
Dialysepuffer A
50 mM NaH2PO4 (SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland,
#S-9638), 300 mM NaCl (MERCK, Darmstadt, Deutschland,
#106400), 10 mM Imidazol (SIGMA – Aldrich, Steinheim,
Deutschland, #I – 2399), pH 8
Waschpuffer B
50 mM NaH2PO4 (SIGMA – Aldrich), 300 mM NaCl
(MERCK), 20 mM Imidazol (SIGMA – Aldrich ), pH 8
MATERIALIEN
Elutionspuffer C
37
50 mM NaH2PO4 (SIGMA – Aldrich), 300 mM NaCl
(MERCK), 250 mM Imidazol (SIGMA – Aldrich ), pH 8
2.2.4
Dialyse
Dialysepuffer A
s.u. 2.2.3.
PBS – Puffer
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline without Ca and Mg
Bio Whittaker Europe, Verviers, Belgien, #BE17-515F
Dialysemembran
Spectra/Por. molecular porous membrane tubing
Spektrum Laboratories, Inc., Rancho Dominguez, CA, USA
Dialysekammern
Slide-A-Lyzer. Dialysis Cassette (Extra-Strength)
Pierce, Rockford, IL, USA, #66380
2.2.5
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Probenpuffer 5x
250 mM Tris (SIGMA – Aldrich), 10 % Sodium Dodecylsulfat
(GERBU Biotechnik, Gaiberg, Deutschland, #1113), 0,5 %
Bromphenolblau (SIGMA – Aldrich, Steinheim, Deutschland,
#B 5525), 50 % Glycerol (SIGMA – Aldrich, Steinheim,
Deutschland #G5516), 500 mM Dithiothreit (ROTH, Karlsruhe,
Deutschland, #6908.1)
Acrylamid 4 K Lösung 30 % AppliChem, Darmstadt, Deutschland, #1672
TEMED Lösung
N-,N-,N-,N-Tetramethylethylendiamin
AppliChem, Darmstadt, Deutschland, #1148
APS
Ammoniumpersulfat
Deutschland, #A-7460)
(SIGMA
–
Aldrich,
Steinheim,
MATERIALIEN
38
1,5 M Tris Puffer pH 8,8
0,5 M Tris Puffer pH 6,8
Elektrophoresepuffer
25 mM Tris (SIGMA –Aldrich), 190 mM Glycin (GERBU
Biotechnik, Gaiberg, Deutschland, #1023), 0,1 % SDS
(GERBU)
Protein Marker
Prestained Protein Marker Broad Range
New England Biolabs, Frankfurt, Deutschland, #7708
Fertiggele
Ready Gel, BIO-RAD, Hercules, CA, USA
12% Tris-HCl, #161-1120
4 – 20 % Tris-HCl, #161-1177
2.2.6
Coomassie-Färbung und Silberfärbung von SDS-PAGE-Gelen
Bio-Safe Coomassie
BIO-RAD, Hercules, CA, USA, #161-0786
BioRad Silver Stain Plus
BIO-RAD, #161-0449
2.2.7
Western-Blot
5x Towbin Puffer
125 mM Tris (SIGMA - Aldrich), 960 mM Glycin (GERBU
Biotechnik), 1 ml 10 % SDS (GERBU)
1x Towbin Puffer
700 ml H2O, 200 ml 5x Towbin Puffer, 100 ml Methanol
(MERCK, Darmstadt, Deutschland, #106007)
Gold Färbung
Colloidal Gold Total Protein Stain
BIO-RAD, Hercules, CA, USA, #170-6527
MATERIALIEN
2.2.8
39
Immunfärbung der geblotteten Proteine
PBS-Tween
PBS mit 0,2 % Tween 20 (ROTH, Karlsruhe, Deutschland,
#9127.1)
Blockpuffer
PBS-Tween mit 1% BSA Albumin Bovine Fraction V (SERVA
Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland, #11930)
Anti-His6-HRP-Antikörper Roche, Mannheim, Deutschland, #1965085
Chemilumineszenz-Substrat SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate
Pierce, Rockford, IL, USA, #34080
2.2.9
Protein-Konzentrations-Bestimmung
Absorptionsmessung bei - = 280 nm
Die Protein-Konzentrations-Bestimmung mittels Photometrie erforderte keine speziellen
Materialien.
BCA Protein-Assay
BCA Protein Assay Kit
Pierce, Rockford, IL, USA, #23225
BSA-Standard-Lösungen
arithmetische Verdünnungsreihe von bovinem Serumalbumin
(SERVA,
Heidelberg,
Deutschland)
in
folgenden
Konzentrationen: 1500, 1000, 750, 500, 250, 125, 50, 25 µg/ml
MATERIALIEN
40
2.3
Materialien der funktionellen Testung
2.3.1
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
I-Domain-Peptid an
Sequenz: -KFGDPLGYEDVIPEADRC-
Ovalbumin gebunden.
PSL, Heidelberg, Deutschland, 2 µg/ml in Coating-Puffer.
Ovalbuminkontrolle
PSL, Heidelberg, Deutschland, 2µg/ml in Coating-Puffer.
Coating-Puffer
1,6
g/l
Na2CO3
#1.06392.0500),
3
(MERCK,
g/l
Darmstadt,
NaHCO3
(ROTH,
Deutschland,
Karlsruhe,
Deutschland, #8551.1), pH 9,6
Block Puffer
PBS, 1 % BSA
Wasch Puffer
PBS, 0,05 % (v/v) Tween 20 (ROTH, Karlsruhe, Deutschland)
Anti-His6-Antikörper
Penta -His Antibody
QIAGEN, Hilden, Deutschland, #34660
Sekundärantikörper
Goat-Anti-Mouse
TMB Peroxidase Substrat
Pierce, Rockford, IL, USA, #1854050
H2SO4
MERCK, Darmstadt, Deutschland, #1.00716.1000
2.3.2
Blutentnahme
S-Monovette 5 ml
enthält 0,5 ml Citratlösung
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland, #05.1071
Butterfly.-21
Abbott, Sligo, Ireland, #4492A05
MATERIALIEN
2.3.3
41
Isolierung von Monozyten aus Vollblut
Ficoll
Biochrom, Berlin, Deutschland
Medium
siehe Zellkultur
2.3.4
FACSanalysen
2.3.5
Messungen mit dem Durchflußzytometer (FACS)
Tyrode Puffe
s.u. 2.3.2.r
PMA
Phorbol-12-Myristate-13-Acetat, unspezifisches Zellstimulanz –
Sigma, St.Louis, MO, USA
CellFIX/
Fixationslöung
BD Biosciences, Erembodegem, Belgien, #340181
Anti-His(6)-FITC
1. FITC-gekoppelter Anti-His(6)-Antikörper
(Dianova, Hamburg, Deutschland, #Dia920)
2. Penta-His TM AlexaFluor 488Conjugate, (Quiagen, Hilden,
Deutschland #35310)
Fibrinogen-Antikörper
WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Deutschland
CD11b Antikörper
DAKO Klon Lpm19C
Monozyten:
anti-CD14,PE-gekoppelterAntikörper(CoulterImmunotech,Hamburg, Deutschland)
CHO-Zellen:
anti-CD11b, PE-gekoppelter Antikörper ( Dako, Hamburg,
Deutschland)
anti-CD18
FITC-gekoppelter Antikörper (Coulter-Immunotech, Hamburg,
Deutschland)
MATERIALIEN
2.3.6
42
Zelladhäsion auf immobilisiertem Fibrinogen oder Heparin
PBS – Puffer
Dulbecco´s Phosphate Buffered Saline without Ca and Mg
Bio Whittaker Europe #BE17-515F
Triton X-100
Sigma-Aldrich #T-8787
NaOH
Roth #6771.1
Natrium-Acetat
Merck, Darmsatdt, #1.01539.0500
Posphatase-Substrat
PNP (p-Nitrophenyl Phosphat) 104 Sigma, St.Louis, MO, USA
#7H273R1
2.3.7
Immunpräzipitation
Protein L-Agarose
Sigma –Aldrich #3351
EZ-Link NHS-Biotin
Pierce (#29217) [100mg in 5ml DMSO lösen, bei-20°Clagern]
Dulbecco’s
Bio Whittaker #BE17-513F
Phosphate Buffered Saline
[DPBS]
CD11b Antikörper
Lpm19C (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark, #MO741)
LysisPuffer
100mM Tris-HCl pH 8,0 (Carl Roth GmbH, Karlsruhe,
#9090.2), 150mM NaCl (Merck, Darmstadt, #1.06404.1000)
2mM MgCl2 (Sigma-Aldrich, #M8266)
1%Triton X-100 (Sigma-Aldrich, #T8787)
0,025% NaN3 (Sigma-Aldrich, Steinheim, #S8032)
1mM PMSF=Phenylmethylsulfonyl Fluorid (SigmaAldrich,Steinheim, #P7626), Proteaseinhibitor Cocktail (SigmaAldrich, #P8340).
Elutionspuffer
siehe 2.1.13
Neutralisationspuffer
siehe 2.1.13
MAN-1
METHODIK
43
3 Methodik
3.1
3.1.1
Methoden der gentechnischen Arbeiten
Kultivierung von E.coli in Medium
Das LB Medium wurde entsprechend den Angaben des Herstellers in ddH2O gelöst und für
15 min bei 121 °C autoklaviert. Anschließend wurde Ampicillin in einer Konzentration von
50 µg/ml addiert und das Medium bei 4 °C gelagert. Zum Herstellen einer Vorkultur wurden
zu 5 ml Medium sterilfiltrierte Glucose (Endkonzentration 0,1 M) hinzugegeben. Mit einer
sterilen Pipettenspitze wurde eine gepickte Einzelkolonie in das Medium überführt und bei 37
°C und 280 rpm für 8 h inkubiert.
Entsprechend den Anwendungen wurden verschiedene E.coli Kulturen in diversen Volumina
bei unterschiedlichen Temperaturen für eine entsprechende Zeit inkubiert.
3.1.2
Kultivierung von E.coli auf Agar
Zur Agar-Platten-Herstellung wurde LB Agar entsprechend den Angaben des Herstellers in
ddH2O gelöst und für 15 min bei 121 °C autoklaviert. Nach dem Abkühlen des Agars auf 50
°C wurde unter ständigem Rühren sterilfiltriertes Ampicillin in einer Konzentration von 50
µg/ml hinzugegeben. Je 30 ml wurden in sterile Petrischalen gegossen. Nach Aushärtung des
Agars wurden die Schalen bei 4 °C gelagert.
Mittels einer sterilen Impföse wurden die Bakterien einer Übernachtkultur ausgestrichen.
Nach einer Inkubationszeit von 16 h bei 37 °C
wurden die Platten mit deutlichen
Einzelkolonien bei 4 °C gelagert.
3.1.3
Glycerolstocks
Glycerolstocks erlauben es, Bakterienkulturen dauerhaft haltbar zu machen. Hierzu wurde zu
750 µl einer frischen stationären Bakterienkultur 250 µl steriles Glycerol pipettiert. Diese
Mischung wurde schockgefroren (in Ethanol mit Trockeneis) und dann bei – 80 °C gelagert.
METHODIK
3.1.4
44
Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli
Zur Präparation und Purifikation von Plasmid-DNA aus E.coli wurden die entsprechenden
Protokolle und Systeme der Fa. QIAGEN (Hilden) verwendet. Die Methode basiert auf der
alkalischen Lyse der Bakterien mit Extraktion der DNA und ihrer Bindung an eine SilikatMembran unter Bedingungen hoher Salzkonzentrationen und niederer pH-Werte (< 7,5).
Unter basischem pH und niederen Salzkonzentrationen kann die gebundene und gewaschene
DNA eluiert werden. Die Methode basiert auf dem Prinzip der Anionenaustauschchromatographie.
3.1.5
Agarose-Gel-Elektrophorese
Mit Hilfe der Agarose-Gel-Elektrophorese können DNA-Fragmente entsprechend ihrer Größe
aufgetrennt werden. Durch Variation des Agarose Gehaltes kann auf die aufzutrennenden
Fragmentgrößen Einfluss genommen werden.
Die Agarose wurde zu 0,5 – 3 % in TAE-Puffer gelöst, bis zur vollständigen Klärung
aufgekocht und in eine mit einem Kamm versehene Gelkammer gegossen. Nach
Polymerisation und Abkühlung wurde der Kamm aus dem nun festen Gel gezogen. In die
entstandenen Taschen wurden die mit 6xDNA-Ladepuffer versetzten DNA-Proben geladen.
Hierauf wurde das Gel bei 5 V/cm Elektrodenabstand laufen gelassen. Die negativ geladenen
DNA-Fragmente wurden bei ihrem Lauf in Richtung Anode entsprechend ihrer Größe und
Schwere aufgetrennt. Anschließend wurde das Gel 10 min in einem Ethidiumbromid-Bad
inkubiert. Ethidiumbromid interkaliert in der DNA und fluoresziert unter UV-Licht, so dass
auf diese Weise die DNA bezüglich ihrer Fragmente im Vergleich zu einem DNA-Marker
analysiert und präpariert werden konnte.
3.1.6
DNA-Restriktion
Der analytische Restriktionsverdau von DNA dient der Charakterisierung von Plasmiden.
Von präparativer Restriktion spricht man bei der Gewinnung von DNA-Fragmenten in
größerem Maßstab für die in vitro Rekombination neuer Plasmide. Unter Verwendung von
METHODIK
45
maximal 10% Restriktions-Endonukleasen unterschiedlicher Aktivitäten und Spezifitäten (je
nach Applikation) und exakt 10% enzymspezifischen 10 x Puffers wurde der Verdau bei
ebenfalls enzymspezifischen Temperaturen für 1 – 2 h inkubiert. Die Reaktionsbedingungen
folgten den Herstellerangaben. Der Restriktionsansatz wurde anschließend in einem
entsprechenden Agarose-Gel ausgewertet.
3.1.7
Gelelution von DNA-Fragmenten
Um gezielt verdaute DNA-Fragmente definierter Größe aus dem Agarose-Gel zu isolieren,
wurde das QIAGEN Gel-Aufreinigungs-Kit verwendet. Dabei wurde das selektiv exzidierte
Gelstück mit der Zielfragment-Bande zunächst durch Erhitzen bei 50 °C depolymerisiert. Die
darin enthaltene DNA (> 100 bp) bindet bei einem pH < 7,5 unter hohen Salzkonzentrationen
selektiv an die Silikat-Membran von Ionenaustauscher-Säulen. Gelöste Agarose und andere
Verunreinigungen werden nicht gebunden bzw. durch einen Waschschritt entfernt. Die
gereinigte DNA wurde anschließend unter basischem pH und niederen Salzkonzentrationen
von der Membran eluiert.
10000kDA
3000kDA
2000kDA
Marker
Broad
Range
Vektor
pHog
Vektor pexHAm+
Insert
Abb. 3.1: Vektor pHOG 21 und Vektor pexHam mit Insert, nach Verdau mit den Restriktionsenzymen NCO und
NOT1 aufgetragen auf Agarosegel 1%.
METHODIK
46
Abb.3.2: Dasselbe Gel nach Exzission des Inserts und des pHOG 21 Vektors zur anschließenden Gelelution und
Umklonierung.
3.1.8
DNA-Konzentrationsbestimmung
Die DNA-Konzentration einer Probe wurde photometrisch bestimmt. Dabei wurde die
wässrige DNA-Probe gegen eine Messung von Wasser abgeglichen. Die Messungen der
Absorption erfolgten bei den Wellenlängen -1 =2 60 nm und -2 = 280 nm. Bei 260 nm haben
Nukleinsäuren, bei 280 nm Proteine ihr Absorptionsmaximum. Eine optische Dichte von 1,0
bei einer Wellenlänge von 260 nm entspricht ungefähr einer DNA-Konzentration von 50
mg/ml, einer RNA-Konzentration von 40 mg/ml und einer Oligonukleotidkonzentration von
30 mg/ml. Die Messung bei 280 nm dient der Detektion von eventuellen Verunreinigungen
durch Proteine.
3.1.9
Dephosphorylierung
Um die Ausbeute an Produkten der Ligation von Vektor und Insert zu erhöhen, wurden die
5´-terminalen Phosphatgruppen des Vektors (nur des Vektors!) mit Hilfe des Enzyms
Alkalische Phosphatase (CIP = calf intestine phosphatase) abgespalten. Der Vektor wird an
der Religation gehindert, da hierbei die veresternde Kondensation zwischen den 5´Phosphatgruppen und den 3´-Hydroxylgruppen nicht mehr stattfindet. Für die Ligation
zwischen Insert und Vektor stehen die nicht behandelten 5´-Termini des Inserts zur
Verfügung. Die Präferenz des Inserts als Ligationspartner für den Vektor wurde zusätzlich
durch einen molaren Überschuss an Insert im Ligationsansatz verstärkt.
METHODIK
47
CIP arbeitet in praktisch jedem Puffer, inklusive allen gängigen Restriktionspuffern. Die
Dephosphorylierung erfolgte durch Addition von 1 µl CIP zum Restriktionsansatz des
Vektors. Inaktiviert wurde die alkalische Phosphatase durch Gelelektrophorese.
3.1.10
DNA-Ligation
Mittels der T4-DNA-Ligase wurden die präparierten und aufgereinigten DNA-Fragmente
ligiert. Zu diesem Zweck wurde das Rapid-DNA-Ligation-Kit der Firma ROCHE benutzt. 50
ng Vektor und 150 ng Insert wurden in 10 µl DNA-Dilutions-Puffer verdünnt und
anschließend mit 10 µl 2 x T4-Ligations-Puffer versetzt. Hierauf erfolgte die Addition von 1
µl T4-Ligase. Nach bereits 5 min Inkubation bei RT war die Ligationsreaktion abgeschlossen
und der Ansatz konnte sofort zur Transformation verwendet werden.
Zur Religationskontrolle wurde derselbe Ansatz, nur ohne Insert pipettiert.
3.1.11
Herstellung von Hitzeschock-kompetenten E.coli
5ml LB-Medium mit Glucose wurden mit TG-1 Bakterien versetzt und über Nacht bei 37°,
220rpm im Bakterienschüttler wachsen gelassen. Diese Vorkultur wurde in 500ml LBMedium mit Glucose überführt und bei 37°C, 220rpm bis zu einer OD600 von 0,5 wachsen
gelassen. Anschließend erfolgte 10min Kühlung auf Eis.
Die Suspension wurde bei 3750rpm, 4°C für 15min abzentrifugiert und dann in 250ml
Transformationspuffer resuspendiert. Nachdem wiederum 20min auf Eis gekühlt wurde,
erfolgte ein Zentrifugationsschritt (3750rpm, 4°C, 15min), und die Resuspension in 25ml
Transformationspuffer. Nach 40min auf Eis wurde die Lösung in 1,5ml Eppendorfgefäße
alliquotiert und in flüssigem Stickstoff schockgefrohren. Die Lagerung erfolgte bei –70°C.
3.1.12
Bakterien-Transformation und Selektion eines Plasmid-positiven Klons
500 µl Hitzeschock-kompetente E.coli wurden vorsichtig auf Eis aufgetaut. 100 µl dieser
Suspension wurden mit der Plasmid-DNA für 30 min auf Eis inkubiert. Danach wurde diese
Suspension für 60 sec einer Temperatur von 42 °C ausgesetzt. Durch den Hitzeschock wird
die Bakterienmembran für die Plasmid-DNA durchlässiger, welche nun aufgenommen wird.
