Präparation eines materialografischhistologischen Dünnschliffs zur Untersuchung der Knochenintegration bei dentalen Implantaten Jose-Iñaki Alava F. Marín A. Intxaurrandieta I. Braceras M. Maeztu Struers Zeitschrift für Materialografie 6/2005 Structure e-6 6/2005 Schriftleitung: Knud Foldschack (verantwortlich) Bente Freiberg Michael Rückert Präparation eines materialografischhistologischen Dünnschliffs zur Untersuchung der Knochenintegration bei dentalen Implantaten Structure wird an Leser im Feld der Materialografie weitergegeben. Struers A/S Pederstrupvej 84 DK-2750 Ballerup Denmark Telefon +45 44 600 800 Telefax +45 44 600 801 e-mail: [email protected] Internet: www.struers.com Jose-Iñaki Alava1, F. Marín, A. Intxaurrandieta2, I. Braceras3, und M. Maeztu4 Areas of Biomaterials1, Materialography2 and Surface treatments3. INASMET Foundation-Technology Centre for Materials San Sebastian-Donostia, Spanien. Private Ordination4, Paseo San Francisco, 43 A, 1 dcha. 20400 Tolosa, Spanien. Einführung Wir fordern unsere Leser dazu auf, schriftliche Beiträge über die Präparation von metallografischen, mineralogischen und keramischen Proben und damit verwandte Gebiete einzusenden. Geeignete Artikel werden kostenlos in Structure aufgenommen, einschliesslich dazugehörender Abbildungen in Farbe oder Schwarz/Weiss. Die Beiträge sollten in Form einer Papierkopie oder vorzugsweise auch elektronisch an die Schriftleitung von Structure geschickt werden. Wird ein Artikel in elektronischer Form zur Verfügung gestellt sollten Text und Illustrationen in separaten Dateien gespeichert werden. Wir bevorzugen die folgenden Formate: Text: MS Word Bilder: TIF oder JPG in hoher Auflösung Zeichnungen: Corel Draw (CDR 10 oder früher) oder Adobe Illustrator (AI 9 oder früher) In technischer Hinsicht ist bei der Beurteilung der Knochenintegration an dentalen Implantaten der kritischste Aspekt die gleichzeitige Erhaltung und Darstellung von hartem und weichem Gewebe und dem Material des Implantats. Abgesehen von den verschiedenen Zellgeweben (trabekulärer Knochen, kortikaler Knochen, periodontales weiches Gewebe, Blut usw.) hat ein dentales Implantat eine metallische Prothese die normalerweise eine poröse Schicht oder eine Oberflächenbehandlung hat. Bei dentalen Implantaten ist die Verwachsung von Gewebe und Knochen am Übergang von Knochen/Implantat ein Hauptkriterium für die Qualität der Verbindung mit der Metallprothese. Die Schwierigkeit besteht in der gleichzeitigen Präparation des vergleichsweise harten Titans des Implantats zusammen mit dem weichen Gewebematerial. Um genaue Abbildungen zu erhalten sind dafür einige spezielle Methoden entwickelt worden. In diesem Artikel wird eine Kombination aus metallografischen und histologischen Methoden beschrieben die angewandt wurde um eine repräsentative Probe zur Beurteilung der Knochenintegration herzustellen. Das dentale Implantat wir normalerweise aus kommerziellem Reintitan oder einer Ti-6Al-4V Legierung hergestellt. Diese Schraubenimplantate werden dann in den maxillofacialen Knochen eingesetzt und dienen als Stütze für die Zahnersatzkonstruktion (Zähne, Verbindungen oder kompletten Zahnersatz). Die richtige Befestigung des Metalls im Zahn ist von kritischer Bedeutung, damit die Superstruktur gewährleistet ist und die Prothese die zu erwartenden mechanischen Kräfte aushalten kann. Der Befestigungsgrad am Knochen ist sehr schwer zu bestimmen, und metallografisch-histologische Proben herzustellen an denen harte und weiche Materialien beurteilte werden können verlangt die Anwendung spezieller Techniken. Zusätzlich müssen die Ergebnisse für eine Anzahl von Proben reproduzierbar sein. Der Artikel beschreibt wie mit Hilfe herkömmlicher metallografischer Methoden und ausreichend guter Hilfsmittel verschiedene Bestimmungen an einer Probe vorgenommen werden können, um ein Maximum an Information über eine Zahnkonstruktion und den Grad ihrer Integration zu erhalten. 