als

Dünnschnittpräparation: Histologische Untersuchung
über das Einwachsen von Knochenmaterial in die
poröse Beschichtung orthopädischer Implantate
Cathie Keogh
Department of Medical Physics
Royal Perth Hospital,
Western Australia
Einführung
Als Alternative zur herkömmlichen
Verankerung mit Acrylzement wurde für orthopädische Implantate eine biologische Verankerungsmethode entwickelt. Das Konzept
einer porösen Beschichtung soll es
dem Knochenmaterial ermöglichen,
in die poröse Oberfläche einzuwachsen und eine dauerhafte Verzahnung zwischen lebendem Gewebe und der Metallprothese herzustellen.
Normalerweise besteht das Implantat aus einem Metallgrundkörper,
der mit einer porösen Metalloberfläche beschichtet ist. Der kompakte Grundkörper stellt die erforderlichen biomechanischen Eigenschaften zur Verfügung, wogegen
die poröse Oberfläche das Medium
darstellt, in welches das lebende
Gewebe eindringen kann. Normalerweise besteht die poröse Oberfläche aus einigen Perlenschichten
aus Co/Cr-Legierung, die auf das
Grundmaterial aufgesintert wurden (Abb. 1) oder aus einem Titangitter, das mittels Diffusionsbindung
auf dem Grundmaterial aus
Ti-6Al-4V befestigt wurde (Abb. 2).
Eine der Hauptschwierigkeiten
beim chirurgischen Gelenkersatz
ist die Lockerung des Implantats,
wobei in der Regel der Ablösevorgang an der Grenzfläche zwischen
Knochen und Implantat auftritt.
Soll die Stärke der Einwachsung
von Knochen und Gewebe in die
Grenzfläche untersucht werden,
muß ein durch die Grenzfläche gelegter Dünnschnitt präpariert werden. Für die Herstellung einer repräsentativen Probe des Implantat/
Gewebeübergangs kommen sowohl
metallographische als auch histologische Techniken zum Einsatz.
Das biologische Gewebe muß wegen
der Härteunterschiede zwischen
Implantatlegierung und angrenzendem Gewebe/Knochenmaterial gehärtet werden, und zudem ist in
der Umgebung der Metallkomponente eine feste Stützmatrix
zu erzeugen. Aus genannten Gründen wird die Probe in einem geeigneten Einbettmittel eingebettet, eine Maßnahme, die die Unversehrtheit des strukturellen Aufbaus beim
Trenn- und Schleifvorgang bewahrt.
Eingebettet wird mit Methylmetacryalat (MMA), das wegen seiner günstigen Einbetteigenschaften
bezüglich Viskosität, Durchsichtigkeit und Infiltrierfähigkeit ausgewählt wurde. Nach abgeschlossener
Aushärtung liegt dieses Einbettmittel als transparenter Block vor,
der sich ausgezeichnet Trennen und
Schleifen läßt und somit einen
Dünnschnitt ermöglicht, der bei der
anschließenden histologischen Untersuchung das Einwachsen von Gewebe und Knochen in die porös beschichtete Oberfläche des Implantats zeigt.
Probenpräparation
Zur Fixierung der Einzelteile und
zur Haltbarmachung des natürlichen Zustandes des biologischen
Gewebes, wird das Implantat sofort
nach Entnahme in eine Formalsalzlösung gelegt. Außerdem verhindert diese Konservierung das
Schrumpfen oder die Verformung
von Zellen.
Mit einer Schleiftrennmaschine
wird eine repräsentative Probe herausgetrennt, wobei eine Trennscheibe benutzt wurde, die sich für
den Typ der Implantatlegierung eignet und eine Überhitzung von Gewebe und Implantatmetall vermeidet. Die Probe wird auf die Abmessung der für den Einbettvorgang
vorgesehenen Einbettformen zugeschnitten.
Trocknung und Infiltration
Nachdem die Probe maßgerecht zugeschnitten war, wurde sie nacheinander in gradierte Alkohollösungen,
von 70% auf 100% ansteigend, gelegt. Daran schlossen sich zwei je
24 stündige Durchgänge in Toluol
an. Zum Schluß wurde sie mehrfach
in unpolymerisiertes Einbettmittel
eingelegt, so daß das MMA in die
Zellen eindringen konnte.