METHODIK
48
Nach 2 min Inkubation auf Eis wurden 900 µl SOC Medium addiert und das Ganze 1 h bei 37
°C und 280 rpm geschüttelt. 50 – 100 µl transformierter Bakterien wurden auf Agarplatten
mit 50 µg/ml Ampicillin ausplattiert und über Nacht inkubiert. 5 – 10 Kolonien wurden am
folgenden Tag gepickt und in 5 ml LBAG-Medium kultiviert. Nach Aufreinigung der
Plasmid-DNA mit Hilfe des wurde diese sequenziert. Diese Arbeit wurde von der Firma
Medigenomix durchgeführt.
Für den in dieser Arbeit benutzten und später näher beschriebenen Vektor pHog21 wurden
folgende Sequenzierungsprimer verwendet:
Forward Primer PRO1: 5´-CTT TCC AGA CGT TAG TAA ATG-3´
Backward Primer HOGA: 5´-GGT CGA CGT TAA CCG ACA AAC-3´
Die Sequenzierungsdaten wurden mittels des Programms BLAST 2 mit der zu erwartenden
Sequenz verglichen und der beste Klon für die weiteren Versuche ausgewählt.
3.1.13
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR = Polymerase Chain Reaction)
Die in dieser Arbeit angewandte Mutations-PCR wurde nach einem etablierten
Standardprotokoll durchgeführt. Ziel war es, jeweils eine Aminosäure der CDR3-Region des
selektionierten Antikörpers auszutauschen, um anschließend, anhand Bindungsversuche, die
Relevanz, bzw. die Beteiligung dieser Aminosäure an der Bindung abschätzen zu können.
Dazu wurden Primer designt, die sowohl forward, als auch backward die CDR3 Region
überschneiden und zur Ursprungssequenz komplementär sind, bis auf eine Base, die zu dem
Triplet der, für die auszutauschende Aminosäure kodierenden, Basen gehört. Diese wurde
ersetzt und die neue Base anhand einer Gen-Code-tabelle so gewählt, dass das neue Triplet für
Alanin codiert. Die Länge der Primer betrug zwischen 39 und 43 Basen.
Ursprungssequenz der CDR3:
-DFWGSSequenz der verwendeten Primer:
Mutation1: Apartat gegen Alanin (D-A):
Forward:
METHODIK
49
5’- GTA TTA TTG TGC TAG AGC TTT CTG GGG GAG CTA TGA CTA CTG G-3’
Reverse:
5’-CAT AGC TCC CCC AGA AAG CTC TAG CAC AAT AAT ACA CGG C-3’
Mutation2: Phenylalanin gegen Alanin (F-A):
Forward:
5’-TAT TGT GCT AGA GAT GCC TGG GGG AGC TAT GAC TAC TGG GGC-3’
Reverse:
5’-CAT AGC TCC CCC AGG CAT CTC TAG CAC AAT AAT ACA CGG CC-3’
Mutation3: Tryptophan gegen Alanin (W-A):
Forward:
5’-TGT GCT AGA GAT TTC GCG GGG AGC TAT GAC TAC TGG GGC-3’
Reverse:
5’-GTA GTC ATA GCT CCC CGC GAA ATC TCT AGC ACA ATA ATA CAC-3’
Mutation4: Glycin gegen Alanin (G-A):
Forward:
5’-GCT AGA GAT TTC TGG GCG AGC TAT GAC TAC TGG GGC CGG-3’
Reverse:
5’-GGT CAT CAG TAT CGA GCG GGT CTT TAG AGA TCG TGT TAT TAT-3’
Mutation5: Serin gegen Alanin (S-A)
Forward:
5’-GAT TTC TGG GGG GCC TAT GAC TAC TGG GGC CGG GGA ACC-3’
Reverse:
5’-CGG GGT CAT CAG TAT CCG GGG GGT CTT TAG AGA TCG TGT TAT-3’
Die Reaktionsansätze besaßen folgende Zusammensetzung in einem Reaktionsvolumen von
50 µl:
%& 3 U DNA Polymerase
%& 10µl PCR Puffer
%& 1,5 mM MgCl2
%&
200 µM von jeder dNTP, entspricht 1µl Roche dNTP-Mix
METHODIK
50
%& 1µl Primer1 Stock 100pmol/ml
%& 1µl Primer2
%&
0,3µl Template-DNA, Stock 50ng/µl
%& auf 50µl µl mit Aqua bidest. aufgefüllt
Die Temperatur-Zyklen wurden mit folgendem Temperatur-Zeit-Profil durchlaufen:
%& 5 min Denaturieren bei 94 °C
%& 20 Zyklen:
-
45 sek. 95 °C ! Denaturierung
-
45sek. 52 °C ! Annealing
-
10 min 72 °C ! Extension
%& 5 min Endextension bei 72 °C
%& Abkühlen auf 4 °C
Anschließend wurde zu den Reaktionsansätzen 1µl DPN-1 hinzugegeben und die
ursprüngliche DNA bei 37°C eine Stunde verdaut. Dann wurden kompetente TG-1 Bakterien
mit der mutierten DNA transformiert.
3.1.14
Herstellung einer natürlichen Phagen-Bibliothek
Die Phagen-Bibliothek wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Affimed
Therapeutics, Heidelberg, Deutschland.
Auf die Einzelheiten der aufwendigen Konstruktion einer solchen Bibliothek kann im
Rahmen dieser Arbeit nicht in Detail eingegangen werden. Es wird daher auf einschlägige
Literatur verwiesen (Little 1999).
Es wurde mit zwei verschiedenen Typen von Bibliotheken gearbeitet, einer natürlichen und
einer synthetischen Bibliothek.
Zur Herstellung der natürlichen Bibliothek wurden aus peripheren Blutlymphozyten fünf
gesunder Spender und aus Milzbiopsien sechs weiterer Spender die mRNA mit Hilfe einem
Satz speziell angefertigter PCR-Primer in cDNA umgeschrieben. Die variablen Regionen der
schweren und leichten Kette wurden getrennt amplifiziert. Mittels eines homologen Set
Primer wurden sie reamplifiziert, wobei
Restriktionsschnittstellen für die anschließende
METHODIK
51
Klonierung in das Phagemid pEXHAM1 angehängt wurden. Damit hat man die Information
für eine schier unbegrenzte Zahl von Antikörpergenen ins Reagenzglas überführt. Aufgrund
der Neukombination der schweren und leichten Ketten entsteht kaum ein identisches
Antikörperfragment.
Zur Erzeugung synthetischer Bibliotheken mit multipel randomissierten Sequenzen wurde
eine overlap-PCR eingesetzt, allerdings wurden dabei als Bausteine nicht Mononucleotide
sondern Trinucleotide benutzt, da man somit zufällige Stoppcodone innerhalb der CDR3Region vermeidet. Bei Klonen aus synthetischen Bibliotheken ist darauf zu achten, dass die
variierten CDR3 Regionen in ein gleichartiges Framework eingefügt werden, deshalb kann
kein Screening amplifizierter Klone mit BSTN1-Verdau erfolgen.
Der Vektor pEXHAM1 enthält neben einem His6-Tag und einem Stop-Codon ein c-myc-Tag
zwischen dem neu durch Rekombination eingefügten single-chain Antikörper und dem pIIIGen (s. unten). Anschließend wurde das Phagemid in E. coli XL1 blue transformiert.
3.1.15
Phage-display durch oberflächenverankerte ScFv auf filamentösen Phagen
Die Selektion und Isolierung eines bestimmten ScFv wurde durch die Kopplung von Gen und
Genprodukt möglich. Dieses Selektionsprinzip wurde 1985 durch G.P. Smith auf filamentöse
Phagen übertragen. Diese bringen ihren Wirt E. coli nicht um, sondern verlangsamen
lediglich sein Wachstum auf die Hälfte. Während eines Zellzyklus setzt dabei jedes
Bakterium 100-200 Phagenpartikel frei.
Die Phagen sind sehr einfach aufgebaut. Das Genom besteht aus ca. 6500 bp, die von einem
Tubulus aus etwa 2700 Proteinen des Genprodukts pVIII umgeben ist. Als einzige zusätzliche
Bestandteile befinden sich je zusätzlich 5 Moleküle pVII und pIX an dem einen Ende und pIII
und pVI an dem anderen Ende des filamentösen Phagenpartikels. In pIII können fremde
Peptidsequenzen an unterschiedlichen Orten integriert werden, ohne dessen Funktion stark zu
beeinträchtigen. Damit sind Gen und Genprodukt physisch gekoppelt!
1990 wurde auf diese Weise zum ersten Mal ein ScFv in die pIII-Sequenz eingebaut und
somit auf der Phagenoberfläche präsentiert. Weil das pIII in jeder Replikationsrunde
exprimiert wird, da es für die Infektion der Phagen benötigt wird, wird das pIII-ScFvFusionsprotein zum Selektionsnachteil. Die Replikation der Phagen ist stark beeinträchtigt.
Umgangen wurde diese Problem durch die Verwendung von Phagemidvektoren. Ein
Phagemid ist ein ganz normales Plasmid, das eine zusätzliche Eigenschaft besitzt: es enthält
METHODIK
52
eine Sequenz aus dem Phagengenom, die alle Signale für die Verpackung in Phagenpartikel
enthält. Bei Anwesenheit eines Helferphagen, der alle anderen Funktionen des filamentösen
Phagen beisteuert, wird diese Phagemid-DNA in normale Phagenpartikel eingebaut.
Abb. 3.3. Phagemide sind Plasmide, die zusätzlich
ein Verpackungssignal der filamentösen Phagen
besitzen. In Anwesenheit eines Helferphagen wird
die Phagemid-DNA in Phagenpartikel eingebaut.
Wird dabei gleichzeitig das Fusionsprotein ScFvpIII induziert, so entstehen Phagenpartikel, die ein
Antikörperfragment auf der Oberfläche verankern.
(Rek. Ant.)
Auch in diesem Fall wird das wird der ScFv-pIII auf der Phagenoberfläche verankert. Im
Phagemid wird dieses Fusionsprotein jedoch nicht konstitutiv exprimiert, wie im obigen Fall,
sondern von außen regulierbar unter der Kontrolle eines induzierbaren Promoters. Damit wird
der Selektionsnachteil entscheidend gemildert.
3.1.16
Panning
Mit Hilfe des an der Oberfläche verankerten ScFv-Fragmentes können die Phagenpartikel an
ein immobilisiertes Antigen binden.
Zunächst wird die Antikörperbibliothek durch Zugabe eines Helferphagen in Phagenpartikel
verpackt. Um den Selektionsdruck gegen erfolgreiche Rekombinanten zu verhindern, wird die
METHODIK
53
Expression der an pIII fusionierten rekombinanten Antikörperfragmente dabei nur kurzzeitig
induziert und können so an „ihr“ Antigen binden. In einem ersten Schritt werden die nicht an
das Antigen bindenden Phagen weggewaschen. Im nächsten Schritt werden die gebundenen
Phagen durch sauren oder alkalischen pH oder mit Hilfe von Trypsin eluiert. Mit diesen
angereicherten Antikörper-Phagen können erneut Bakterien infiziert werden, die anschließend
die Phagenpartikel für die nächste Selektionsrunde produzieren. Man erreicht so die
gewünschte „klonale Selektion“.
Ein erster Hinweis, ob aus der Antikörperbibliothek isolierte Antikörperfragmente tatsächlich
binden, ergibt sich aus der Zahl der Phagenpartikel, die an dem immobilisierten Antigen
kleben bleiben. Nimmt diese durch Titrierung bestimmbare Zahl mit den Selektionsrunden zu
und bleiben an einem anderen Antigen sehr viel weniger Phagenpartikel kleben, so ist dies ein
gutes Zeichen für eine spezifische Bindung des Antikörper-Phagen an sein Antigen.
In dieser Arbeit wurde eine Strategie verwendet, um möglichst nur Phagen zu selektionieren,
welche ausschließlich gegen den aktivierten Zustand des CD11b/CD18 Rezeptors gerichtet
sind. Die erste Panning-Runde wurde auf aktivierten humanen Monozyten vollzogen. 1,8 x
1012 Phagen wurden zu 106 Monozyten in Tyrode Puffer addiert und 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Hierauf wurden die Monozyten abzentrifugiert (10 min, 1000g) und der Überstand
wurde mit frischen, durch 100nM PMA-stimulierten, gewaschenen Monozyten, für eine
weitere Stunde inkubiert. Danach wurden die Monozyten zweimal in HEPES-modifiziertem
Tyrode-Puffrer gewaschen. Die gebundenen Phagen wurden nun eluiert: Dies geschah durch
Zugabe von 0,1 M Glycin (pH = 2,2) für 15 min, gefolgt von einer Neutralisation mit 1/10
Volumen 2 M Tris HCl (pH = 8).
XL 1 Blue E. coli wurden mit den eluierten Phagen infiziert und auf Agar Platten (50 mM
Glucose, 10 +g/ml Ampicillin und 20 +g/ml Tetrazyklin) ausgestrichen. Die ausplattierten
Bakterien wurden resuspendiert und mit M13 KO7 Helferphagen infiziert. Die nach
anschließender Inkubation freigesetzten Phagen wurden mit PEG ausgefällt und für weitere
zwei Panning-Runden verwendet. Zur Depletion wurden letztere Phagen mit 2 x 107
CD11b/CD18 exprimierenden Wildtyp-CHO-Zellen inkubiert und zur Selektion mit CHOZellen, welche den aktivierten Rezeptor auf ihrer Oberfläche trugen. Die weiteren Schritte
wurden wie oben beschrieben durchgeführt.
METHODIK
54
Antikörper-DNA (PCR-Produkte)
Restriktionsverdau/Ligation in
Expressionsphagemide
Genbibliothek in pSEX
Verpackung in
Phagenpartikel
ScFvFragment
pIII
pSEX mit Antikörpergenen
3-5X
wiederholen
Test:
Titration
Affinitätsanreicherung an Antigen
(Screening)
Waschen,Elution,
Reinfektion in E.coli
Angereicherte Genbibliothek
Isolation von
Einzelklonen
Antikörperklon
Test: Antikörperscreening
durch FACS des
Periplasmaproduktes
Klonierung in einen
Produktionsvektor (pHog)
Rekombinantes monoklonales
Antikörperfragment
Abb. 3.4: Selektion/Panning von Antikörpern aus Phagenbibliotheken: Prinzip des
Phagendisplays.
Zur anschließenden Expression der so erhaltenen spezifischen ScFv-Antikörper, wurden diese
aus dem pEXHAM1-Phagemid mittels der Restriktionsschnittstellen NcoI und NotI in den
METHODIK
55
Expressionsvektor pHog21 umkloniert. Die Ligationsprodukte wurden in TG1 E. coli
transformiert.
Die verwendeten Zellen:
Monozyten, Mac-1-Wildtypzellen, Mac-1-Deletionszellen, Chinese-Hamster-Ovary-Cells.
Die rekombinanten Mac-1-Zellen wurden mir freundlicherweise von meinem Vorgänger
Dawit Assefa zur Verfügung gestellt, der diese durch Transfektion der Rezeptoren in
chinesische Hamsterovarienzellen hergestellt hatte. Der Mac-1-Deletionstyp unterscheidet
sich vom Mac-1-Wildtyp durch eine GFFKR-Deletion, dieses entspricht der daueraktivierten,
hochaffinen Form des Rezeptors, wohingegen sich der Wildtyprezeptor wie die niedrigaffine
Form verhält.
Abb. 3.5 Der Mac-1-Wildtyp (WT) und der Mac-1-Deletionstyp (DEL). (von Dawit Assefa )
3.1.17
Screening der amplifizierten Klone/BSTN1-Verdau
Hierzu wurden 10 Kolonien von reinfizierten Bakterien von einer Agarplatte mit Glucose und
Ampicillin, nach einer Nacht Wachstum bei 37°C gepickt und jeweils in 5ml LB-Medium mit
Glucose und Ampicillin 4h bei 37°C wachsen lassen. Nach Abzentrifugation erfolgte eine
Isolierung der DNA mit dem QIAGEN Plasmid Mini Präp. Kit. Nun erfolgte ein
enzymatischer Verdau mit dem Restriktionsenzym BSTN1. Dazu wurde pro Ansatz
%& 1µl BSTN1
METHODIK
56
%& 1µl NEB II Puffer
%& 0,1µl BSA
%& 3µl DNA
%& 4,9µl Aqua dest. eingesetzt und bei 60°C eine Stunde verdaut.
Anschließend wurden 2µl/Ansatz Loading-Dye hinzugegeben, die Proben auf ein 3%
Agarosegel aufgetragen und in TAE Puffer 35min bei 100V aufgetrennt.
Nach 10min in Ethidiumbromid ließen sich im UV-Licht die Banden begutachten, die je nach
Bandenmuster eine Aussage darüber gaben, ob die gepickten Klone identisch oder
unterschiedlich waren und damit ob ein Klon angereichert wurde.
3.1.18
Kultur der Zellen
Die adhärent in Monolayern wachsenden Zellen werden in Plastik-Kulturflaschen kultiviert.
Alle Zellen werden in Brutschränken bei 37°C und 5% CO2-Begasung gehalten.
Zur Ablösung der Zellen von der Plastikfläche wird das alte Medium abpipettiert und die
Zellen mit 10ml PBS gewaschen. Dies wird wieder abpipettiert, und anschließend 5ml
Trypsin in die Flasche gegeben. Nach 5 Min Inkubationszeit bei 37°C im Brutschrank wird
das Trypsin durch FCS-haltiges Medium antagonisiert. Die Zellsuspension kann dann bei
1000 rpm für 5 Min zentrifugiert und in 10ml Zellmedium resuspendiert werden.
Zur
Bestimmung der Zellzahl werden die Zellen in einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer mit einer
Tiefe von 0,2 mm und einer Grundfläche von 0,0625 mm2 pro 16 Kleinquadrate gezählt. Um
die Zellen weiter zu kultivieren, werden in eine 75ml Zellkulturflasche 25ml Zellmedium
vorgelegt und ein Anteil der Zellsuspension hinzugegeben.
3.1.19
Einfrieren von Zellen
Zellen werden von Zellkulturflasche abgelöst und zentrifugiert (5 Min, 1000 rpm). Der
Überstand wird abpipettiert und das Pellet in Einfriermedium
(c) resuspendiert.
Die
METHODIK
57
Konzentration beträgt 5 x 106 Zellen/ml bis 1 x 107 Zellen/ml. Die Zellsuspension sollte dann
schnellstmöglich in kryogene Speicherbehältern aliquotiert und innerhalb von 5 Min im –
80°C Tiefkühlschrank eingefroren werden. Das Einfriermedium ist zusammengesetzt aus
DMEM, FCS und DMSO (Dimethylsulfoxide).
Beim Auftauen der Zellen wird der Behälter schnell im 37°C Wasserbad aufgetaut. 1ml der
eingefrorenen Zellen werden anschließend mit 10ml Auftaumedium ( entspricht Zellmedium
ohne Selektionszusätze und mit 20% FCS) vorsichtig gemischt. Nachdem die Zellen über
Nacht an die Kulturflasche adhäriert haben, werden die Zellen am nächsten Tag unter dem
Mikroskop überprüft und ein Mediumwechsel durchgeführt, um das zellschädliche DMSO
aus dem Medium zu beseitigen. Je nach Dichte werden die Zellen entweder noch länger in
Auftaumedium gehalten oder in Selektionsmedium überführt.
3.2
3.2.1
Methoden der proteinbiochemischen Arbeiten
Induktion der Proteinexpression
Expression
Die Antikörper wurden in TG1 E.coli exprimiert. Hierzu wurde morgens 1 frische Kolonie
von einer LBAG Agarplatte gepickt und in 500 ml LB Medium mit 50 µg/ml Ampicillin
überführt. Diese Kultur wurde für 16-20 h bei 28 °C und 200 rpm inkubiert. Durch Weglassen
der Glucose wurde die Expression der Fusionsproteine nicht mehr reprimiert.