3 Probenpräparation Die Proben wurden aus halben Hundekiefern (von Experimenten an Beaglen) entnommen und in 4%iges Formaldehyd gelegt. Mit Hilfe von Röntgenansichten wurde an allen Proben die genaue Lage des Implantats im Kieferknochen bestimmt (Abb.1) Die Peri-Implantattasche wurde mit einer Kunststoff-Periodontalsonde gemessen. Die Teile wurden fotografiert und gekennzeichnet (Abb.2). Danach wurden die Proben aus dem 4%igen Formaldehyd genommen, auf Papier abgetrocknet, mit einer 60%igen Alkohol/Wasser Lösung gereinigt und in kleine sterile Behälter gegeben, dabei wurde immer die Kennzeichnung beibehalten. Dann wurden die Proben in einem Trockenschrank bei 40°C für mindestens 12 Stunden getrocknet. Zur Probennahme wurde bei allen Proben ein Schnitt senkrecht zum Knochen gelegt, wobei die Röntgenaufnahmen und ein Metallstab als Hinweise für den Schnitt dienten. Abb. 1: Röntgenaufnahme von Kiefer mit Implantat ref. 10-8325-I 310233.0 Trocknen und Infiltrieren Die Proben wurden stufenweise in Ethanollösungen von 60% bis 100% getrocknet. Die 60%, 80% und 90% Lösungen wurden mit Ethanol (98%) hergestellt. Für die100% Lösung wurde reines Ethanol verwendet. Die Azetonlösung bestand aus 50% Azeton und 50% Ethanol (98%), und Xylol wurde pur verwendet. Die Proben in den einzelnen Behältern wurden wie folgt gebadet: Lösung Ethanol/Wasser 60% Ethanol/Wasser 80% Ethanol/Wasser 90% Ethanol, absolut Azeton/Ethanol 50% Xylol 100% Zeit 2 Std. 4 Std. 12 Std. 24 Std. 6 Std. 2 Std. Nach dem letzten Bad wurden die Proben aus dem Behälter genommen, abgetrocknet und in einem Trockenofen 24 Stunden bei 60°C getrocknet. Danach wurden die Proben mit EpoFix, einem bei Raumtemperatur langsam aushärtenden Epoxydharz, eingebettet. Nach dem Übergießen der Probe mit EpoFix wurde die Einbettform 10 Minuten unter Vakuum gesetzt um sicher zu stellen, dass alle Poren mit Epoxydharz gefüllt waren. Danach wurden die Proben für mindesten 48 Stunden ausgehärtet. Abb. 4 zeigt die schematische Zeichnung einer eingebetteten Probe. Abb. 2: Teil eines Kiefers mit Etikett zur Kennzeichnung Abb. 3: Schematische Zeichnung der Probennahme an einer Knochenprobe mit Implantat Abb. 4: Schematische Zeichnung einer eingebetteten Probe Abb. 5: ESEM Aufnahme 4 Dünnschliffherstellung Nach dem Aushärten wurde die eingebettete Probe mit Siliziumkarbidpapier Körnung 500 so lange vorsichtig von Hand geschliffen bis der erste Zahn einer Schraubenwindung sichtbar wurde. Das Feinschleifen mit den Körnungen 1200 und 2400 wurde so lange fortgesetzt bis die Wurzeln der Schraubenwindung auftauchten. An diesem Punkt in der Präparation wurden ESEM (Environmental Scanning Electron Microscopy) Aufnahmen gemacht (Abb. 5), und mit EDS der Ca-Verlauf von ausgewählten Proben bestimmt (Abb. 6). Vor der Dünnschliffherstellung wurde auch eine Dunkelfeldaufnahme gemacht (Abb.7) um die neue Knochenbildung um das Implantat herum zu zeigen. Abb. 6: EDS Analyse von Ca und P Für den Dünnschliff wurde die fein geschliffene Seite der eingebetteten Probe mit 3 Tropfen EpoFix auf einen Objektträger aus Methacrylat geklebt und unter Vakuum gesetzt. Danach wurde die Probe mit Gewichten beschwert und für 48 Stunden ausgehärtet. Abb. 8 zeigt wie nach dem Aushärten das überstehende Probenmaterial abgetrennt wurde. Die Probe wurde mit einem Vakuumhalter in der Präzisionstrennmaschine Accutom gehalten und mit einer dünnen Aluminiumoxid Trennscheibe vom Schraubenkopf ausgehend getrennt. Das verbleibende Probenmaterial war 100-120 μm dick. Mit einem für diesen Zweck hergestellten Dünnschliffhalter (Abb. 9) wurde die Probe jetzt mit Siliziumkarbidpapier Körnung 500, 1200, und 2400 bis zu einer Dicke von 50±10μm (Abb.10) geschliffen. Die Dicke wurde während des Schleifens regelmäßig mit dem Mikroskop überprüft. Fig. 8 Abb. 7: Neue Knochenbildung um das Implantat Fig. 9 Fig.10 5 Materialbeurteilung Das am meisten verwendete Material für diese Art von Implantaten ist Reintitan oder eine Ti-6Al-4V Legierung. Der Unterschied zwischen diesen Materialien liegt darin, dass die Legierungselemente die Umformungstemperatur der α-β Phase verändern was bei dem Reintitan zu einem „near-α“ Gefüge führt und bei der Ti-6Al-4V zu einem α-β Gefüge. Diese Legierungen haben drei Arten von Mikrogefügen bezüglich ihrer chemischen