Die auf einen Aluminiumhalter aufgeklebte Probe wurde in eine mit frischem MMA gefüllte, speziell an-
Abb. 1: Poröse Beschichtung mit Co/Cr Perlen
Abb. 2: Poröse Beschichtung mit Ti-Gitter
Abb. 3: Eingebettete Probe auf Aluminiumhalter
gefertigte Teflonform gelegt und in
eine Vakuumkammer aus rostfreiem Stahl gestellt. Der Aluminiumhalter dient zum leichteren Einspannen der Probe bei der
Dünnschnittherstellung (Abb. 3).
Die Kammer wurde evakuiert, und
die Einbettung wurde im Wärmeschrank bei 37 °C ausgehärtet.
Herstellung der Dünnschnitte
Von der eingebetteten Implantat/
Knochenprobe wurden mit einer
niedrigtourigen Trennmaschine relativ dünne (300 µm) Schnitte abgetrennt. Eine mit synthetischem
Schleifmaterial besetzte Trennscheibe wurde dem üblicherweise
benutzten Diamantrennblatt vorgezogen. Die Trennzeiten sind kürzer
und es entstehen dünnere und glattere Proben. Eine Kombination aus
3
Abb. 4: Struers Rotopol/Pedemat
Abb. 5a: Speziell angefertigte Probenhalterplatte
Abb. 5b: Probenhalterplatte mit befestigter Probe
Abb. 6: Pedemat mit eingespannter
Probenhalterplatte
Trenn/Schmiermittelflüssigkeit
wird beim gesamten Trennvorgang
benutzt, und die Trennscheibe wurde zur Verbesserung der Trennergebnisse regelmäßig abgerichtet.
Auf die Probentrennfläche wurde
ein Mikroskopträger geklebt, wodurch die Probe eine feste Unterlage erhält und vermieden wird, daß
sie sich beim Trennen aufrollt. Zur
Herstellung einer repräsentativen
Schnittreihe der Probe ist eine Anzahl von Schnitten abgetrennt worden. Dabei wurde die eingebettete
Probe mit einer Mikrometervorschubschraube quer zur Trennblattebene geführt, so daß die Schnitte
plan und mit gleichbleibender Dicke
abgetrennt wurden.
Implantatlegierung unterschiedlich
lang. Einige Legierungen (Co/Cr
beispielsweise) erfordern längere
Schleifzeiten als Titanlegierungen.
Abhängig vom Implantattyp und
Probenlage im Implantat ist auch
die Metallschnittfläche unterschiedlich groß.
gangs geschah von Hand auf einer
Lunn-Major Schleifbank, wobei mit
den SiC-Grobschleifpapieren der
Körnung 220 bzw. 320 begonnen
wurde. Präparationsziel ist ein
planer Dünnschnitt, dessen biologisches Gewebe die Zellstruktur erkennen läßt und nur ein minimaler
Verlust von Metallperlen oder
Drahtfäden aufgetreten ist. Eine
Schnittdicke von weniger als 100 µm
wäre wünschenswert, doch läßt sich
dieses Ziel nicht immer ohne Zerstörung der Probe erreichen. Das
Ganze gleicht einer Gratwanderung
zwischen einer vollständigen Probe
mit korrekten Zelldetails und dem
völligen Verlust der Probe. Dieser
Optimierungsvorgang läßt sich nur
durch regelmäßige Probenkontrolle
im Mikroskop erzielen.
Zwei Mikroskopträger, die mit vergleichbar großen Metallflächen gleicher Metalltypen bestückt waren,
wurden auf die Probenhalterplatte
des Pedemat gespannt. Die erste
Schleifstufe ist bei allen Schnitten
gleich. Tabelle 1 verzeichnet die
verwendeten Parameter.
Tabelle 1:
Unterlage
Schleifen
Das Schleifen des Dünnschnitts
wurde in zwei Stufen durchgeführt,
wobei die Grobschleifstufe auf dem
automatischen Struers Schleifgerät
Rotopol/Pedemat (Abb. 4) erfolgte
und die abschließende Feinschleifstufe auf einer Lunn-Major Schleifbank von Hand ausgeführt wurde.
Der Fortgang dieses Schleifvorgangs ist laufend im Mikroskop
überprüft worden.
Eine den Erfordernissen entsprechend angefertigte rostfreie Probenhalterplatte diente als Halterung
für den Mikroskopträger und wurde
in das Pedemat Gerät eingespannt
(Abb. 5a, b und 6). Zur momentanen
Fixierung des Trägers wurde dessen
Rückseite mit Silikongel eingestrichen.