3.2.2
Protein-Isolation
Zwei Isolations-Methoden kamen zum Einsatz:
3.2.2.1
Periplasma-Präparation
Hierdurch sollen nur die periplasmatisch exprimierten Proteine des Bakteriums isoliert
werden. DieseMethode wurde vor allem in der Screeningphase verwendet. Als Vorteilhaft ist,
METHODIK
58
dass man bereits mit dem Periplasmaprodukt erste funktionelle Testungen vornehmen kann
und sich somit, falls ein Klon nicht die gewünschten Eigenschaften zeigt, den Arbeitsschritt
der Aufreinigung spart. Außerdem lassen sich, Fehlerquellen bei der Aufreinigung besser
identifizieren, falls diese nicht gelingen sollte.
500 ml induzierter Bakterienkultur wurden 10 min bei 5500 rpm und 4 °C abzentrifugiert.
Das Pellet wurde in 25 ml eiskaltem Periplasma-Schock-Puffer resuspendiert und 1 h bei
starkem Schütteln und gelegentlichem Vortexen inkubiert. Nach 30 min Zentrifugation bei
30000 g wurde der überstand über Nacht gegen Lysis-Puffer dialysiert.
3.2.2.2
BugBuster (Novagen) Präparation
Mittels der BugBuster Lösung werden sowohl periplasmatische als auch zytoplasmatische
Proteine isoliert. Hierbei wird das Bakterienpellet in 5 ml/g Pellet-Naßgewicht resuspendiert
und für 10-15 min bei RT leicht geschüttelt. Anschließend wird der durch 20 min
Zentrifugation bei 30000g gewonnene überstand sofort (ohne Dialyse) aufgereinigt.
3.2.3
Protein-Aufreinigung durch Ni 2+ -Affinitätschromatographie
Die vom Vektor pHog21 exprimierten Proteine tragen an ihrem C-terminalen Ende ein His6Tag. Oligo-Histidin-Peptide können mit hoher Affinität an Ni-, Cu- oder Zn-Ionen binden.
Werden solche divalente Kationen an immobilisierten Chelaten gebunden, ermöglichen sie
eine chromatographische Anreicherung von Proteinen, die ein Tag aus 3 – 6 Histidinen tragen
(Sulkowski 1985). Diese Bindung kann bei nahezu neutralem pH durch einen Überschuß an
Imidazol gelöst werden, welches danach durch Dialyse entfernt wird. Diese Methode,
abgekürzt IMAC (immobilised metal affinity chromatography), war früher schon für die
Anreicherung verschiedener Fusionsproteine aus E.coli eingesetzt worden und verbreitete sich
sehr schnell als Standardmethode für die Reinigung ScFv-Fragmenten (Skerra 1991); Dubel
et al. 1992).
Hierzu wurden zu dem Periplasma-Dialysat oder dem BugBuster-Überstand jeweils 0,5 – 2
ml Ni2+-NTA-Agarose pipettiert. Darauf folgte eine Schüttelinkubation bei 4 °C für 1 – 2 h,
so dass die Fusionsproteine vollständig binden konnten. Anschließend wurde die Agarose mit
METHODIK
59
Wasch-Puffer gewaschen. Die etwas höhere Konzentration an Imidazol im Wasch-Puffer
erlaubt, möglichst viele unspezifisch bindenden Proteine zu verdrängen. Nur solche
Konstrukte mit einem His6-Tag bleiben an der Ni2+-NTA-Agarose hängen. Nachdem diese
sich langsam abgesetzt hat, wurde der Überstand dekantiert und verworfen. Dieser WaschSchritt wurde 2 x wiederholt. Die Elution der Fusionsproteine wurde mit Elutionspuffer
vollführt. Nach dem erneuten Absetzen der Agarose befanden sich im Überstand die
gewünschten Proteine, welche sofort gegen PBS umdialysiert wurden.
Histidin
Peptidkette
Prinzip:
Ni2+ ist Elektronenakzeptor
(LEWIS-Säure), die Aminosäure ist
Elektronendonator (LEWIS-Base),
Kompetitor: Imidazol
z.B.
Orbitalmodell
Freie Orbitale für die Bindung
von Orbitalen anderer
Elktronenspender, z.B. der
Histidine
Abb. 3.6: Schematische Darstellung des Bindungsprinzip der Ni2+-NTA und Prinzip der kompetitiven Elution
durch Imidazol und als Orbitalmodell.
METHODIK
60
Dasselbe Verfahren wurde auch mit Ni2+-NTA Säulen durchgeführt, die mit Lysispuffer
äquilibriert wurden, dann das Periplasmadialysat aufgetragen wurde und nach 2
Waschschritten in mehreren Fraktionen eluiert wurde. Die Bakterienkultur (vor dem
Periplasmaschock), das Periplasmaprodukt, der Durchlauf durch die Säule beim Auftragen
des Periplasmaproduktes, die Waschschritte und die Elutionsfraktionen wurden gesammelt
und zur weiteren Analyse in der Gelelektrophorese mit anschließendem Westernblott
verwendet.
3.2.4
Dialyse
Zwei Methoden der Dialyse wurden in der vorgelegten Arbeit verwendet.
1. Größere Volumina von 25 – 100 ml, wie sie bei einer Periplasma-Präparation anfielen,
wurden mit den Spektra-Por.-Dialyse-Schläuchen durchgeführt. Hierzu wurde die
Flüssigkeit unter Vermeidung von Luftblasenbildung in die Schläuche gefüllt und mit
jeweils 2 Clips an beiden Enden verschlossen. Pufferwechsel fanden nach 2, 6, und
12 Stunden statt.
2. Kleinere Volumina von 500 – 3000 µl wurden in Slide-A-Lyzer. Dialyse Kassetten
eingefüllt. Die Dialyse war nach einmaligem Pufferwechsel nach 4 Stunden fertig.
3.2.5
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Mit Hilfe des SDS-PAGE lassen sich Proteine, nach Denaturierung durch SDS
(Natriumdodecylsulfat) und Erhitzen bei 95 °C, nach ihrem Molekulargewicht auftrennen und
auf dem Gel durch entsprechende Färbemethoden darstellen.
Je nach Bedarf kann die Acrylamidkonzentration zwischen 7,5% und 20% variieren, wobei
im Netzwerk des Polyacrylamids große Moleküle stärker retardiert werden als kleine. Bei
niedrigen Acrylamidkonzentrationen ist der molekulare Siebeffekt gering, womit eine
Trennung
aufgrund
des
Verhältnisses
von
Masse
zu
Ladung
gegenüber
einer
größenabhängigen Trennung überwiegt. Mit zunehmendem Gehalt an Polyacrylamid werden
kleinere
Proteine
stärker
aufgetrennt.
Zusätzlich
kann
die
Gelelektrophorese
in
nichtreduzierter und reduzierter Form durchgeführt werden. In letzterem Fall bewirkt die
METHODIK
61
Zugabe von "-Merkaptoethanol eine Spaltung der Disulfid-Brücken, so dass eventuelle
Untereinheiten eines Proteins darstellbar sind.
Die im folgenden angegebenen Mengen beziehen sich auf ein 12%iges Polyacrylamidgel der
Größe 8,6 cm x 6,8 cm x 1,0 mm.
Für das zuerst zu gießende Trenngel wurden 1,34 ml H2O, 1 ml 1,5 M Tris pH 8,8, 40 +l 10
% SDS, 20 +l APS-Lösung, 2 +l TEMED und 1,6 ml 30 % Acrylamid gemischt und zwischen
zwei Glasplatten gegossen. Direkt nach dem Gießen wurde das Gel mit H2O überschichtet.
Nach ca. 30 min war die Polymerisation des Trenngels abgeschlossen und das
Überschichtungswasser wurde abgegossen. Für das anschließende Sammelgel wurden 1 ml
H2O, 415 +l 0,5 M Tris, pH 6,8, 17 +l 10 % SDS, 8,3 +l APS-Lösung, 1,5 +l TEMED und
190 +l 30 % Acrylamid gemischt und zwischen die Glasplatten gegossen. Daraufhin wurden
die
Taschenkämme
aufgesteckt.
Nach
30
minütiger
Polymerisation
wurden
die
Taschenkämme gezogen und das Gel in Laufpuffer aufbewahrt.
Pro Geltasche wurden etwa 10 +l in 5x SDS-Puffer aufgenommene Proteine geladen. Die
Elektrophorese wurde bei 20 mA für 1 h in Elektrophoresepuffer durchgeführt.
3.2.6
Coomassie-Färbung von SDS-Polyacrylamid-Gelen
Zur Coomassie-Färbung der Proteine wurde das Gel für 1 h bei RT in Coomassie-Färbelösung
inkubiert und danach für 1 – 2 h in Wasser gewaschen. Durch mehrmaliges Wechseln des
Wassers wurde der unspezifisch, d.h. nicht an Protein gebundene Farbstoff entfernt. Die
angefärbten Proteinbanden erschienen blau. Das Gel konnte in Wasser gelagert und
photographiert werden.
3.2.7
Western-Blot
Beim Protein-Blotting wird die gelelektrophoretisch aufgetrennte Proteinmischung auf eine
proteinbindende Membran überführt und dort einer Nachweisreaktion unterzogen, die für
bestimmte Proteine der Mischung spezifisch ist oder sein soll. Das Blotten der getrennten
Proteine bietet dabei den Vorteil, dass die Membran als Trägermatrix viel einfacher zu
handhaben ist als ein Gel und die Proteine auf der Oberfläche der Membran isoliert sind.
METHODIK
Ursprünglich
62
wurde
die
Methode
dazu
entwickelt,
das
Molekulargewicht
eines
Proteinantigens zu bestimmen oder die Spezifität von Antikörpern gegenüber einem in einer
Proteinmischung befindlichen Antigens zu überprüfen (Towbin et al. 1979).
Der Transfer muss immer senkrecht zur Trennrichtung erfolgen, damit das Muster der
getrennten Proteine auf der Membran exakt dem Trennmuster des Gels entspricht. Zur
Durchführung des elektrophoretischen Transfers gibt es mit dem Wet- oder Semi-Dry-Blot
zwei Verfahren, die gleichberechtigt nebeneinander existieren. In der vorliegenden Arbeit
wurde ausschließlich das Wet-Blotting angewendet, auf welches näher eingegangen wird.
Unmittelbar nach Abschluss der Elektrophorese wurde das Gel 15 min in Towbin-Puffer
äquilibriert. Währenddessen wurde die PVDF-Membran auf die Größe des Gels zugeschnitten
und wie folgt vorbereitet: 20 sec in Methanol, 2 min in Wasser, 5 min in Towbin-Puffer. Der
Zusammenbau des Wet-Blots muss luftblasenfrei erfolgen und bestand aus folgenden
Schichten: Schwammtuch – Filterpapier – Gel – Membran – Filterpapier – Schwammtuch.
Anschließend wurde dieses Sandwich so in die Halteschienen der mit Towbin-Puffer
gefüllten Blot-Apparatur eingesetzt, dass die Membran zur Anode (+) und das Gel zur
Kathode (-) zeigt. Die Elektrophorese wurde 1,5 h bei 295 mA und 100 V im Kühlraum
durchgeführt.
Die Effizienz des Blot-Vorgangs konnte mit Hilfe von Färbereagenzien überprüft werden.
Weit verbreitet ist die Anfärbung mit kolloidalem Gold. Nach 5 – 10 min in der Lösung
ließen sich die Protein-Banden irreversibel rot darstellen. Die Membran wurde kurz mit
Wasser abgewaschen und konnte weiterverarbeitet werden.
3.2.8
Immunfärbung geblotteter Proteine
Vor Beginn der Nachweisreaktion bestimmter Proteine müssen Protein-Blots abgesättigt
werden. Dieses „Blocken“ dient dazu, überschüssige Proteinbindestellen der Membran
abzusättigen und eine unspezifische Bindung der Nachweisreagenzien zu verhindern. Dies
geschah über Nacht bei 4 °C in Block-Puffer.
Ist die Membran geblockt, erfolgt als eigentliche Nachweisreaktion die Bindung des
Antikörpers, in unserem Fall eines HRP-konjugierten Anti-His6-Tag-Antikörpers, an das
Zielprotein. Die Inkubationszeit betrug 1 – 2 h bei Raumtemperatur und der Antikörper war
1:5000 in 5 ml Block-Puffer verdünnt. Anschließend wurde die Membran 4 mal 10 min in
PBST-Puffer gewaschen. Um das geblottete Protein endgültig sichtbar zu machen, trägt der
METHODIK
63
Antikörper eine Enzymmarkierung zur indirekten Visualisierung. Dabei handelte es sich um
die Meerrettichperoxidase HRP. Bei Zugabe entsprechender Substrate liefert das Enzym ein
Licht emittierendes Produkt (Chemilumineszenz), welches am Ort seiner Entstehung Licht
ausstrahlt. Dokumentiert wurden die Signale mit Hilfe einer sehr sensitiven Kamera.
3.2.9
Protein-Konzentrations-Bestimmung
1. Absorptionsmessung bei - = 280 nm
Proteine besitzen ihr Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von - = 280 nm. Im
Vergleich dazu liegt das Absorptionsmaximum der Nukleinsäuren bei einer Wellenlänge von
260 nm. Über das Lambert-Beersche Absorptionsgesetz kann die Konzentration einer Probe
bestimmt werden. Als Näherung kann angenommen werden, dass eine OD280 nm = 1,0 einer
Proteinkonzentration von ca. 1,0 mg/ml entspricht.
2. BCA-Protein Assay nach Lowry
Der Assay wurde in Mikrotiterplatten durchgeführt. Es wurde eine arithmetische
Verdünnungsreihe eines BSA-Standards angelegt. Jeweils 25 µl der Standards und der Proben
unbekannter Konzentration wurden in Triplets in die Wells pipettiert. Hinzu addierte man 200
µl des kurz vorher angesetzten BCA-Protein-Reagenzes und inkubierte die Platte für 30 min
bei 37 °C. Anhand der BSA-Verdünnungen konnte dann eine Standardkurve erstellt werden,
auf der die optische Dichte bei -=562 nm gegen die Konzentration aufgetragen wurde. Aus
dieser Kurve konnten die Konzentrationen der Proben berechnet werden.
METHODIK
3.3
3.3.1
64
Methoden der funktionellen Testung
ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)
Diese Methode diente zum Nachweis der I-Domain Bindung des Antikörpers ScFv MAN-1.
Als Negativ-Kontrolle diente Ovalbumin, da das I-Domain-Peptid an Ovalbumin gebunden
war. Die Bindung des ScFv an das Peptid konnte mittels eines Primär- und eines HRPgelabelten Sekundärantikörpers nachgewiesen werden.
Die benutzten ELISA-Platten waren durch Röntgenstrahlen voraktiviert, d.h. sie trugen
vermehrt positive Ladungen. Deshalb erfolgte die Absorption des Antigens (I-Domain) in 0,1
M Na-Carbonatpuffer pH 9,6, da bei diesem pH die Säuregruppen des Peptids geladen
vorliegen, um so eine effektive Absorption an die Platte zu gewährleisten. Eine 96-WellELISA-Platte wurde abwechselnd mit den genannten Peptiden beschichtet. Hierzu wurden
jeweils 200 µl einer 20 µg/ml-Lösung des entsprechenden Antigens in Coating-Puffer pro
Well aufgetragen und die Platte bei 4 °C über Nacht inkubiert. Anschließend wurde sie
entleert und 5 mal mit PBST-Puffer gewaschen. Hierauf wurden zu jedem Well 300 µl BlockPuffer addiert und die Platte erneut für 2 h bei RT inkubiert. Nach Entleeren der Wells und
dreimaligem Waschen wurden die Proben und die Kontrollen aufgetragen und über Nacht bei
4 °C geschüttelt.
Die Aufteilung der Wells der Platte folgte folgendem Prinzip:
%& Negativ-Blank: Inkubation der Wells nur mit Substrat
%& Proben: Inkubation der I-Domain beschichteten Wells mit MAN-1, Primär- und
Sekundärantikörper und Substrat
%& Negativ-Kontrolle: Inkubation der Ovalbumin beschichteten Wells mit MAN-1,
Primär- und Sekundärantikörper und Substrat.
Am folgenden Morgen wurde die Platte 6 mal gewaschen, um unspezifisch gebundene
Proteine zu entfernen. Zum Nachweis der spezifischen Bindung des im Vektor pHog21
exprimierten ScFv Antikörpers MAN-1, wurde ein Anti-His6-Tag-ELISA durchgeführt.
METHODIK
65
Aufgetragen wurden je 100 µl einer 1:5000 in Inkubationspuffer diluierten Anti-His6-TagAntikörper-Lösung. Nach 2 h Inkubation bei RT wurden nach erneutem sechsmaligen
Waschen je 100 µl eines 1:2000 in Inkubationspuffer verdünnten Anti-Mouse-HRPKonjugats. Abschließend wurde die Platte sechsmal gewaschen und 100 +l TMB-Substrat
addiert. Nach 15-30 min wurde die Reaktion durch 100 +l 2M H2SO4 gestoppt. Die
Absorption wurde bei 450 nm gemessen.
3.3.2
Blutentnahme
Um eine Voraktivierung der Monozyten weitgehend zu verhindern, wurde die Blutentnahme
so schonend wie möglich durchgeführt. Nach Punktion einer gestauten Vene mit einer 21
Gauge Butterfly-Nadel wurde der Stau gelöst und die ersten 3 ml Blut verworfen. Hierauf
wurde die gewünschte Menge Heparin-Blut, bzw. Citrat-Blut für Monozytenaufreinigungen,
entnommen. Kontakt mit Glas, längeres Stehenlassen und Schütteln wurden vermieden. Auch
wurden die Proben nicht gekühlt, um die Leukozyten nicht zu deaktivieren.
3.3.3
Isolierung von Monozyten aus Vollblut
Die Monozyten wurden mittels eines Ficoll (Biochrom, Berlin, Deutschland) Gradienten
gewonnen. Dafür wurde das Vollblut zunächst 1:2 mit PBS verdünnt (Buffy Coats wurden
1:4 mit PBS verdünnt). In ein 50ml-Falcon-Röhrchen wurden unten 15ml Ficoll (Dichte
1,077) pipettiert und anschließend 20ml des verdünnten Blutes vorsichtig darüber geschichtet.
Das Röhrchen wurde bei 900g (2500-3000 rpm), 20 Min, Raumtemperatur und ohne Bremse
(diese zerstört den Gradienten) zentrifugiert.
Daraus resultierte ein Gradient mit den
Granulozyten und Erythrozyten unten, folgend das Ficoll und darüber in einer dünnen Schicht
die mononukleären Zellen (Monozyten und Lymphozyten). Als letzte Schicht lag oben das
Serum/Plasma und PBS auf.
Nun wurden vorsichtig und in kreisenden Bewegungen die mononukleären Zellen
abpipettiert. Anschließend wurden die Zellen mit gleichen Mengen von PBS verdünnt und
nochmals gut gemischt. Nach einer zweiten Zentrifugation (2500-3000 rpm, 20 Min, RT)
setzten sich die Zellen unten im Pellet ab. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 5ml
METHODIK
66
PBS resuspendiert und in Zelkulturmedium (siehe Tabelle oben) in Flaschen pipettiert. Die
aus 20ml Blut gewonnenen Monozyten passen in eine 75ml Flasche.
Vor Zentrifugation
Nach Zentrifugation
Pasteurpipette
Plasmaüberstand
Plasmaüberstand
Mononukleäre Zellen
Ficoll-Lösung
Granulozyten
Ficoll-Lösung
Abb. 3.7: Gewinnung von
isolierten Monozyten mit Hilfe
von Ficoll.