Zusammensetzung: „near-α“, α-β und β Gefüge. Zusätzlich hängt die Morphologie auf Grund der chemischen Zusammensetzung direkt von der Abkühlungsrate aus dem α-β oder dem β-Bereich ab, was zu einer nadeligen α-Struktur oder einer martensitischen α’-, Ω - oder Ti3Al - Phase führt, welche die Materialeigenschaften bedeutend verändern können. Eine Gefügeuntersuchung sollte durchgeführt werden um die Korngröße und die thermo-mechanische Behandlung des Materials zu beurteilen. Da beide Werkstoffe sich unterschiedlich gegenüber Korngrenzenkorrosion verhalten ist die Auswirkung des Gefüges in Hinsicht auf die zu erwartende Lebensdauer eines Implantats von großer Bedeutung. Histologische Färbung Die Proben wurden mit einer konzentrierten, alkalischen Toluidine Blau Lösung bei 35°C gefärbt. Es wurden Aufnahmen der vollständigen Proben gemacht um die histologische Beurteilung und quantitative Auswertung durchzuführen (Abb. 11). Zum Schutz wurde die Oberfläche der gefärbten Probe mit einem Gasobjektträger abgedeckt und die Probe im Dunklen aufbewahrt um die Färbung zu erhalten (Abb. 12). Beurteilung der Knochenintegration Die Quantifizierung der prozentualen Knochenintegration wurde in zwei Schritten durchgeführt: 1. wurde die Fläche der zu beurteilenden Probe bestimmt, und 2. wurde die Peripherielinie dieser Fläche gemessen, wie in Abb.13 gezeigt. Der Anteil der Peripherielinie der Knochen/ Implantat Verwachsung wurde ebenfalls identifiziert (Abb.14). Der Quotient zwischen den beiden Werten ergibt den Prozentanteil Knochen/Implantat für jede Probe (% BIQ). Abb. 11: Dünnschliff mit Titanschraube und Gewebe Abb. 12: Zeichnung Querschnitt durch einen Objektträger mit Probe und Abdeckglas Fig. 14 Fig. 13 Zuletzt wurde mit den ermittelten Werten statistische Berechnungen durchgeführt: die Standardabweichung wurde errechnet, und mit dem Student’s t-test wurde die statistische Signifikanz der Resultate für jeden Typ von Implantat oder Oberfläche im Vergleich mit Kontrollproben analysiert. Abb. 13: Probenfläche Abb. 14: Farbige Linie zeigt den Übergang von Knochen/Implantat Diese Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen andere Analysearten überein, wie z.B. der ESEM Bildanalyse der gleichen Proben, und den histomorphometrischen Beurteilungen von histologischen Präparationen nach dem Donath Verfahren aus früheren Experimenten. Tabelle des Präparationsablaufs Präparationsstufe Gerät Zeit Probennahme Mikromotor +Rotaflex® 5 - 10 Min. Trocknen Ethanol/Wasser Lösungen 24 + 8 Std. Einbetten und Vakuumimprägnieren EpoFix Harz (langsam aushärten) 48 Std. Schleifen von Hand bis zu den ersten Schraubenwindungen Feinschleifen Siliziumkarbid Papier 500# 3 Std. Aufkleben der feingeschliffenen Probenoberfläche auf Methacrylat Objektträger EpoFix Harz Tropfen Aushärten 48 Std. Abtrennen des überstehenden Materials für Dünnschliff Accutom, mit Aluminiumoxid Scheibe ½ Std. Feinschleifen von Hand Siliziumkarbid Papier 1200#, 2000# Bis 50 μm Dicke (ca. 1 Std./Probe) 1200#, 2400# Bibliographie: A histometric comparison of smooth and rough titanium implants in human low-density jawbone. Paolo Trisi, Walter Rao, Alberto Rebaudi Int J Oral Maxillofac Implants (1999); 14:689-698 El papel de los tejidos calcificados en la osteointegración de los implantes metálicos MC Manzanares, J Franch, P Carvalho, JM Montesdeoca, JA García, Y Greco, AM Belmonte, MP Delafuente, I Serra Detum (2003); 3(I):6-14 Análisis estructural de los principales sistemas de implantes utilizados en la actualidad M.A. de Maeztu, M.A. Gomez, E. Arévalo, J.I. Alava, F. Alonso Periodoncia. (1999) Vol: 9, Nº 3,195-204 Ion implantation: surface treatment for improving the bone integration of titanium and Ti6Al4V dental implants. M. A. de Maeztu, J. I. Alava, C. Gay-Escoda. Clin.Oral Impl. Res. (2003) 14. 57-62 Thin Section Preparation: HistologicalInvestigation of Bone Ingrowth into Porous Coated Orthopaedic Implants. C. Keogh Structure (1999) 34. 3-5 A method for study of uncalcified bones and teeth whit attached soft tissues. Donath K, Breuner G J Oral Pathol (1982); 11:318-326 6
© Copyright 2024 ExpyDoc