Mit dem MD-Fuga System wurden
SiC-Schleifpapiere verwendet, und
die Schleifzeiten waren je nach
Entnahmeort des Metalls am Implantat und abhängig vom Typ der
4
SiC-Papier
Körnung
# 220
Schmiermittel
Wasser
Rotation
Gleichlauf
U/min
150
Andruckkraft (N)
30 - 40
Zeit (min)
5
Weitere Schleifmaßnahmen wurden
individuell vorgenommen, wobei die
Probendicke zu berücksichtigen
war, aber noch viel mehr auf die
Unversehrtheit von Knochen/Gewebe geachtet werden mußte. Die Details des biologischen Gewebes wurden im Lichtmikroskop untersucht.
Der Schleifvorgang im Rotopol/
Pedemat wurde so lange fortgesetzt, bis etwa eine Dicke von
200 µm erreicht war. Unterhalb dieser Dicke ging die Probe in einen
sehr instabilen Zustand über, und
das biologische Gewebe wurde leicht
weggeschliffen und der hauchdünne
Metallteil begann wegzubrechen.
Die Fortsetzung des Schleifvor-
Histologisches Anfärben
und Untersuchung
Für das histologische Anfärben werden mindestens zwei Schnitte je
Probe präpariert, wovon die eine
mit Giemsa, die andere mit Toluidin-Blau angefärbt wurde (Abb. 7).
Die Färbung macht die Unterscheidung von Knochen und Fasergewebe
möglich. Die Proben wurden im
Lichtmikroskop untersucht und die
Eindringtiefe von Knochen oder Gewebe bestimmt.
Obwohl die Untersuchungsergebnisse lediglich bestimmte,
kleine Bereiche des Implantats repräsentieren, kann sich der Chirurg
trotzdem ein ausreichend gutes Bild
von der Unversehrtheit der örtlichen Einbindung des orthopädischen Implantats machen.
Abb. 7:
Dünnschnitt mit
Toluidin-Blau
angefärbt,siehe
Abb.11
Abb. 8:
Knieimplantat - Aus
dem Bereich
der Patella.
(Co/Cr Perlen)
Knochenmaterial
umgibt die Perlen.
32x
Abb. 9:
Knieimplantat - Aus
dem Bereich der
Patella.
(Co/Cr Perlen)
Fasergewebe am
Grund der porösen
Beschichtung,
Knochen an der
Oberfläche.
10x
Abb. 10:
Knieimplantat - Aus
dem Bereich des
Femurs. (Co/Cr
Perlen)
Fasergewebe am
Grund der porösen
Beschichtung,
Knochen an der
Oberfläche.
12,5x
Abb. 11:
Knieimplantat - Aus
dem Bereich der
Patella. (Titangitter)
Knochenmaterial
umgibt das Gitter.
Siehe Abb. 7.
10x
Abb. 12
Hüftgelenkimplantat
- Aus dem Bereich des
Femurs. (Titangitter)
Knochenmaterial
umgibt das Gitter.
7,5x
Kay Geels erhält den
Henry Clifton Sorby Preis
31. Jahresversammlung der IMS im
Juli in Ottawa, Kanada an Kay
Geels überreicht, anläßlich dessen
er den Vortrag, “Das wahre Gefüge
von Werkstoffen - metallographische
Präparation von Sorby bis zur Gegenwart” gehalten hat.
Der Henry Clifton Sorby Preis ist
eine hohe Auszeichnung, die von
der International Metallographic
Society (IMS) überreicht wird. Jedes Jahr wird ein Preisträger ausgewählt, der sich durch hervorragende Beiträge auf dem Gebiet der
Metallographie ausgezeichnet hat.
Dieser Preis wurde 1998 auf der
Kay Geels wurde 1934 geboren und
1962 in der metallographischen Abteilung der Struers Chemiske Laboratorium, als Maschinenbauingenieur eingestellt.
1964 wurde er Leiter dieser Abteilung. In den folgenden Jahren hat
Struers ein komplettes Programm
für die metallographische Probenpräparation entwickelt.
Nach 10 Jahren bei Struers ging
Kay Geels als technischer Ratgeber
nach Kenia, angestellt vom däni-
schen Außenministerium, kehrte jedoch 1976 als Entwicklungs- und
Produktionsleiter zu Struers zurück.
Mehr als 30 Jahre hat Kay Geels in
leitenden Positionen bei Struers dazu beigetragen, daß sich die Firma
von einem relativ kleinen Lieferanten für materialographische Geräte
und Verbrauchsmaterialien zu einem der größten auf der Welt entwickelt hat und er hat bei der Entwicklung von neuen Produkten und
Methoden eine wesentliche Rolle
gespielt.
Kay Geels ist ein Mitglied des
Redaktionsausschusses von
Structure seit die Zeitschrift 1981
gegründet wurde.
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