Erythrozytenhaltiges
Pellet
Um die Monozyten von den Lymphozyten zu trennen, wurden die Plastikkulturflaschen für 12 Stunden bei 37°C im Brutschrank gelagert. Die an die Plastikoberfläche adhärierenden
Monozyten konnten darauffolgend von den nicht-adhärenten Lymphozyten durch einen
Mediumwechsel separiert werden. Die Monozyten wurden dann von der Oberfläche
abgeschabt. Nach einer Zentrifugation (15 Min, 1000 rpm) wurden sie in PBS resuspendiert
und in der Zählkammer ausgezählt, um sie auf die gewünschte Zellzahl einzustellen.
3.3.4
FACS-Analysen
Fluorescence
Activated
Cell
Scan,
FACSCalibur, Heidelberg, Deutschland.
Durchflußzytometer:
Becton
Dickinson
METHODIK
67
Die Durchflußzytometrie ist ein Verfahren zur Zählung und Charakterisierung von Partikeln
in einem Flüssigkeitsstrom. Seit den ersten Versuchen von Wallace Coulter, der 1949 mit
seinem Patent „Wege für die Zählung von Partikeln, die in einer Lösung suspendiert sind“,
die Grundlagen schuf, und der Entwicklung des Prinzips der hydrodynamischen Fokussierung
durch van Villa waren es insbesondere die rasanten Fortschritte der Laser-und
Computertechnik, die das ermöglichten, was wir heute unter einem Durchflußzytometer
verstehen: Ein Instrument, das mit Geschwindigkeiten von über 5000 Partikeln pro Sekunde
bis zu sechs Parameter gleichzeitig analysieren und verarbeiten, und je nach Gerätetyp, auch
noch eine vordefinierte Fraktion aussortieren kann.
Durchflußzytometer arbeiten überwiegend mit optischen Meßprinzipien, und die Ergebnisse
beruhen auf einer gleichzeitigen Messung mehrerer physikalischer und biochemischer
Parameter von jeweils einer einzelnen Zelle.
Voraussetzung ist,
daß die Zellen als
Suspension von Einzelzellen vorliegen.
Das Anwendungsspektrum reicht von der Lymphozytentypisierung über Zellzyklusanalysen
bis
zu
funktionellen
Stoffwechslevorgängen.
Untersuchungen
wie
beispielsweise
intrazellulären
Diese Entwicklungen stammen im wesentlichen aus den
Laboratorien von Herzenberg (Stanford, USA, Charakterisierung und Isolierung von T- und
B-Lymphozyten), von Göhde und Dittrich (Münster, Zellproliferation), Kamentsky (Boston,
Identifikation von Tumorzellen) und von Valet und Kachel (München, Erarbeitung
multiparametrischer zellulärer Funktionsanalysen).
Abb. 3.8: FACSScan. (nach
Becton Dickinson
Immunocytometry Systems)
METHODIK
3.3.4.1
68
Physikalische Grundlagen:
Das Durchflußzytometer mißt optische Signale unterschiedlicher Qualität, wie Fluoreszenz
und Lichtstreuung.
Lichtstrahl.
Diese Signale entstehen beim Kontakt eines Partikels mit einem
Dazu werden die Zellen zu einem Analysepunkt geleitet, an dem sie vom
fokussierten Lichtstrahl einer Lichtquelle beleuchtet werden.
Jede Zelle wird einzeln
gemessen,
Summe
und
demnach
besteht
die
Analyse
aus
der
vieler
schnell
aufeinanderfolgender Einzelzellmessungen.
3.3.4.2
Lichtquelle
Voraussetzungen, die die Lichtquelle erfüllen muß:
%& Hohe Intensität, um ausreichend Fluoreszenz- und Streulichtsignale zu erzeugen.
%& Emissionsspektrum im Absorptionsbereich der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe.
%& Konstante Strahlungsleistung.
Diese Kriterien werden vom Laser erfüllt, der als Lichtquelle die weiteste Verbreitung
gefunden hat. Das Wort „LASER“ steht für „Light Amplification by Stimulated Emission of
Radiation“. Diese Lichtquelle ist folgendermaßen charakterisiert: Das emittierte Licht ist
%& Monochromatisch
%& Von hoher Energiedichte
%& Kohärent (Lichtwellen sind gleichphasig und von einheitlicher Amplitude)
Neben dem Vorteil der gezielten Anregung geeigneter Farbstoffe ist damit gleichzeitig der
Nachteil verbunden, daß die Auswahl von Fluorochromen auf die Emissionslinien des
eingestellten Lasers beschränkt ist. Hauptsächlich wird ein Argonlaser mit einer 488 nm
Emissionslinie benützt.
3.3.4.3
Fluoreszenz
Unter Fluoreszenz wird die rasch abklingende Lichtemission von Molekülen nach Absorption
energiereicher Strahlung verstanden.
METHODIK
69
Fluorochrome sind für die FACS-Analyse aber auch z.B. für die Fluoreszenzmikroskopie
verwendete fluoreszierende Farbstoffe.
Sie absorbieren Lichtenergie über einen
vergleichsweise weiten, für sie jeweils charakteristischen Wellenlängenbereich.
Energie hebt die Elektronen auf ein höheres Energieniveau.
Diese
Beim Rücksprung zum
Grundniveau emittiert das Elektron ein Photon. „Fluoreszenz“ ist die Bezeichnung dieses
Strahlenübergangs. Der Frequenzbereich, der eine fluoreszierende Verbindung anregen kann,
ist das für den Farbstoff charakteristische Anregungs- bzw. Exzitationsspektrum. Dieses
stimmt weitgehend mit dem Absorptionsspektrum überein.
Bei der Rückkehr zum
Grundniveau geht ein Teil der Energie in Form von Wärme verloren. Aus diesem Grund ist
das gebildete Licht (Emissionsspektrum) energieärmer und damit langwelliger als das
Anregungslicht.
In der vorliegenden Arbeit wurde mit zwei Fluorochromen gearbeitet:
%& FITC
bei 492nm angeregt, sein Absorptionsmaximum liegt somit nahe der Wellenlänge des
Argonlasers (488nm) des später zu besprechenden FACSscans. Das Emissionsmaximum
liegt bei 520nm. Die Nachteile von FITC (Fluoresceinisothiocyanate) sind eine schnelle
Ausbleichung unter Lichteinwirkung und eine mangelhafte Wirkung im sauren Milieu.
%& PE
R-Phycoerythrin gehört zur Familie der Phycobiliproteine, welche in Cyanobakterien und
eukaryonten Algen vorkommen. Es hat ein Molekulargewicht von 240 000 Da und drei
Absorptionsmaxima, nämlich bei 480, 546 und 565nm und kann mit dem Argonlaser bei 488
nm sehr gut angeregt werden. Das Emissionsspektrum von R-PE hat sein Maximum bei 578
nm. R-PE-Konjugate haben eine sehr hohe Sensitivität, die ca. 10fach höher als die von
Fluorescein-Konjugaten ist. R-PE-Konjugate sind weiterhin relativ unempfindlich bezüglich
des pH-Wertes und des Ionen-Milieus.
Für den Argonionenlaser sind nur Fluorochrome mit einem Exzitationsbereich um 488 nm
geeignet.
Auswahl von Farbstoffen, die in der Durchflußzytometrie eine häufige Verwendung gefunden
haben:
METHODIK
70
Spektralbereich des Filters
Farbe
Fluoreszenzmolekül
FL-1
515-545nm
grün
FITC (Fluoresceinisothiocyanate)
FL-2
620-666nm
orange
PE
(Phycoerythrine)
FL-3
640-666nm
rot
PI
(Propidium Jodid)
Alle drei Farbstoffe lassen sich bei 488 nm anregen.
3.3.4.4
Streulicht
Trifft ein Lichtstrahl auf eine Zelle, streut sie aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften
Licht mit unterschiedlicher Quantität und Qualität. Folgende Zelleigenschaften beeinflussen
die Lichtstreuung:
%& Querschnittsfläche
%& Refraktionsindex
%& Struktur der Membran
%& Intrazelluläre Bestandteile (Granula, Vakuolen)
Das Licht wird nicht in alle Richtungen gleichmäßig gestreut. Die Lichtstreuung ist am
größten im Kleinwinkelbereich (0-10°) des einfallenden Lichtstrahls ( Vorwärtsstreulicht,
Forward Angle Light Scatter, [FSC] ), ein geringerer Anteil des Lichts streut seitwärts (90°)
dazu ( Seitwärtsstreulicht, Side Scatter, [SSC]).
Streulicht
Sensitiv für
Information
Vorwärtsstreulicht
Querschnittsfläche
Zellgröße
Seitwärtsstreulicht
Refraktionsindex
Granularität
Membranfaltelung
Äußere Form
METHODIK
71
Mit Hilfe dieser beider Lichtstreuparameter lassen sich Lymphozyten, Monozyten und
neutrophile Granulozyten unterscheiden
Granulozyten
Monozyten
Lymphozyten
3.3.4.5
Abb.3.9: Differenzierung
von Zellen im FACSgerät.
Flüssigkeitssystem
Über eine Zuleitung drückt eine Pumpe kontinuierlich „Trägerflüssigkeit“ (bzw.
„Hüllstromflüssigkeit“) durch die Meßkammer und weiter in den Abfallbehälter.
Eine zweite Leitung transportiert die Zellen vom Proberöhrchen zur Meßkammer, in der sich
die beiden Leitungen vereinen.
Die Zellsuspension wird über ein Ansaugsystem in die
Meßkammer, eine Quarzküvette, transportiert. Das Ende der Stahlkapillare (zweite Leitung)
ist auf das Zentrum des Lumens der Küvette gerichtet. Unmittelbar nach Verlassen der
Kapillare erfaßt die laminar durch die Küvette strömende Trägerflüssigkeit die
Zellsuspension. So werden die Zellen einzeln wie Perlen an einer Perlenkette durch die
Meßzelle geschleust. Dieses Prinzip nennt man hydrostatische Fokussierung.
Der Meßpunkt ist der Ort, an dem der fokussierte Lichtstrahl auf die Zelle trifft.
3.3.4.6
Optisches System
Der Anregungsteil besteht aus dem Laserstrahl und den Prismen und Linsen, die den
Laserstrahl zu einem horizontal-elliptischen Durchmesser formen.
Der Detektionsteil besteht aus einem Bereich zur Messung des Vorwärtsstreulichts (axial zum
anregenden Laserstrahl) und einem Bereich (orthogonal dazu) für die Messung von
Seitwärtsstreulicht und Fluoreszenz.
METHODIK
72
Der Forwardscatter (FSC), das Signal, das proportional zur Zellgröße der angestrahlten
Zelle ist, wird entlang der Achse des Laserstrahls durch eine Linse aufgefangen und in einer
Photodiode in elektrischen Strom umgewandelt.
Das in 90° zur Achse des Laserstrahls reflektierte Licht wird durch mehrere Brewsterspiegel
aufgeteilt. Das sind Spiegel, die das Licht zum Teil durchlassen und zum Teil reflektieren.
Hier
trifft
die
Strahlung
auf
Photoröhren,
die
das
Seitwärtsstreulicht
(SSC=Sidewardscatter), einen Parameter für die Granularität der angestrahlten Zelle ist, und
die Fluoreszenzen messen und das Lichtsignal in ein elektrisches Signal umwandeln.
3.3.4.7
Signalumwandlung
Es existieren zwei verschiedene Systeme von Photodetektoren, die die optischen Signale in
elektrische Pulse umwandeln:
%&
Photodiode:
Erzeugt elektrische Spannung, sobald Photonen auf lichtsensitive
Photokathode treffen.
Anwendung: Messung intensiver Lichtsignale, z.B. Vorwärtslichtstreuung
%&
Photoröhren (PMT, Photonen Multiplier Tube):
Nach dem Auftreffen von
Elektronen emittiert die Photokathode Elektronen (Photoelektronen). Diese werden stark
beschleunigt und induzieren beim Auftreffen auf die Dynode die Freisetzung zahlreicher
Sekundärelektronen, die ihrerseits beschleunigt werden und auf die nächste Dynode treffen,
usw. Somit findet eine Vervielfachung des ursprünglich schwachen Signals statt.
Anwendung: schwache Fluoreszenz und Seitwärtsstreusignale
3.3.4.8
Digitalisierung
Die Auswertung der Messung erfolgt im Analog-Digital-Wandler (ADC).
Je nach der
Spannung des elektrischen Impulses (0-10, 23 V) jeder Einzelmessung, wird diese in einen
von meistens 1024 Kanälen, welche binär kodiert sind, klassifiziert. Die Nummer des Kanals
hängt also von der Spannung des Impulses und somit von der Intensität der Fluoreszenz
beziehungsweise des FSC oder SSC ab.
Für jede Zelle werden bis zu fünf binäre Codes, nämlich FSC, SSC und bis zu drei
Fluoreszenzen gespeichert. Diese Werte hängen von den Geräteinstellungen ab und sind
somit als relativ zu bewerten.
METHODIK
73
Die Geräteinstellungen werden vor der Messung festgesetzt. Die günstigsten Einstellungen
werden vor jeder Versuchsreihe durch Probemessungen mit Positiv- und Negativkontrollen
für jede Zellart und Antikörper-/Fluoreszenzfarbstoffsorte ermittelt. Zur Geräteeinstellung
gehören:
%&
Schwellenwert (Threshold)
Um Störsignale auszuschließen, kann eine elektronische Schwelle gesetzt werden; am besten
eignet sich hierfür das FSC-Signal, das Maß für die Zellgröße. Somit können z.B. sehr kleine
Partikel (Zelldebris) von der Messung ausgeschlossen werden.
%&
Detectors
Hier wir die Spannung (150-1000V) der PMTs für die Fluoreszenz-und für die SSC-Messung
und die Empfindlichkeit der Photodiode (E-1: entspricht 1/10 bis E03: entspricht der
1000fachen Empfindlichkeit) eingestellt.
%&
Verstärker
Man kann zwischen linearer und logarithmischer Verstärkung wählen:
Die
logarithmische Verstärkung eignet sich besonders für die Messung eher schwacher Impulse
und ist somit gut geeignet für Fluoreszenzmessungen und für die FSC- und SSC-Erfassung
von kleinen Zellen.
%&
Bei
Kompensation
Mehrfarbenfluoreszenzanalysen
tritt
häufig
das
Problem auf,
daß
sich
die
Fluoreszenzspektren der eingesetzten Fluorochrome so stark überlappen, daß sie sich durch
Lichtfilter nicht vollständig voneinander abtrennen lassen. So induziert beispielsweise FITC
auch schwache Signale im FL-2 Detektor.
Zur Korrektur der spektralen Überlappung wurde eine Kompensationselektronik entwickelt,
die
von
jedem
Signalpuls
den
durch
die
spektrale
Überlappung
verursachten
Fluoreszenzanteil subtrahiert.
Die Kompensation sollte vor der eigentlichen Messung eingestellt werden.
Wenn zwei
Fluoreszenzen gleichzeitig gemessen werden sollen, muß demnach FL-1:FL-2 (%) und FL2:FL-1 (%) festgelegt werden.
METHODIK
74
Wenn die Fluoreszenzintensität einer FL-1 positiven Population für FL-2 der negativen
Population entspricht und umgekehrt, ist die Einstellung richtig. Insbesondere FL-2:FL-1 muß
eine vergleichsweise hohen Prozentsatz aufweisen, da das Spektrum von FITC deutlich in das
von PE hineinreicht.
%&
Gating (Definieren von Auswertefenstern)
Es kann sinnvoll sein, vor der Messung den Meßbereich einzuschränken, also nur die
Eigenschaften einer bestimmten Zellpopulation zu messen. Dies ist durch Setzen eines Gates
möglich, d.h. einer Fläche im Dotplot oder ein Bereich im Histogramm.
Bei der weiteren Analyse finden nur solche Ereignisse Berücksichtigung, die innerhalb dieses
eingegrenzten Bereiches liegen.
Das Gerät mißt immer eine frei bestimmbare Zellzahl (z.B. 10 000 Zellen).
Eine Zellzählung ist unter normalen Bedingungen im FACScalibur® nicht möglich,
sondern nur mit dem FACSSorter®.
Das Gerät wurde wöchentlich, entsprechend der Herstellervorschrift, mit
fluoreszierenden Eichpartikeln (CaliBrite beads, Becton Dickinson, Heidelberg,
Deutschland) geeicht.
3.3.4.9
Auswertung
Für die Auswertung der gespeicherten Daten stehen im wesentlichen zwei Verfahren zur
Verfügung:
%&
Dotplot: Hier werden zwei Parameter gegeneinander aufgetragen, wobei jede einzelne
Zelle als ein Punkt dargestellt wird. Dies eignet sich besonders für die Darstellung von
FSC/SSC, wobei einzelne Zellpopulationen gut anhand ihrer Größe und/oder Granularität
abgegrenzt werden können.
%&
Histogramm: Hierbei wird die Häufigkeitsverteilung in einer probe dargestellt. Auf der
Y–Achse wird die Häufigkeit, welche von der Zahl der gemessenen Zellen abhängt, also nur
relativ ist, und auf der X-Achse die einzelnen Kanäle, entsprechend der relativen Fluoreszenz,
SSC oder FSC, aufgetragen. Für die weitere Auswertung kann man entweder den Mittelwert
METHODIK
75
(mean fluorescence) verwenden, welche aber insbesondere bei logarithmischen Messungen
sehr anfällig für Ausreißer ist, verwenden.
Oder man kann den Prozentsatz der Zellen
bestimmen, die einen bestimmten relativen Wert übersteigen.
Hierzu wird an der
Überschneidungsstelle zwischen Negativ- und Positivkontrolle ein Marker gesetzt.
3.3.5
Messungen mit dem Durchflusszytometer (FACS)
3.3.5.1
Präparationsmethoden für Vollblut
Wichtig ist die Verwendung von Heparinblut, da der Mac-1 Rezeptor Metallionenabhängig
aktivierbar ist. Somit behindern EDTA- als auch bei Citratblut die Aktivation. So wurde
EDTA-Blut teilweise auch als Negativkontrolle verwendet.
%& Vollblut (Heparinblut)
100µl
Falls Stimulation:
%& PMA
100nm
%& + Antikörper (Fluorochrom-konjugiert)
10µl
oder
%&
Primärantikörper unkonjugiert.
%& Vortexen
%& Inkubation
RT, Dunkelheit, 10 Min
%& Sekundärantikörper, z.B. Anti-HisTag
RT, Dunkelheit, 10 Min
Falls Doppelfärbung den
%& Zweiten konjugierter Antikörper ebenfalls
hinzugeben.
%& Erythrozytenlyse
+ FACSTM Lysing Solution (1:10 H2O)
%& Vortexen
%& RT, Dunkelheit, 10 Min
2 ml
METHODIK
76
%& Zentrifugation
RT, 250 x g (1000rpm), 5 Min
%& Überstand verwerfen, vortexen
%& 300µl CellFix (1:10 verdünnt) hinzugeben.
Probe mit dem FACS-Gerät messen.
3.3.5.2
Präparationsmethode für Zellen aus Zellkultur
%& Zellen gegebenfalls abtrypsinieren und mit PBS Zellzahl auf 6 Mio/ml einstellen.
%& Pro FACS-Röhrchen 50 µl dieser Zellösung pipettieren (entspricht 300 000 Zellen/Rohr).
%& Zugabe von 10 µl ScFv Antikörper mit HisTag(Zielkonzentration 5µg/ml), Inkubation für
10 Min bei RT.
%& Zugabe von 1µl Quiagen Penta-His-Antikörper (Antikörper gegen das HisTag des
Primärantikörpers), Fitc konjugiert. 10Min bei Raumtemperatur, abgedunkelt.
%& Zugabe von 300 µl 1fachem CellFix (10-faches CellFix mit ddH2O verdünnen).
3.3.5.3
Präparationsmethode für Monozyten
Aufreinigung der Monozyten nach Protokoll. Falls adhärent in Zellkulturflasche erfolgte beim
abschaben die Zugabe von EDTA für die Negativkontrolle um die Aktivation zu verhindern.
Alle weiteren Schritte entsprechen Präparationsmethode für Zellen aus Zellkultur.
3.3.5.4
Instrumenteneinstellung
Die Instrumenteneinstellungen für die FACS-Analyse wurden vor der eigentlichen Messung
ermittelt und bei Messbeginn nicht mehr verändert. Die Einstellungen konnten gespeichert
werden und für jede weitere Messung mit derselben Zellpopulation erneut benutzt werden.
METHODIK
77
CHO-Zellen
Detectors FSC-Treshold: 0
Kompensation:FL1-FL2: 0.0%
FSC:
E00
FL2-FL1: 0.0%
SSC:
372
FL-1:
396
FL-2:
462
SSC: lin 1.00
FL-3:
650
FL-1: log 1.00
Parameters:
FSC: lin 1.00
FL-2: log 1.00
Mac-1-WT
Detectors FSC-Treshold: 100
Kompensation:FL1-FL2: 0.0%
FSC:
E00
FL2-FL1: 0.0%
SSC:
409
FL-1:
450
FL-2:
460
SSC: lin 1.00
FL-3:
650
FL-1: log 1.00
Parameters:
FSC: lin 1.00
FL-2: log 1.00
Mac-1-Del
Detectors FSC-Treshold: 100
Kompensation:FL1-FL2: 0.0%
FSC:
E00
FL2-FL1: 0.0%
SSC:
409
FL-1:
450
FL-2:
460
SSC: lin 1.00
FL-3:
650
FL-1: log 1.00
Parameters:
FSC: lin 1.00
FL-2: log 1.00
3.3.5.5
Auswertung am FACS-Gerät
Um die Zellen, deren Rezeptorexpression gemessen werden sollte, wurde ein Gate gesetzt.
Die Zellen ließen sich anhand ihrer Größe und Granularität im Dot Plot erkennen und
markieren. Von den Zellen in diesem Gate wurde anschließend die Fluoreszenzintensität
anhand
der
konjugierten
Antikörper,
die
gebunden
hatten,
gemessen.
Eine
Fluoreszenzintensität >101 wurde als spezifische Fluoreszenz und nicht als unspezifische
Bindung des Antikörpers und somit Hintergrundsfluoreszenz angesehen.
METHODIK
3.3.6
78
Zelladhäsion auf immobilisiertem Fibrinogen oder Heparin
Die Adhäsion von Mac-1 exprimierenden CHO Zellen an auf Plastik immobilisiertem
Heparin und Fibrinogen wurde benutzt um die Möglichkeit einer Blockade derselbigen mit
einem durch Phagendisplay erzeugten Antikörper gegen diesen Rezeptor zu testen. Einerseits
ließ sich die Adhäsion durch mikroskopische Betrachtung, anderseits, objektiver, durch eine
Farbreaktion feststellen. Letztere beruhte auf dem Nachweis der in den Zellen vorhandenen
Phosphatase mit p-Nitrophenylphosphatin.
Vorgehensweise:
Beschichten der Platte:
%& Beschichtung einer 96-well Plate Platte mit 100 +l 100 U/ml Heparin in PBS, bzw.
20µg/ml Fibrinogen in PBS 50µl.
%& Über Nacht bei 4°C inkubieren.
Hauptversuch:
%& 2 mal mit PBS waschen (Zugabe von 100 +l PBS pro Well, Platte ausklopfen)
%& Blockade unspezifischer Bindungsstellen . Im Falle der Heparinplatten Zugabe von
100 +l 1 % BSA in PBS, die Fibrinogenansätze wurden mit 0.1 % Agaroselösung in
PBS geblockt, 30min-1h Inkubation bei RT.
%& Zellen abtrypsinieren, 2 mal in Tyrode waschen, auf 1,25 Mio. Zellen/ml (100000
Zellen pro Well) einstellen.
%& Vorinkubation der Zellen mit blockierendem Antikörperk LPM19c, bzw. MAN-1,
jeweils 10µg, 10 min bei RT
%& Platte 2 mal mit PBS waschen (Zugabe von 100 +l PBS, Platte ausklopfen)
%& Zellen auftragen: 100 +l der Zellsuspension/Well
%& 30min bis 1h Inkubation bei 37°C
%& Herunterwaschen nicht adhärenter Zellen mit der Multikanal-Pipette unter
mikroskopischer Kontrolle (4-8 Waschschritte)
%& Zugabe von 100 +l Färbereagenz pro Well ( 6 mg/ml PNP in 50 mM NaAc-Lösung ,
pH 5.0 + 1% Triton X100).
METHODIK
79
%& 1 h Inkubation bei 37°C im Inkubator.
%& Zugabe von 50 +l 1 M NaOH pro Well zum abstoppen der Reaktion.
%& Messung der Absorption im Photometer bei 405 nm Wellenlänge.
3.3.7
Immunpräzipitation
Vorbereitung:
Beladen der Protein L-Agarose nach Protokoll (50µl/Ansatz), dazu waschen mit 5fachem
Volumen DPBS, dann eine Stunde Inkubation mit Anti-HisTag Antikörper. Dabei werden die
Antikörper mit dem $-Anteil an die Agarose gebunden und das Paratop bleibt frei zur
Bindung des Histags. Weitere 50µl Protein L-Agarose wurden gewaschen und zur Präsorption
verwendet.
Die Präzipitation wurde mit Mononukleären Zellen durchgeführt, die nach Protokoll aus
Vollblut aufgereinigt wurden.
Anschließend wurden diese mit PMA stimuliert und einmal 20µg/ml MAN-1 vor der
anschließenden Lyse und in einem weiteren Ansatz MAN-1 nach der Lyse hinzugegebn.
Die Lyse erfolgte nach Abzentrifugation bei 3000rpm/10min in 1ml Lysispuffer.
Nun erfolgte die Präsorption, in dem zu den beiden Ansätzen jeweils 50µl gewaschene
Protein-L-Agarose hinzugegebn wurde und dann bei 4°C 1h schüttelnd inkubiert wurde. Nach
Zentrifugation in der Tischzentrifuge (800rpm/1min) wurde mit dem Überstand, der nun von
unspezifisch bindenden Stoffen befreit sein sollte, weitergearbeitet. Es erfolgte die Inkubation
mit 50µl der Protein-L-Agarose, an die der Sekundärantikörper gebunden war bei 4°C, 1h auf
dem Schüttler.
Es folgten 2 Waschschritte mit jeweils 1ml DPBS und abzentrifugation bei 800rpm, 1min.
Die Elution wurde mit 180µl Glycinpuffer 0,1M, pH=2 durchgeführt. Die Protein-L-Agarose
wurde abzentrifugiert, der Überstand in ein neuse Reaktionsgefäß überführt und mit je 20µl
2M Trisma-Base, pH=8 neutralisiert.
Je 15µl/Ansatz wurden mit 5µl denaturierendem Probenpuffer versetzt und bei 95°C 5min
denaturiert, anschließend eine SDS-Page durchgeführt und mit einer Silberfärbung gefärbt.
Gel: 12% Tris-HCl
Die erwarteten Zielbanden sollen bei 160KDa (CD11b), bzw. 98Kda (CD18) liegen. Zur
Identifikation
wurde
ein
entsprechender
Marker
auf
das
Gel
aufgetragen.
ERGEBNISSE
4
80
Ergebnisse
4.1
Ergebnisse der Antikörperselektion
4.1.1
Panningstrategie
Herstellung eines spezifischen single-chain Antikörpers gegen den aktivierten
Konformationszustand des CD11b/CD18 Rezeptors durch Phagen-Display.
Depletion
Selektion
Ohne PMA
Mit PMA
Erste Runde
auf
Monozyten
WT-Zellen
DEL-Zellen
Zweite Runde
auf Mac-1
exprimierenden
CHO-Zellen
Amplifikation
in E.coli
Dritte Runde
auf Mac-1
exprimierenden
CHO-Zellen
Abb. 4.1: Prinzip des Pannings zur Selektion aktivationsspezifischer ScFv-Antikörper: Dargestellt der
Wechsel nach der ersten Panningrunde von Monozyten auf CHO-Zellen. Der Depletionsschritt wurde
auf unaktivierten Monozyten, bzw. auf CHO-WT-Zellen (exprimieren den unaktivierten Mac-1-
ERGEBNISSE
81
Rezeptor) durchgeführt, der Selektionsschritt auf mit PMA stimulierten Monozyten, bzw. auf CHODEL-Zellen (exprimieren den aktivierten Mac-1-Rezeptor).
Zur Selektion von Phagen, welche ausschließlich gegen den aktivierten Zustand des
CD11b/CD18 Rezeptors gerichtet sind, wurde folgende Strategie angewandt:
1. Um unspezifische Bindung weitgehend zu verhindern, wurde ein Wasch-Puffer mit relativ
geringem pH verwendet (pH = 6,5) (Tur et al. 2001).
2. Die Panning-Serien wurden auf zwei unterschiedlichen Zellarten durchgeführt (die1.Runde
auf Monozyten, die Runden 2-4 auf CHO-Zellen).
3. Zur Depletion wurden die Phagen zuerst mit nicht-aktivierten Monozyten oder WT-CHOs
inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt wurden diese Zellen mit den gebundenen Phagen
verworfen. Nicht bindende Phagen wurden in den Selektionsansatz überführt.
4.Die Phagen die nun an die, mit PMA stimulierten Monozyten, bzw. an die CHO-DEL-
Zellen (exprimieren den aktivierten Mac-1-Rezeptor) banden, wurden eluiert und in die
nächste Panningrunde überführt.
Nach jeder Panningrunde wurden, nach der Reinfektion der Bakterien, diese auf
Agaroseplatten ausgestrichen und ausgezählt (siehe Abbildung), um zu überprüfen, ob eine
klonale Vermehrung stattgefunden hat, die zu einem exponentiellen Anstieg der Kolonien
Anzahl der Kolonien
führen würde.
10000
8000
1 .R und e
2 .R und e
3 .R und e
4 .R und e
6000
4000
2000
0
N+
S+
N+: Klone aus natürlicher Bibliothek.
S+: Klone aus synthetischer Bibliothek
Abb. 4.2: Anstieg der Kolonienzahl nach den einzelnen Panningrunden.
ERGEBNISSE
82
Nach der vierten Selektionsrunde erfolgte sowohl bei der synthetischen, als auch bei der
natürlichen Bibliothek ein explosiver Antieg der Kolonienzahl auf den Agarplatten,
stellvertretend für die Anreicherung einiger weniger Klone, die sich gegenüber nichtbindender Klone durchgesetzt hatten. Die Anzahl unspezifischer Klone wurde bis zu dieser
Runde stark durch die Depletionsschritte reduziert, so dass zur Reinfektion nun mehrere
identische Klone zur Verfügung standen, die nicht mehr depletiert wurden, in der vollen
Anzahl zur Selektion zur Verfügung standen und so zu dem in Abb.4.2. dargestellten
sprunghaften Koloniezahlanstieg nach erneuter Reinfektion führten.
.
4.1.2
Screening der Klone durch BSTN1-Verdau
Nach dieser explosiven Vermehrung der Klone nach der 4. Selektionsrunde wurde eine
BSTN1-Verdau der Klone aus der natürlichen Bibliothek durchgeführt, um festzustellen, ob
sich ein Klon dieser Bibliothek signifikant anreichern konnte. Dabei werden die Klone von
Agarplatten gepickt, in Medium wachsen gelassen und anschließend die Plasmid-DANN
aufgereinigt. Nun wird diese mit dem Restriktionsenzym BSTN1 unspezifisch verdaut. Je
nach Sequenzen des Frameworks der Antikörper ergeben sich Schnittstellen innerhalb der
DNA, die zu Fragmenten unterschiedlicher Größe führen. Diese ergeben ein, für den
jeweiligen Klon charakteristisches, Bandenmuster im Agarosegel.
Dieses Verfahren wurde vorerst mit 10 gepickten Klonen der 4. Panningrunde durchgeführt.
Marker
10000B
3000Bp
2000Bp
1500Bp
1000Bp
Klon: 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Abb. 4.3: BSTN1-Verdau von 10 willkürlich gepickten Klonen der Natürlichen Bibliothek nach
Reinfektion der Bakterien mit Phagen der 4. Panningrunde. Marker: SmartLadder; Bp: Basenpaare.
ERGEBNISSE
83
Hierbei zeigte sich, dass von 10 gepickten Klonen alle dasselbe Verdaumuster aufwiesen. Es
hatte sich ein Klon angereichert. Dies spricht dafür, dass die Selektion gelungen war, es
musste sich nun zeigen, ob ein Antikörper mit den gewünschten Eigenschaften selektioniert
wurde.
4.1.3
Sequenzen der CDR3 Region der amplifizierten Klone
Da die Klone der synthetischen Bibliothek alle dasselbe Framework besitzen, eignet sich in
diesem Falle der BSTN1-Verdau nicht zum Screening der Klone. Es wurden ebenfalls 10
Klone von Agaroseplatten gepickt und in 5ml Kulturmedium unter Selektionsdruck wachsen
gelassen, anschließend die Plasmid-DNA aufgereinigt und sequenziert. Hier hatten sich 2
Klone bis in diese Selektionsrunde durchgesetzt, im Folgenden MAS-1 und MAS-2 genannt.
MAS1
MAS2
MAN1
C A R D S T L A P - I V E F WG
C A K D - LWG F Q L F D Y WG
C A R D - FWG - - S Y D Y WG
Abb. 4.4: Die Sequenzen der HCDR3 Regionen der Synthetischen Klone MAS-1 und MAS-2;
(identische Regionen sind gleichfarbig dargestellt), dabei trat von 10 gepickten Klonen die Sequenz
MAS-1 viermal und die Sequenz MAS-2 sechsmal auf (Buchstaben Code der Aminosäuren siehe
Anhang) .
Dazu im Vergleich des Klons aus der Natürlichen Bibliothek, im Folgenden MAN-1 genannt.
HCDR1
LAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFIFRDYDMDWVRQAPGKGLEW
HCDR2
IGRSTKRTSSYTIQDAASVRGRVTISRDDSKNSLYLQMNSLKIEDTAVYYC
HCDR3
Linker
ARDFWGSYDYWGGTLVTVSSGSASAPTLKLEEGEFSEARVQPVLTQPPSV
LCDR1
LCDR2
SVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSVRPSGIPERF
LCDR3
SGSNSGNTATLTISRVEARDEADYYCQVWDSNTDHYVFGTGTKVTVLGQ
Histag
PKANPTVTLFPPSAAAGSHHHHHH*
Abb. 4.5: Die Sequenz des Klones MAN-1, mit farblicher Kennzeichnung der CDR Regionen.
ERGEBNISSE
84
Auffällig dabei, dass sowohl in der CDR3 des synthetischen Klons MAS-2, als auch in der
des Klons aus der natürlichen Bibliothek ein polares Tryptophan (W) zentral angeordnet ist,
umgeben von einem Glycin (G) und einem hydrophoben Phenylalanin (F). Diese
Amplifikation einer ähnlichen Sequenz ließ darauf schließen, dass das Epitop dieser
Antikörper sich ähnelt. Ob diese Anordnung und vor allem das Tryptophan eine
entscheidende Rolle bei der Epitopbindung spielt, sollten weitere Versuche zeigen. Es ließ
sich aber bereits vermuten, dass eine polare und sphärisch große Aminosäure wie Tryptophan
eine sehr großen Einfluß auf die Konformation und damit die Bindungseigenschaften des
Antikörpers, bzw. der variablen Bindungsregion haben würde.
4.2
Umklonierung und Aufreinigung der angereicherten Klone
In dem gewählten prokaryotischen Expressionssystem werden die gewünschten Antikörper in
den periplasmatischen Raum der Bakterien sezerniert. Aus diesem lassen sie sich z.B. mittels
Detergenzien freisetzen und mit Ni-Agarose-Affinitätschromatografie aufreinigen. Dabei
bindet das His-Tag der scFv-Antikörper als Elektronendonator an die Ni2+-NTA-Agarose als
Akzeptor.
Das für das Phagendisplay gewählte Sytem bestehend aus XL-1blue E.coli Bakterien und
pEXHAM-Vektor zeichnet sich durch eine hohe Transformationseffizienz der Bakterien und
das, für das Panning essentielle, pIII Protein des Vektors aus. Für die Aufreinigung der
Antikörper wurde ein effizienteres Sytem, bestehend aus einem TG-1 E.coli-Stamm und
einem pHog21-Vektor gewählt. Dazu wurden die codierenden Sequenzen aus dem pExhamVektor ausgeschnitten und in den pHog21-Vektor umkloniert und dann in TG-1 E.coli
transformiert. Der Vorteil dieses Bakterienstammes liegt in dem breiteren Periplasmaraum
und dem schnelleren Wachstum. Der Vektor pHog21 ermöglicht eine höhere Expression, da
keine überflüssigen Proteine mitexprimiert werden.
Nach Evaluation einer geeigneten Aufreinigungsmethode war die Ausbeute an aktivem
Protein sehr hoch. Aus einem Liter Bakterienkultur ließ sich innerhalb von 24 Stunden 1 – 2
mg an ScFv-Antikörper gewinnen.
Zunächst wurden die Antikörper mit dem im Methodikteil beschriebenen Periplasma-SchockPuffer-Verfahren aufgereinigt, um erste FACSanalysen mit dem Periplasmaprodukt
durchführen zu können. Nach Abschluß der Screening-Phase wurden die Bakterien mit einem
Detergenz lysiert (BugBuster-Verfahren) und aufgereinigt. Die Periplasmaschock-Präparation
ERGEBNISSE
85
wurde im weiteren Verlauf, auf Grund der geringeren Ausbeute und der Aufwendigkeit des
Verfahrens,
nicht
mehr
angewandt.
Während
das
BugBuster-Reagenz
zusätzlich
zytoplasmatische Proteine freisetzt, beschränkt sich der Periplasmaschock-Puffer auf das
osmotische Aufreißen des periplasmatischen Raumes. Folglich finden sich im Purifikat der
letzteren Methode viel weniger Fremdproteine, die Gesamtausbeute ist jedoch deutlich
geringer.
Sie
hat
jedoch
den
Vorteil,
dass
sich
ein
wesentlich
saubereres
Aufreinigungsprodukt eluieren lässt, wie die folgenden Abbildungen verdeutlichen, die die
Zwischenschritte einer BugBuster-Präparation im Vergleich zu einer Periplasma-Präparation
darstellen.
1
2
3
4
1
5
a.
2
3
4
5
b.
36
36
Abb. 4.6: Westen Blot Analyse zweier exemplarischer Aufreinigungen des MAN-1 Antikörpers a)
mit BugBuster, b) mit Periplasmaschock-Puffer. 1: Bakterienüberstand, 2: mit BugBuster oder
Periplasmaschockpuffer freigesetzte Proteine, 3: Überstand nach erfolgreicher Bindung der
Fusionsproteine an die Agaose, 4: Waschschritt, 5. Elution der agarosegebundenen Proteine
Mit dem Detergenz BugBuster erreichte man Proteingesamtmengen von ca. 1 – 2 mg aus
einem Liter Kultur, mit Periplasmaschock-Puffer immerhin noch 500 – 1000 µg. Die
Verunreinigungen der BugBuster Präparation wurden durch zwei zusätzliche Waschschritte
entfernt.
Zur Kontrolle der erfolgreichen Aufreinigung
wurden
das
Produkt,
sowie
alle
Zwischenschritte der Aufreinigung auf ein 5-20% Polyacrylamid-Gradientengel aufgetragen
und anschließend geblottet.
ERGEBNISSE
86
36kDA
Abb. 4.7a: Die einzelnen
Aufreinigungsschritte in
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
der Silberfärbung.
36kDA
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Abb. 4.7b: Blott der einzelnen Aufreinigungsschritte mit anschließender Anti-HisTag-HRP Färbung.
1: BroadRange Marker
2: Bakterienkultur
3: Überstand des 1. Zentrifugationsschrittes
4: BugBuster Lysat
5: Überstand nach Aufreinigung mit Ni-Agarose
6: Waschschritt1
7: Waschschritt2
8: Elution1
9: Elution2
ERGEBNISSE
87
Hier als Beispiel dargestellt die Aufreinigung des Klones MAN-1.
Die Silberfärbung zeigte erwartungsgemäß sehr proteinreiche Schmierbanden bei der, vor
dem ersten Zentrifugationschritt aufgetragenen, Bakterienkultur (Abbildung Bande 2, Bande
1 stellt den BroadRange Marker da), bei dem BugBuster Lysat (Bande 4), bei dem Überstand
nach absedimentieren der Ni-Agarose (Bande 5). Weniger Protein zeigte sich in den Proben
des Überstandes der Abzentrifugation der Bakterienkultur (Bande 3), des ersten und zweiten
Waschschrittes (Bande 6 und 7). Der 2. Waschschritt zeigt deutlich weniger Protein als der
erste und belegt deren Effektivität. Die aufgetragenen Proben der 2 Elutionsschritte (Bande 8
und 9) zeigten 2 saubere Zielbanden auf Höhe ~36kDA. Bei Anfärbung mit Anti-HisTag
Antikörper zeigte sich, dass sowohl im BugBuster Lysat, als auch in beiden
Elutionsprodukten der gesuchte Antikörper vorhanden war (im ersten Elutionsschritt
erwartungsgemäß in höherer Konzentration), geringsten Mengen auch noch im Überstand
nach Bindung an Ni2+-NTA-Agarose. In den Waschschritten und in der Zellkultur ist kaum
Antikörper nachweisbar. Letzteres weißt darauf hin, dass der Antikörper nicht ins Medium
sezerniert wurde; dies ist z. B. der Fall, wenn die Bakterienkultur überdicht ist und es zum
Absterben der Bakterien kommt.
4.3
4.3.1
FACSanalysen der selektionierten Antikörper
Bindung der selektionierten Klons MAN-1 auf CHO-Zellen
Da bereits im Periplasmaprodukt ausreichende Mengen Antikörper vorhanden sind, eignet es
sich zum Screening der Antikörper auf ihre Bindungsfähigkeit an Mac-1 exprimierende
Zellen. Hier zeigte sich bereits eine selektive Bindung an die CHO-DEL Zellen, die den
Rezeptor
in
seinem
aktivierten
Zustand
exprimieren.
Da
die
Selektionsschritte
(Panningrunden) 2-4 auf diesen Zellinien stattfanden, liefert dieses FACS eine Aussage über
mögliche Fehler im Panningkonzept, ob die Depletions- und Selektionsschritte zur
gewünschten Spezifität geführt haben. Es zeigte sich, dass die Depletionsschritte erfolgreich
unspezifisch bindende Antikörper ausselektioniert hatten.
ERGEBNISSE
88
ScFv Antikörper MAN-1 auf CHO-WT Zellen
ScFv-Antikörper MAN-1 auf CHO-DEL
Abb. 4.8: FACSanalyse des Periplasmaproduktes auf CHO, CHO-WT und CHO-DEL Zellen. Grau
dargestellt ist als Kontrolle die Bindung auf CHO-Zellen.
Der Antikörper, der schon in diesem ersten Vorversuch die erwartete Funktion zeigte, wurde
nun nach Aufreinigung mit Nickelagarose mit Hilfe eines BCA Assays die Konzentration
bestimmt um genauere Titrationen durchführen zu können. Dabei ließen sich, je nach
Eluatvolumen, Konzentrationen zwischen 1mg/ml und 2mg/ml erreichen.
4.3.2
Bindung des MAN-1 Antikörpers an Monozyten im Vollblut
Da der Antikörper größtenteils auf CHO-Zellen selektioniert wurde, sollte seine
Funktionalität und die Übertragbarkeit des Zellmodells auch durch Bindung an den
natürlichen CD11b/CD18 Rezeptor nachgewiesen werden.
Zunächst wurden mit Hilfe einer Doppelfärbung mit PE-konjugiertem CD14-Antikörper die
Monozyten identifiziert.
ERGEBNISSE
89
Abb.49: Nachweis der Bindung an Granulozyten und Monozyten. Doppelfärbung mit Anti-CD14 PE
markiert und ScFv Antikörper MAN-1 mit FITC markiertem Anti-His-Sekundär-Antikörper. Die linke
Abbildung zeigt, dass Zellen, die eine hohe Fluoreszenz 2 (PE: Anti-CD14 Antikörper) aufweisen,
gleichzeitig eine hohe Fluoreszenz 1 (FITC: ScFv MAN-1) aufweisen, d.h. dass MAN-1 an
Monozyten bindet, für die die Expression von CD14 charakteristisch ist. Entsprechend markiert (R1)
und farblich markiert (rot), lässt sich diese Zellpopulation auch im Dotblot links, in dem Forwardgegen Sideward-Scadder aufgetragen ist, identifizieren. Es ist deutlich erkennbar, dass die MAN-1
bindenden Zellen in dem langezogenen „Zellschweif“ liegen müssen, der für aktivierte Monozyten
charakteristisch ist. Eine etwas geringere Fluoreszenz 1 zeigt eine Zellwolke, die als R4 gegated und
dunkelblau markiert im rechten Dotblot als aktivierte Granulozyten zu identifizieren ist. Dies wurde
noch mit einem Cd66 Antikörper nachgewiesen (ohne Abbildung). Die unaktivierten Granulozyten
sind hellgründargestellt und im Gate R3 erfaßt. Sie binden MAN-1 nicht.
Dieser Vorversuch diente zur Identifikation der Zellen in den folgenden FACS-Analyse, falls
keine Doppelfärbung erfolgte.
Zur funktionellen Testung wurde Heparinblut verwendet, da sowohl Citrat als auch EDTA,
die üblicherweise als Gerinnungshemmer in Blutentnahme-Systemen dienen, durch die
Metallionenbindung die Aktivation der Integrine inhibieren. Heparin bindet selbst zwar auch
an den Mac-1 Rezeptor, aber inhibiert diesen erst in weitaus höheren Konzentrationen, so
dass von dieser Seite keine Ergebnisverfälschung zu erwarten ist.
Ein Teil des Blutes wurde mit einem unspezifischen Zellaktivator, dem Phorbolester PMA,
aktiviert und die Bindung des MAN-1 mit der an unaktivierte mononukleäre Zellen
verglichen.
ERGEBNISSE
90
ScFv Antikörper MAN-1 auf PMA-stimuliertem Blut
Unspezifischer scFv Antikörper
MAN-1-Bindung an unaktivierten mononukleären Zellen
MAN-1-Bindung an aktivierten mononukleären Zellen
Abb. 4.10: FACSanalyse der Bindung des Antikörpers an, durch CD14 Doppelfärbung identifizierte,
Monozyten im Vollblut, mit und ohne Stimulation.
Im FACS zeigte MAN-1 eine spezifische Bindung an aktivierte mononukleäre Zellen. Ohne
Aktivation zeigte der ScFv-Antikörper fast keine Bindung. Als Negativkontrolle wurde ein
ScFv Antikörper gegen eine anderes Integrin (GPIIb/IIIa) verwendet.
Dies belegte wiederum die erfolgreiche Selektion, aber auch die Übertragbarkeit des
Zellmodells, nämlich dass die DEL-Zellen Mac-1 Rezeptoren in Aktivationskonformation
exprimieren, die dem natürlichen, aktivierten Mac-1 entspricht.
4.3.3
Bindung der MAS Antikörper an Monozyten im Vollblut
Auf die Bindung an aktivierte Monozyten hin wurden in einem ähnlichen Versuchsaufbau, in
dem, statt Vollblut, aus Buffy-coat aufgereinigte Monozyten verwendet wurden, auch die
beiden angereicherten Klone aus der Synthetischen Antikörperbibliothek untersucht.
Nach Umklonierung und Aufreinigung wurde eine FACSanalyse der zwei Klone aus der
synthetischen Bibliothek MAS-1 und MAS-2 und des einen aus der natürlichen Bibliothek
MAN-1 durchgeführt, um die Bindungsverhalten auf aktivierten Monozyten zu vergleichen.
ERGEBNISSE
91
340
Mittlere Fluoreszenz
290
240
190
140
90
40
-10
MAN-1
MAS-1
MAS-2
Kontrolle
Jeweils [5µg/ml]
Abb. 4.11a: Vergleich des Bindungsverhaltens der ScFv Antikörper MAN-1, MAS-1 und MAS-2 in
der FACSanalyse. Werte der Mittleren Fluoreszenz jeweils nach Abzug der Negativkontrolle, definiert
durch die Mittlere Fluoreszenz der Bindung an unstimulierten Mononukleäre Zellen.
Als Ergebnis ließ sich festhalten, dass sowohl MAN-1, als auch MAS-1 aktivationsspezifisch
binden, MAS-2 hingegen nicht. Da MAN-1 in diesem Versuch der aussichtsreichste Klon zu
sein schien, wurde im Folgenden dieser Antikörper weiteren Testungen unterzogen.
Unspezifischer scFv-Antikörper
MAN-1-Bindung an stimulierte Monozyten
Abb. 4.11b: Bindung von MAN-1 an, aus Buffy-coat aufgereinigten und aktivierten Monozyten.
\
ERGEBNISSE
4.3.4
92
Bindung des MAN-1 Antikörpers an Granulozyten im Vollblut
Es wurden weitere FACSanalysen durchgeführt, die die Spezifität für mononkukleäre Zellen
weiter belegen sollen. Dazu wurden Granulozyten mit einer anti-Cd66b Färbung identifiziert
und in einem Gate für die Auswertung erfaßt, um die Bindung des Antikörpers zu
verdeutlichen
Auch Granulozyten zeigten nach Aktivation und MAN-1 Zugabe eine Zunahme der mittleren
Fluoreszenz. Dieses Ergebnis war so zu erwarten, da Mac-1 auch auf Granulozyten exprimiert
wird.
Kontrolle: Unspezifischer scFv Antikörper
MAN-1-Bindung an stimulierte Granulozyten
Abb. 4.12: FACSanalyse des Bindungsverhalten des MAN-1 Antikörpers auf Granulozyten.
4.3.5
Antikörpertitration
Nach Konzentrationsbestimmung im BCA-Assay, ließ sich eine Titrationskurve erstellen, in
der die Konzentrationen des ScFv-Antikörpers MAN-1 der entsprechenden mittleren
Fluoreszenz zugeordnet werden, um festzustellen, bei welchen Konzentrationen die maximale
Bindung erreicht wird. Dieser Versuch wurde mit Heparinblut und einer CD14
Doppelfärbung durchgeführt.
ERGEBNISSE
93
60
Mittlere Fluoreszenz
50
40
PMA stimuliert
30
unstimuliert
20
10
0
0,1
1
10
100
scFv Antikörper MAN-1 [µg/ml]
Abb. 4.13: Titration des MAN-1 Antikörpers.
Die Kurve zeigt bereits bei geringen Konzentrationen ab 1µg/ml aufwärts eine starke
Zunahme der mittleren Fluoreszenz. Die Sättigung tritt bereits bei 10-20µg/ml ein. Für
weitere Versuche wurde der Antikörper daraufhin in Konzentrationen von 5µg/ml eingesetzt.
Das Bindungsverhalten bei diesen extrem niedrigen Konzentrationen ist herausragend, in
Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz.
Ebenfalls dargestellt ist die fehlende Bindung des Antikörpers an unaktivierte mononukleäre
Zellen.
Dies ist wiederum ein deutlicher Beleg für die aktivationsspezifität des Antikörpers.
4.3.6
Inhibition des ScFv-Antikörpers
Zur genaueren Charakterisierung des Antikörpers wurde versucht seine Bindung
konzentrationsabhängig mit einem blockierenden CD11b Antikörper (Lpm19C) zu inhibieren.
Eine Blockade der Bindung ist ein Beleg dafür, dass sich das Epitop des MAN-1 Antikörpers
auf dem Mac-1 Rezeptor befindet.
Bereits geringe Konzentrationen des, vor dem ScFv-Antikörper hinzugegebenen, CD11b
Antikörper hemmen die Bindung deutlich; bei Konzentrationen von 40µg/ml tritt die
ERGEBNISSE
94
maximale Inhibition ein. Dies entspricht dem 8 fachen der Konzentration des ScFvAntikörpers [5µg/ml].
ScFv Antikörper MAN-1 [5µg/ml]
+ 20µg/ml / +30µg/ml / +40µg/ml CD11b Antikörper
Abb. 4.14: Inhibition der Bindung von MAN-1 mit einem blockierendem CD11b Antikörper
(Lpm19C).
Desweiteren wurde versucht mit dem ScFv-Antikörper die Bindung von Fibrinogen an den
aktivierten Mac-1 Rezeptor zu inhibieren. Das natürlich im Blutplasma vorhandene
Fibrinogen wurde durch einen FITC gelabelten Fibrinogenantikörper angefärbt, dessen
Fluoreszenz gemessen wurde. Dieser Versuch zeigte keine Inhibition des Antikörpers.
Zusammen mit den Ergebnissen der Adhäsionsversuche (siehe 4.3.8) entspricht dieses
Ergebnis der von Lishko et al. beobachteten Regulation der P2-C Bindungssequenz im
Fibrinogen, die erst durch Proteolyse oder Immobilisation auf Plastik aktiviert wird, und
somit die Bindung des löslichen Fibrinogens an den Mac-1 nur sehr gering ist. Die
Adhäsionsversuche zeigten hingegen eine deutliche Mac-1 Bindung an immobilisiertes
Fibrinogen (siehe 4.5).
Es wurden auch Inhibitionsversuche mit weiteren löslichen Liganden des Rezeptors
durchgeführt. Dazu gehörten: ICAM-1, iC3b und hochkonzentriertes Heparin.
Die genannten Liganden führten zu keiner Inhibition der MAN-1 Bindung. Dies lässt darauf
schließen, dass diese Liganden an einer anderen Stelle als der MAN-1 Antikörper binden.
Interessant ist dabei, dass iC3b an andere Bereiche des Rezeptors bindet, da bei einem
möglichen
Einsatz des Antikörpers im Rahmen der Atherosklerosetherapie immer die
immunsuppressive Wirkung einer Mac-1 Blockade im Auge behalten werden muß. Diese
Ligandeninhibitionsversuche liefern einen Hinweis darauf, dass die Liganden des Rezeptors,
die aus Bereichen der Immunantwort stammen, sich durch den Antikörper nicht inhibieren
lassen. Dies stimmt mit den Ergebnissen von Yalmanchili und Mitarbeitern überein, die
ERGEBNISSE
95
beschreiben, dass die I-Domäne, an die der MAN-1 Antikörper binden soll, für die Bindung
von iC3b an CD11b/CD18 nicht notwendig ist (Yalamanchili, Lu et al. 2000) (wohl aber eine
Rolle spielt, da die Maximalbindung nur bei vorhandener I-Domäne eintritt).
4.3.7
Nachweis der Metallionenabhängigkeit der Bindung
Bei gleichzeitiger Zugabe des Chelatbildners EDTA zeigte der ScFv-Antikörper MAN-1
keine Bindung an Mononukleäre Zellen, auch wenn gleichzeitig mit PMA stimuliert wurde.
Dies lässt sich mit der beschriebenen Metallionenabhängigkeit der Aktivierung des Rezeptors
erklären und kann als weiterer Beleg dafür, dass der Antikörper aktivationsabhängig an
CD11b/CD18 bindet, gewertet werden.
Unspezifischer scFV Antikörper
MAN-1-Bindung an stimulierte PMNs+EDTA
MAN-1-Bindung an stimulierte PMNs
Abb. 4.15: Nachweis der Metallionenabhängigkeit der Aktivierung und Bindung.
Die Möglichkeit der Bindungsinhibition durch EDTA ist eine exzellente Eigenschaft für
diagnostische Versuchsansätze, da sich somit eine ungewollte Aktivation vermeiden lässt
(z.B. für Negativkontrollen).
4.4
I-Domänen-ELISA
Im ELISA wurde die Bindung des Antikörpers an ein synthetisiertes Peptid getestet. Dieses
Peptid entsprach der Bindungssequenz für Fibrinogen innerhalb der I-Domäne (IDP: I-
ERGEBNISSE
96
Domänen-Peptid). Festzustellen galt, ob die Hauptligandenbindungsstelle des Integrins für
Fibrinogen auch das Epitop für MAN-1 beinhaltet. Als Kontrolle wurde, wie auch schon für
die FACS-Versuche, ein ScFv-Antikörper verwendet, der an ein anderes Integrin (GPIIb/IIIa)
bindet. Das IDP wurde an Ovalbumin gebunden und damit die ELISA-Platten beschichtet.
Als Negativkontrolle diente Ovalbumin ohne IDP.
p<0,01
0,6
0,5
OD405
0,4
0,3
IDP
Ovalbumin
0,2
0,1
0
4µg scFv Antikörper MAN-1
Unspezifischer scFv His-Tag-Antikörper
-0,1
Abb. 4.16: Bindung des ScFv-Antikörpers an das immobilisierte I-Domänen-Peptid (IDP) im ELISA.
Mit einem Anti-HisTag-Antikörper, und anschließender Inkubation mit einem Goat-antiMouse-HRP Antikörper, läßt sich, nach Zugabe des TMB-Substrates und Auswertung im
ELISA-Reader, eine deutliche Bindung des Antikörpers an das IDPeptid nachweisen, die
signifikant höher ist, als die Bindung an Ovalbumin alleine, bzw. die Bindung des
Kontrollantikörpers an das IDP. Damit ist nachgewiesen, dass MAN-1 an der I-Domäne des
aktivierten Mac-1 Rezeptors innerhalb der Bindesequenz für Fibrinogen bindet.
4.5
Funktionelle Testung mittels Adhäsionsassays
Liefern FACScan und ELISA Aussagen zur Charakterisierung und über die Eignung für
diagnostische Versuchsansätze, so stellen die Adhäsionsassays Versuche dar, die als
Grundlage möglicher therapeutischer Ansätze dienen könnten. Zu Grunde liegt die
ERGEBNISSE
Fragestellung,
97
ob
der
single-chain-Antikörper
effektiv
die
Bindung
von
Mac-1
exprimierenden Zellen an Liganden des Rezeptors inhibieren kann.
p<0,01
3
CHO
Del
2,5
OD562
2
1,5
1
0,5
0
ohne Antikörpe r
blockie re nde r Cd11b
Antikörpe r
scFv Antikörpe r MAN-1
unspe z ifische r
Antikörpe r
Abb.4.17: Bindung und Inhibition der Zellinien an Fibrinogen. MAN-1 und CD11b-Ab jeweils
[10µg/well].
p<0,01
3
CHO
DEL
2,5
OD562
2
1,5
1
0,5
0
ohne Antikörpe r
blockie re nde r CD11b
Antikörpe r
scFv Antikörpe r MAN-1
unspe z . Antikörpe r
Abb. 4.18: Bindung und Inhibition der Zellinien an Heparin. MAN-1 und CD11b-Ab jeweils
[10µg/well].
ERGEBNISSE
98
Die Adhäsion der Mac-1 exprimierenden CHO-Zelllinie auf Fibrinogen, bzw. Heparin
beschichtetem Plastik eier 96-Loch-Platte, welche photometrisch im ELISA-Reader anhand
der Farbreaktion eines saure Phosphatase-Substrates quantifiziert werden kann, wurde als
Modell zur Darstellung der Blockade des Rezeptors verwendet. Als Positivkontrolle diente
der CD11b Antikörper Lpm19C, als Negativkontrolle diente ein CD11b/CD18 unspezifischer
Antikörper.
Sowohl die Fibrinogen, als auch die Heparinbindung der Zellinien mit dem aktivierten
Rezeptor, ließ sich signifikant inhibieren. Dies sind interessante Voraussetzungen für einen
therapeutischen Einsatz des ScFv-Antikörpers, z.B. im Rahmen der Restenose Prophylaxe
nach PTCA.
4.6
4.6.1
Paratopmapping
Erzeugung von CDR3-Mutationen
Zur Charakterisierung des Paratops des MAN-1 Antikörpers wurden mit Hilfe einer
Mutations-PCR gezielt Mutationen innerhalb der CDR3 Region gesetzt. Nach Transformation
von TG-1 Bakterien mit dem neuen Plasmid, wurden die Plasmid-DNA der 5 Mutanten
isoliert und sequenziert zur Kontrolle der erfolgreichen Mutation.
MAN-1:
D-A:
F-A:
W-A:
G-A:
S-A:
-CARDF
-CARAF
-CARDA
-CARDF
-CARDF
-CARDF
WGSYDYWGSYDYWGSYDYA GSYDYWASYDYWGAYDY-
Alle 5 zeigten den gewünschten Austausch der ursprünglichen Aminosäure gegen ein Alanin.
Die Mutationen wurden nun gemäß Protokoll aufgereinigt und einer funktionellen Testung im
FACScan unterzogen.
ERGEBNISSE
4.6.2
99
FACSanalyse der CDR3-Mutationen
Die Versuche wurden sowohl an PMNs im aktivierten Vollblut, als auch an den DEL-Zellen
durchgeführt. Die Abbildung zeigt die Werte der mittleren Fluoreszenz, nach Abzug der
Fluoreszenz der Kontrolle. Diese war definiert durch die Mittlere Fluoreszenz der Bindung
an CHO-Zellen, bzw. an unaktivierte mononukleären Zellen.
Mittlere Fluoreszenz
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Unmutierte
CDR3
D-A
F-A
W-A
G-A
S-A
[5µg/ml]
Abb. 4.19: Bindung der CDR3 Mutationen auf Del-Zellen, nach Abzug der Negativ-Kontrolle,
definiert durch CHO-Zellen.
Mittlere Fluoreszenz
60
50
40
30
20
10
0
Unmutierte
CDR3
D-A
F-A
W-A
G-A
S-A
[5µg/ml]
Abb. 4.20: Bindung der CDR3 Mutationen an mononukleären Zellen im PMA stimulierten Vollblut,
nach Abzug der Negativ Kontrolle, definiert durch die Bindung an unstimulierte PMNs.Während die
Mutationen 1 (D gegen A) und 2 (F gegen A) nur etwas schwächer als MAN-1 an DELZellen binden, zeigt die 3. (W-A) und 4. (G-A) Mutation einen deutlichen Rückgang der
ERGEBNISSE
100
Mittleren Fluoreszenz und damit der Bindung. Die 5. Mutation (S-A) ähnelte im
Bindungsverhalten wieder der Ausgangssequenz des MAN-1-Antikörpers. Dies zeigt
deutlich, dass die CDR3-Region das Paratop des Antikörper gegen den Mac-1 Rezeptor ist.
Weiterhin verdeutlicht dieser Versuch die essentielle Funktion der polaren Aminosäure
Tryptophan im Zentrum der CDR3-Region. Dies erklärt auch, dass diese im Synthetischen
Klon 2 (MAS-2) amplifiziert wurde.
4.7
Immunpräzipitation
Die Immunpräzipitation ist ein Mittel zur Identifikation des Epitops des Antikörpers; kann
aber auch, wenn das Epitop bekannt ist, zur Aufreinigung desselben aus Gemischen oder
Lyseprodukten dienen.
Als Bindungssubstanz diente L-Agarose, die durch Bindung des $-Teiles von Ig-Antikörpern
deren Epitopbindung nicht inhibiert.
Es wurde in einem Ansatz der Antikörper vor der Lyse der Monozyten und in einem Ansatz
MAN-1 nach der Lyse der Monozyten hinzugegeben.
Um Verunreinigungen zu vermeiden, wurde eine Präsorption durchgeführt und vor der
abschließenden Elution mehrere Waschschritte. Zur Auswertung wurden die Eluate in einer
SDS-PAGE aufgetrennt und in einer Silberfärbung Banden bei 165kDA, entsprechend des
Molekulargewichtes der CD11b Untereinheit und 98kDA, entsprechend des Molekulargewichtes der CD18 Untereinheit, sichtbar gemacht, desweiteren eine Bande bei 36kDA, die
dem single-chain-Antikörper entsprach. Die deutlicheren Banden lieferte der Ansatz mit
Antikörperzugabe nach Lyse.
Die Immunpräzipitation mit ScFv Antikörpern erwies sich als äußerst schwierig; IgAntikörper sind hierbei zu bevorzugen, da sie auf Grund Ihrer höheren Valenz größere
Bindungskapazitäten haben, die bei den geringen Mengen entscheidend für den Erfolg sein
können.
ERGEBNISSE
101
160kDA
96kDA
MAN-1 vor Lyse
hinzugegeben
MAN-1 nach
Lyse
hinzugegeben
Abb. 4.21: Immunpräzipitation lysierter Mononukleärer Zellen mit dem ScFv Antikörper MAN-1.
DISKUSSION
5
102
Diskussion
5.1
Selektionsstrategie
Aus den vorliegenden Ergebnissen kann gefolgert werden:
%& Die
hier
entwickelte
Selektionsstrategie
ist
geeignet
hochspezifische,
konformationsabhängige Antikörper gegen Leukozytenrezeptoren zu selektionieren.
Die erste Panningrunde auf mononukleären Zellen dient zur Vorselektion der umfangreichen
und hochvariablen Phagenbibliothek. Durch die Vielzahl an Oberflächenmerkmalen dieser
natürlichen Zellen wird bereits im ersten Depletionsschritt eine große Menge Mac-1
unspezifischer Phagen ausgefällt. Viele dieser Oberflächenmoleküle unterliegen jedoch,
ähnlich dem Mac-1, einem aktivationsspezifischem Konformationswechsel, so dass PMNsund aktivationsspezifische, nicht aber Mac-1 selektive Phagen angereichert werden.
Deshalb ist der Wechsel auf ein Zellmodell mit definierten Rezeptoren wichtig. Entscheidend
dabei ist, dass das Depletions- und Selektionsprinzip beibehalten werden. Dies wird
ermöglicht, durch das Vorhandensein zweier Zelllinien, die verschiedene Konformationszustände des Rezeptors tragen: die WT-Zelllinie, die den unaktiven Rezeptor exprimiert, und
die Del-Mutante, die, durch eine GFFKR-Deletion, den aktivierten Rezeptor exprimiert. Es
wäre auch möglich experimentelle Zelllinien zu stimulieren, Vorteil der Nutzung einer
Rezeptormutante ist aber 1. die Zuverlässigkeit der Aktivation (Rezeptorkonformation
entspricht immer einer maximalen Stimulation ohne das Risiko, dass Zellen durch
übermäßige Stimulation zu Grunde gehen und weitere Epitope freisetzen, die im
Depletionsschritt noch nicht zugänglich waren) und 2., dass ausschließlich der CD11b/CD18
aktiviert ist und somit die Bindung an andere Rezeptoren durch den Depletionsschritt
ausgeschlossen ist. Zelloberflächen bieten eine Vielzahl an Epitopen; der Antikörper muß also
für eine erfolgreiche Selektion den geringen Unterschied der beiden Zelllinien erkennen, der
lediglich in der Konformation des Mac-1 besteht.
Zusammen mit der Wahl eines Waschpuffers mit niedrigem pH, der unspezifische Bindungen
weiter reduzieren soll, führt diese Vorgehensweise zu einem großen Selektionsdruck, der die
Anreicherung eines Klones zur Folge hat.
DISKUSSION
103
So belegt BSTN1-Verdau und die Sequenzierung der Synthetischen Klone den Erfolg der
Panningstrategie. Die klonale Anreicherung eines (MAN-1), bzw. zweier (MAS-1, MAS-2)
Klone kann, auf Grund des Depletionsschrittes, nur möglich sein, durch Bindung an den
einzigen
variablen
Bereich
zwischen
den
beiden
Zelllinien,
nämlich
der
Konformationsänderung des Mac-1. An der geringen Varianz der CDR3-Sequenzen der
angereicherten Klone wird die hohe Spezifität des Verfahrens deutlich.
Somit ist das hier vorgestellte Phagedisplay-Verfahren ein hoch-spezifischer Selektionsprozeß
in-vitro und ermöglicht die Gewinnung konformationsabhängiger Antikörper.
5.2
5.2.1
Funktionelle Charakterisierung
FACSanalyse und I-Domänen ELISA
FACSanalysen und ELISA lassen folgende Schlüsse zu:
%& Der mittels Phagedisplay selektionierte Antikörper MAN-1 bindet spezifisch die
aktivierte Konformation des Mac-1-Rezeptors, nachweislich auf einem isolierten
Rezeptormodell in CHO-Zellen, sowie nativ auf mononukleären Zellen.
%& Somit ist das CHO-Zellmodell auf den natürlichen Rezeptor übertragbar.
%& Der CD11b-Antikörper - Inhibitionsversuch zeigt: CD11b beinhaltet das Epitop von
MAN-1.
%& Die Aktivation und somit die MAN-1 Bindung ist Metallionenabhängig.
%& Das Epitop liegt innerhalb der Bindungssequenz für Fibrinogen.
Die FACSanalysen der Antikörper auf den Zelllinien bestätigen die Funktionalität des
Panningkonzeptes, die FACSanalysen mit Vollblut und mit aufgereinigten Monozyten
bestätigen die Übertragbarkeit des Zellmodells auf natürliche Zellen.
Die schwächere Bindung des MAS-1 Antikörpers ließe sich eventuell durch weitere
Maßnahmen noch verbessern. Hier bietet sich, z. B. das Erzeugen einer weiteren Bibliothek
auf Basis dieses Antikörpers an, die nur in der CDR3 der Leichtkette variabel ist und die
DISKUSSION
104
CDR3 der schweren Kette des MAS-1 Antikörpers besitzt. Mit dieser können dann weitere
ein bis zwei Panninrunde durchgeführt werden und die dann amplifizierten Antikörper einer
Testung unterzogen werden.
Daß der zweite synthetische Klon nicht bindet, obwohl er eine MAN-1 ähnliche Sequenz
aufweist, ist auf die schlechte Ausbeute bei der Produktion/Aufreinigung zurückzuführen.
Mögliche Erklärungen hierfür sind Konglomeratbildungen der single chain Antikörper oder
dass die Sequenz einen toxischen Charakter hat. Dies erklärt, dass, bei selbem
Bakterienkulturvolumen, die Menge aufgereinigten MAN-1 und MAS-1 annähernd identisch
waren, die Ausbeute an MAS-2 jedoch dagegen signifikant abfiel.
Die Zentrale Sequenz der Klone MAN-1 und MAS-2 ist eine Basis für weitere
Untersuchungen; es bieten sich funktionelle Versuche mit einem Tripeptid der Aminosäuren
Phenylalanin, Tryptophan und Glycin an. Kurze Peptidsequenzen können ebenfalls
therapeutisch nutzbar sein, wie das Beispiel Eptifibatid zur GPIIb/IIIa Blockade belegt.
Die FACSanalysen belegen, dass MAN-1 an Mononukleäre Zellen bindet, dies bedeutet aber
nicht notwendigerweise, dass die Bindungsstelle im CD11b/CD18 Rezeptor liegt. Die
Inhibitionsversuche mit einem blockierenden CD11b Antikörper beweisen dies. Die
Metallionenabhängigkeit der Bindung ist ebenfalls Mac-1 typisch und unterstützt die
genannten Erkenntnisse und bietet die Grundlage für eine Negativkontrolle mit EDTA für
weitere funktionelle Tests und den diagnostischen Einsatz des Antikörpers.
Die Ergebnisse der weiteren Inhibitionsversuche, lassen den Schluß zu, dass die getesteten
Liganden nicht an denselben Stellen wie der zu testende Antikörper binden. Eine Ausnahme
bildet hier Fibrinogen, dessen unwesentliche Bindungsinhibition sich durch die kaum
vorhandene Bindung von löslichem Fibrinogen an den Mac-1 erklären lässt. Erst
Proteolytische Spaltung, oder Immobilisation führen zu starker Bindung. Fibrinogen erfährt
also in vivo, ähnlich den Integrinen, eine Aktivierung (Lishko 2002).
Zur genauen Identifikation des Antikörperepitops liefert der I-Domänen-Peptid Elisa einen
wichtigen Beitrag, da er belegt, dass die Erkennungssequenz für den Antikörper innerhalb der
I-Domäne liegen muß, genauer: innerhalb der Bindungssequenz für Fibrinogen, was auch die
Zelladhäsionsversuche belegen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der MAN-1 Antikörper hochspezifisch die I-Domäne
des aktivierten Mac-1 Rezeptors bindet.
DISKUSSION
5.2.2
105
Adhäsionsversuche
Die Adhäsionsversuche auf Heparin und Fibrinogen lassen folgende Schlüsse zu:
%& Die Zellinien, die den GFKKR-deletierten und damit aktivierten Rezeptor exprimieren
(DEL), binden mit dem Rezeptor an die immobilisierten Liganden.
%& Der aktivationsspezifische ScFv Antikörper MAN-1 inhibiert diese Bindung in
gleichem Ausmaß wie ein blockierender konformationsunspezifischer CD11bAntikörper.
%& Das MAN-1 Epitop liegt innerhalb der Bindungsstellen für Fibrinogen und Heparin.
Die Adhäsionsversuche bilden ein realistisches funktionelles Assay, das zeigt, dass der ScFvAntikörper MAN-1 aktivationsabhängig in der Lage ist, die Mac-1 vermittelte Bindung
stoffwecheselaktiver Zellen an dessen Liganden Fibrinogen und Heparin zu inhibieren.
Sowohl Heparin als auch Fibrinogen binden innerhalb der I-Domäne, die Bindungsstellen
überschneiden sich. So ist Heparin sogar in der Lage ist Fibrinogenbindung zu
inhibieren(Peter, Schwarz et al. 1999). Damit ist es nicht verwunderlich, dass MAN-1 die
Bindung beider Liganden inhibiert.
Die
gezielte
aktivationsspezifische
Inhibition
des
CD11b/CD18
Rezeptors
bietet
entscheidende Vorteile gegenüber unspezifischen Blockaden. Der therapeutische Einsatz von
Antikörpern, die Integrine unabhängig ihres funktionellen Status inhibieren, z.B. des
GPIIb/IIIa Blockers Abciximab, sind nebenwirkungsbelastet, führen in diesem speziellen Fall
z.B. zu Thrombopenien und Blutungskomplikationen. Eine selektive Blockade lässt eine
große Reserve an funktionellen Rezeptoren, die noch zur Verfügung stehen. Dies wäre im
Falle des Mac-1 Rezeptors sicherlich wünschenswert, da seine große Rolle in der
Immunantwort nicht zu vernachlässigen ist.
MAN-1 ist also in der Lage die Bindung von Liganden nach Aktivation zu inhibieren und
somit pathologische Vorgänge zu behindern und gleichzeitig einen Reservepool an nicht
aktivierten Mac-1 exprimierenden Zellen unaffektiert zu lassen.
DISKUSSION
5.3
106
Paratopmapping
Die FACS-Analyse der CDR3-Mutationen des ScFv-Antikörpers MAN-1 lassen folgende
Schlüsse zu:
%& Die CDR3 Region ist verantwortlich für die aktivationsspezifische Mac-1 Bindung des
ScFv-Antikörpers MAN-1.
%& Das zentrale Tryptophan ist entscheidend an der Epitopbindung beteiligt.
%& Der Austausch des benachbarten Glycins führt ebenfalls zu einer signifikanten
Inhibition der Bindung.
%& Der alleinige Austausch der weiteren einzelnen Aminosäure führt zu keinem
deutlichen Rückgang der Bindung.
Mittel PCR gelingt es, durch den Einsatz geeigneter Primer, selektiv einzelne Aminosäuren
der variablen CDR3-Region des MAN-1 Antikörpers gegen die „neutrale“ Aminosäure
Alanin auszutauschen. Ziel ist, durch die Änderungen des Bindungsverhaltens der einzelnen
MAN-1-Mutanten, zu Beweisen, dass die CDR3-Region das Paratop des Antikörpers
darstellt. Desweiteren soll die Bedeutung der einzelnen Aminosäuren für die erfolgreiche
Mac-1 Bindung untersucht werden. Der Austausch der Aminosäuren D (Aspartat) und F
(Phenylalanin) zeigt keine wesentliche Änderung des Bindungsverhaltens, wohingegen ein
deutlicher Rückgang der mittleren Fluoreszenz bei Austausch des zentralen Tryptophans (W)
gegen Alanin festzustellen ist. Auf Grund der Polarität und der sphärischen Größe des
Tryptophans ist auch zu erwarten, dass sich eine solche Aminosäure nach 4 Panningrunden
nur in der Bindungssequenz durchsetzen kann, wenn sie essentiell für diese Bindung ist.
Überraschend hingegen ist jedoch der starke Bindungsrückgang bei der GlycinAustauschmutante (G-A), da die Aminosäure Glycin Alanin am meisten ähnelt und keine
Ladungen trägt. Diese einfache Aminosäure ist an dieser Position notwendig, damit das
Tryptophan innerhalb des Paratopes eine geeignete Position einnehmen kann. Bei Austausch
scheint die Tertiärstruktur für eine weitere Mac-1-Bindung zu stark gestört zu sein..
Das abschließende Serin scheint, trotz seiner polaren –OH Gruppe, unwesentlich an der
Bindung beteiligt zu sein.
Das Phenylalanin an Position 2 ist interessant, da es in dem synthetischen Klon MAS-2 , der
leider als ScFv-Antikörper das Bindungsverhalten des filamentösen Phagen nicht bestätigen
konnte, amplifiziert wurde. So lässt sich vermuten, dass es zur Bindung beiträgt, obwohl ein
DISKUSSION
107
isolierter Austausch keine wesentliche Änderung der mittleren Fluoreszenz in den
FACSanalysen zeigte.
Zwischen dem Klon MAS-1 und dem MAN-1 Antikörper gibt es keine Übereinstimmungen
in der Sequenz, genauso wenig wie in der Sequenz der Antikörper und natürlichen Mac-1Liganden, deren Bindungsregion bekannt und sequenziert sind. Internetdatenbanken wurden
auf Übereinstimmungen hin untersucht.
5.4
Immunpräzipitation
Die Immunpräzipitation des Integrins Mac-1 mit dem ScFv-Antikörper MAN-1 läßt folgende
Schlüsse zu:
%& Der MAN-1 Antikörper ist zur Immunpräzipitation des Mac-1 aus einem
Monozytenlysat geeignet.
%& Die Zugabe des Antikörpers nach der Lyse ist von Vorteil.
%& Die Zielbanden bei 98kDA und 160kDA liefern einen weiteren Beweis dafür, dass
CD11b/CD18 das Epitop für MAN-1 beinhalten.
Für die Isolierung des Mac-1-Rezeptors mittels Immunpräzipitation wurde Protein-L-Agarose
der Nickel-Agarose, die sonst zur Aufreinigung des His-TAG Antikörpers dient, vorgezogen,
um auf ein bereits für Immunpräzipitationen etabliertes Verfahren zurückgreifen zu können.
Weiter Bindungsmedien wie Protein-G-Sepharose oder Pansorbinzellen (Formalin fixierte
Staph. aureus Zellen) erwiesen sich als nicht geeignet, da sie, auch nach mehrmaligen
waschen, zu einer großen Verunreinigung des Eluats führten, die eine Identifikation der
Zielbanden nicht zuließ.
Eine Immunpräzipitation mit single-chain Antikörpern ist möglich, auf Grund der geringeren
Bindungskapazitäten im Vergleich zu kompletten Antikörpern können jedoch nur geringe
Mengen aufgereinigt werden. Um diese sichtbar zu machen bietet sich am ehesten die äußerst
sensitive radioaktive Markierung an. Damit kann diese Methode durchaus zur Identifikation
des Rezeptors in einem Zellgemisch, bzw. Lysat dienen. Zur Isolierung und Aufreinigung des
Rezeptors für weitere experimentelle Versuche ist der Ansatz, auf Grund der geringen
Ausbeute, jedoch nicht geeignet.
DISKUSSION
5.5
108
Neue Aussichten für Diagnostik und Therapie
Das vorgestellte Phage-Display-Konzept ist variabel einsetzbar.
Ähnliche Zellmodelle, wie die hier vorgestellte CHO-Zelllinie, die über eine GFFKRDeletion verfügen, existieren bereits auch für andere Integrine. Die Selektionsstrategie ist auf
diese übertragbar. Natürlich ist die Selektion auch auf an Matrizes gekoppelte Rezeptoren
möglich. Denkbar wäre auch eine Selektion auf isolierten Rezeptorteilen, z.B.
aktivationsabhängigen Domänen. Somit ergibt sich für nahezu jeden Rezeptor eine
möglichkeit eine geeignete Depletions- und Selektionsstrategie zu entwickeln und somit
hochspezifische Antikörper zu schaffen.
Der hier entwickelte Antikörper MAN-1 zeichnet sich durch einfache Handhabung und
Aktivationsspezifität aus. Dies macht ihn zu einem Werkzeug weiterer diagnostischer
Analysen.
So ließe sich zum Beispiel der Mononukleäre Aktivationsgrad im Rahmen bakterieller
Infekte, die Einfluß auf Mac-1 nehmen (Yamaguchi 2001), bestimmen zur Diagnostik und
Verlaufskontrolle; durch EDTA Proben als Negativ- (0%) und PMA stimulierte Proben als
Positivkontrollen (100%) ließen sich Patienten vergleichbare Werte des Aktivationsgrades in
% zuordnen.
Schon seit einiger Zeit gilt Monozytenaktivation als Maß für das Restenoserisiko nach PTCA
(Pietersma 1995). Inoue et al. zeigten kürzlich, dass die CD11b/CD18 Aktivation ein
zuverlässiger und früher Parameter für den späten Lumenverlust ist. Hier bietet sich ein
aktivationsspezifischer Mac-1 Antikörper zur Kontrolle, Screening und Einschätzung des
Restenoserisikos von PTCA Patienten an, die eventuell gezielter medikamentös versorgt
werden können, bzw. zur Kostensenkung Nachsorgeintervalle spezifischer definiert werden
können.
Durch die Beteiligung an-, und die Anreicherung in Atherosklerotischen Plaques (Schober,
Chen et al. 2002) könnten Akkummulationen aktivierter Monozyten, nach Kopplung der ScFv
Antikörper an geeignete Substanzen für bildgebende Verfahren, z.B. (125)Iod, in vivo
dargestellt
werden.
Atherosklerotische
Dies
Herde
würde
eine
erleichtern.
Identifikation
Werden
im
Entstehen
ScFv-Antikörper
als
begriffener
Hilfsmittel
in
bildgebenden Verfahren eingesetzt, empfiehlt sich die Gabe von L-Lysin, die eine übermäßige
Anreicherung in der Niere und damit zu Unschärfen in diesem Bereich führt (Hamilton 2002).
DISKUSSION
109
Geeignet wäre der ScFv Antikörper auch für Versuchsansätze zur Arteriogenese. TGF-ß hat
seinen arteriogenetischen Effekt, laut van Royen et al. (van Royen 2002) über die erhöhte
monozytäre Mac-1 Expression, Adhäsion und Transmigration, es fehlten aber geeignete
Antikörper um den Aktivationsgrad nachzuweisen. So wurde lediglich mittels FACSanalysen
eine erhöhte Mac-1 Expression, nach Stimulation, nachgewiesen. Hier wäre ein
aktivationsspezifischer Antikörper von entscheidendem Vorteil, zumal ScFv Antikörper, auf
Grund ihrer Größe, sehr gut gewebegängig sind (Haber 1986) und einen interessanten Ansatz
für histologische Experimente zur Untersuchung Monozytärer Infiltrationen im Rahmen der
Arteriogenese bieten. Natürlich muß der Antikörper zunächst auf seine Funktionalität für
Verfahren wie z.B. Western-Blotting, Histologie und Immunfluoreszenz hin untersucht
werden.
Ein weiteres Anwendungsgebiet wäre die Mac-1 Aktivierung im Rahmen harter körperlicher
Belastung unter leistungsdiagnostischem Aspekt. Da die vermehrte CD11b/CD18 Expression
erst bei intensiven Belastungen (an oder über der anaeroben Schwelle) auftreten, (Jordan
1999) ließe sich über die Monozytäre Aktivation der Leistungsstand von Sportlern, die
Intensität von Trainingseinheiten und, langfristig, deren Effekt auf die Leistungsfähigkeit
messen und beurteilen.
Die in dieser Arbeit beschriebenen Adhäsionsversuche geben erste Einblicke in die
therapeutischen Qualitäten des ScFv-Antikörpers MAN-1. Eine Inhibition von CD11b/CD18
könnte positive Effekte bei vielen kardiovaskulären Krankheitsbildern haben. Diesen Schluß
lassen folgende Ergebnisse zu: Die unstabile Angina Pectoris ist assoziiert mit der Aktivation
zirkuliernder Monozyten, der erhöhten Mac-1 Expression und Fibrinogenbindung, die zur
Vernetzung mit Thrombozyten führt (Mazzone 1993; Jude 1994; Ott 1996).
PTCA führt ebenfalls zu Leukozytenaktivierung inklusive erhöhter Mac-1 Expression (Ikeda
1994), die direkt mit dem gefürchteten späten Lumen Verlußt assoziiert ist (Pietersma,
Kofflard et al. 1995). Auch Inoue et al. beschreiben die Mac-1 Expression und Aktivation als
entscheidend für neointimalen Verdickungen und Restenose (Inoue, Uchida et al. 2003). Hier
würde sich ein blockiernder Antikörper zum therapeutischen Ansatz anbieten. Wie wichtig
dabei eine Aktivationsspezifische Blockade sein kann zeigt das Beispiel des GPIIb/IIIa
Blockers Abciximab. Der therapeutische Einsatz dieses Antikörpers, der ein Integrine
unabhängig seines funktionellen Status inhibiert, ist nebenwirkungsbelastet, führt zu
Thrombopenien und Blutungskomplikationen.
DISKUSSION
110
Desweiteren konnten Simon et al. (Simon 2000) zeigen, dass Mac-1 -/- Mäuse, deren knockout funktionell einer vollständigen Blockade des Rezeptors entspricht, nach Angioplastie
weniger Leukozytenmigration und Akkumulation in den Gefäßwänden zeigten und dadurch
wesentlich reduzierte neointimale Verdickungen. Ähnliche Versuche zur Reduktion Intimaler
Verdickungen nach Angioplastie oder Stentimplantation wurden auch an Hasen mit
Monoklonalen Antikörpern erfolgreich durchgeführt (Campbell 1998).
Diese Versuche belegen die Effektivität einer Mac-1 Blockade zur Reduktion der
Restenoserate und fordern einen Antikörper, der therapeutisch beim Menschen eingesetzt
werden kann.
Der ScFv Antikörper besitzt gute Voraussetzungen diese bestehende Lücke zu füllen.
Zunächst besitzt er alle Vorzüge eines single-chain Fragmentes, wie z.B. kostengünstige
Produktion, geringe Antigenität und gute Penetration des Zielgewebes. Desweiteren ist er
hoch spezifisch für den menschlichen Mac-1, die Adhäsionsassays belegen seine
Funktionalität und nicht zuletzt zeichnet den Antikörper seine Aktivationsspezifität aus, die
entscheidende Vorteile gegenüber unspezifischen Blockaden besitzt.
ZUSAMMENFASSUNG
111
6 Zusammenfassung
Das Leukozytenintegrin Mac-1 ist an immunologischen und vaskulären Prozessen beteiligt. Interessant sind seine Beteiligung an inflammatorischen Prozessen, wie z. B. der Sepsis, an der
Atherosklerose und die große Bedeutung für Restenoseprozesse nach PTCA. Studien zeigen bereits den Nutzen einer Mac-1 Blockade zur Restenoseprophylaxe nach PTCA. Hier bietet sich
eine vielversprechende Einsatzmöglichkeit für einen blockierenden Antikörper. Da die Funktion
dieses Rezeptors abhängig von seinem Konformationszustand ist, es existiert eine aktivierte,
hochaffine und eine unaktivierte, niederaffine Form, scheint die Selektivität eines Antikörpers zur
Bindung der aktivierten Form von Vorteil zu sein.
Es sollte deshalb ein Antikörperfragment aus den variablen Regionen der schweren und der leichten Antikörperkette (scFv: single chain Antikörper) durch Phagedisplay gesucht werden, das aktivationsspezifisch Mac-1 bindet. Mittels Phagedisplay können durch die oberflächliche Expression von Antikörperbindungsregionen auf Phagen geeignete Antikörper durch Bindung der Phagen an ein Epitop gesucht werden. Diese Phagen tragen das entsprechende Antikörpergen auch in
ihrem Phagemid, so dass diese Antikörper nach Infektion von Bakterien durch die Phagen, in
prokaryotischen Expressionssystemen aufgereinigt werden können.
Die Grundlage bildete eine Single-chain-Antikörper-Phagenbibliothek sowie ein in dieser Doktorarbeit entwickeltes Selektionsverfahren (Panning). Zunächst wurde in einem Depletionsschritt
nichtspezifisch bindende Phagen durch Bindung an unaktivierte Monozyten, bzw. eine, von uns
hergestellte Zelllinie, die den unaktivierten Rezeptor exprimiert, isoliert und verworfen. Die verbliebenen Phagen wurden dann auf stimulierten Monozyten, bzw. einer mutierten rekombinanten
Zelllinie, selektioniert. Diese Mutation führt dazu, dass der Rezeptor eine aktivierte Konformation einnimmt. Die so gewonnenen Antikörper binden ausschliesslich an die aktivierte Form.
Dies konnte im Durchflußzytometer nachgewiesen werden. Mittels ELISA wurde die Bindung
an der isolierten Bindedomäne des Mac-1 Rezeptors belegt. Durch Mutagenesestudien der CDR3
Region der schweren Kette des gewonnenen Antikörpers (genannt MAN-1) konnte die Bedeutung des zentralen Tryptophan für die Bindung nachgewiesen werden. Funktionelle Studien zeigten, dass MAN-1 in der Lage ist aktivationsabhängig die Bindung der erwähnten Zelllinien an die
Liganden Heparin und Fibrinogen zu inhibieren. Erstmals ist somit ein Marker für die Leukozytenfunktion vorhanden, der, wie Folgestudien zeigen, in der Lage ist, fühzeitig eine Sepsis nachzuweisen. Durch die selektive Inhibition steht einen neuartige hochspezifische antiinflammatorische Strategie zur Verfügung. Single chain Antikörpers bieten den Vorteil der schnellen Penetration, hohen Clearance und geringen Immunogenität. Die hier entwickelte ScFv-PhagedisplayStrategie ermöglicht erstmals die Herstellung konformationsspezifischer Antikörper zu diagnostischen und therapeutischen Zwecken und ist übertragbar auf andere Oberflächenrezeptoren.
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112
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DANKSAGUNG
119
8 Danksagung
Ich danke Herrn Prof. Dr. Karlheinz Peter für die Überlassung des Themas, die
ausgezeichnete Möglichkeit dieses zu bearbeiten, sowie die freundliche Unterstützung meiner
wissenschaftlichen und klinischen Ausbildung.
Herrn Prof. Dr. Stark danke ich für sein Interesse an meiner Arbeit und seine Bereitschaft, die
Begutachtung zu übernehmen.
Frau Dr. Meike Schwarz danke ich für die engagierte Betreuung und die Einarbeitung in die
Thematik. Trotz großer Arbeitsbelastung in Klinik und Forschung war sie jederzeit eine große
Hilfe bei allen wissenschaftlichen Problemen und in frustrierenden Momenten eine große
moralische Unterstützung. Weiterhin danke ich ihr für die Durchsicht dieser Arbeit.
Meinen Eltern und Großeltern danke ich für die großartige Unterstützung. Ohne diese wäre
eine solch ausführliche Arbeit nicht möglich gewesen.
Frau Nicole Basler danke ich für die technische Beratung und die Hilfe beim Erlernen neuer
Arbeitstechniken.
Ebenso danke ich meinen Mitdoktoranden für die gute Zusammenarbeit und Christoph
Schmidt-Hieber und Jette Jung für die moralische Unterstützung bei der Auseinandersetzung
mit Microsoft Programmen.
120
LEBENSLAUF
9 Lebenslauf
Steffen Ulrich Eisenhardt, geboren am 26.04.1978 in Lich
Eltern:
Ulrich Oskar Eisenhardt, Rechtsanwalt und Notar
Claudia Rosemarie Eisenhardt, geb. Wendl, Stadtverordnete der Stadt Friedberg
Geschwister:
Nils Alexander und Benjamin Dennis
Schulausbildung
1984-1988
Philipp-Dieffenbach-Grundschule in Friedberg.
1988-1997
Augustinergymnasium Friedberg.
1997
Erwerb der allgemeinen Hochschulreife.
Karl-von-Frisch-Preis des Verbandes deutscher Biologen (VdBiol).
Zivildienst
1997-1998
Zivildienst als Rettungshelfer der Johanniter-Unfall-Hilfe, Bad Nauheim.
Hochschulausbildung
1998
Beginn des Studiums der Medizin an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg.
9/2000
Ärztliche Vorprüfung.
9/2001
Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung.
4/2004
Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung.
4/2004-
Praktisches Jahr:
3/2005
1. Tertial: Wahlfach Plastische- und Handchirurgie Universitätsklinikum Freiburg in
der Abteilung von Prof. Dr. G. B. Stark.
2. Tertial: Innere Medizin, McGill University, Montréal/Kanada und
Nelson Mandela Medical School, Durban/Südafrika.
3. Tertial: Chirurgie am Spital des Sensebezirkes, Tafers/Schweiz.
4/2005
Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung.
Ärztliche Prüfung mit der Gesamtnote „sehr gut“ bestanden.
Seit 6/2005
Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Baker Heart Research Institute in Melbourne/
Australien.
Studienbegleitende Tätigkeiten
9/1999-10/99
Pflegepraktikum, Herzchirurgische Intensivstation der Kerkhoffklinik, Bad Nauheim.
10/2000
Wissenschaftliche Hilfskraft im Physiologischen Institut der Universität Freiburg.
1/2002-6/02
Wissenschaftliche Hilfskraft in der Abteilung für Kardiologie und Angiologie der
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg.
Famulaturen
3/2001
Chirurgie, King-Edward VIII Hospital, Durban/Südafrika.
121
LEBENSLAUF
3/2002
Radiologische Abteilung der Universitätsklinik Freiburg.
3/2003
Neurologie, Royal Perth Hospital, Perth/Australien.
9/2003
HNO-Heilkunde, Praxisfamulatur bei Dr. Martin Rupp, Freiburg.
Promotion
9/2001-
Experimentelle Arbeit in der Abteilung Innere Medizin III der Universität Freiburg unter
3/04
Aufsicht von PD Dr. K. Peter.
Publikationen / wissenschaftliche Vorträge / Patente
Eisenhardt SU, Schwarz M, Schallner N, Soosairajah J, Bassler N, Huang D, Bode C, Peter K.
„Generation of activation-specific human anti-!M"2 single-chain antibodies as potential diagnostic
tools and therapeutic agents“. Blood. 2006 Dec 12; [Epub ahead of print].
Bassler N, Loeffler C, Mangin P, Yuan Y, Schwarz M, Hagemeyer CE, Eisenhardt SU, Ahrens I,
Bode C, Jackson SP, Peter K. „A Mechanistic Model for Paradoxical Platelet Activation by LigandMimetic !IIb/"III (GPIIb/IIIa) Antagonists“. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Mar;27(3):e915.
Stoll P, Bassler N, Hagemeyer CE, Eisenhardt SU, Chih CY, Schmidt R, Schwarz M, Ahrens I,
Katagiri Y, Pannen B, Bode C, Peter K. „Targeting Ligand-Induced Binding Sites on GPIIb/IIIa via
Single-Chain Antibody Allows Effective Anticoagulation Without Bleeding Time Prolongation“.
Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Feb 22; [Epub ahead of print].
Schwarz M, Eisenhardt SU, Schallner N, Bode C, Peter K. „Generation of Activation-Specific
Human Anti Mac-1 (!M"2, CD11b/CD18) Single-Chain Antibodies as Potential Diagnostic Tools and
Therapeutic Agents“, Scientific Sessions of the American Heart Association, Chicago 2006.
Steffen U. Eisenhardt, Meike Schwarz, Nils Schallner, Nicole Bassler, Karlheinz Peter. „Therapeutic
and diagnostic potential of activation-specific anti-Mac-1 (!M"2) single-chain antibodies in
atherosclerosis“, Vortrag auf der CSANZ –Konferenz in Canberra, 2006.
2005: Anmeldung eines internationalen Patentes fuer den klinischen und experimentellen Einsatz
Leukozyten bindender Polypeptides („Leukocyte-binding polypeptides and uses thereof“) als Erfinder
(mit Meike Schwarz und Karlheinz Peter).
Förderung
6/2003-2005
E-fellows.net Stipendium.
LEBENSLAUF
5/2004
122
dfa-Stipendium für ein Auslandstertial des Praktischen Jahres an der Universität von
KwaZulu-Natal, Durban, Südafrika.
6/2004
Reisestipendium der FreiburgerÄrzteConsulting und der Swiss International Airlines
für ein Auslandstertial an der McGill-University, Montréal, Kanada.
Hobbies
Ausdauersport: Leichtathletik, Triathlon (mehrmalige Teilnahme an deutschen
Hochschulmeisterschaften), Marathon.

Checkliste Immunschutz in Kindergärten incl. Merkblatt

Pressemitteilung der BioNTech

Rabbit anti-P504S (AMACR)

IMMUNOLOGIE 1. Arbeitsweise des menschlichen Immunsystems

Reiz-Reaktions - Holbein

phosphospezifische Antikörper

Rabbit anti-CD4 (SP35)

Gene, die Baupläne des Lebens 2

Das Interfakultären Institut für Zellbiologie/Abteilung

Die Magie der Zellen Vortragsabend