LEBENDNACHWEIS VON EINZELELEMENTEN DES

Published November 1, 1965
LEBENDNACHWEIS
VON EINZELELEMENTEN
DES ENDOPLASMATISCHEN
MANFRED
RETIKULUMS
GIRBARDT
Aus dem Institut ftir Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der Deutschen Akademie der
Wissenschaften zu Berlin, Jena, Deutschland
ABSTRACT
Die Erfassung der Dynamik intraplasmatischer
M e m b r a n e n (ER) ist ein wesentliches Anliegen
zellbiologischer Arbeit, da wichtige Beitr~ige zum
Verst~indnis der funktionellen Bedeutung der
Membransysteme zu erwarten sind. Leider vermag
das statische elektronenoptische Bild nur sehr bedingt Aussagen fiber die morphologischen Ver/inderungen der Einzelelemente des E R im Verlaufe
von Zellprozessen zu machen. Aul~erdem scheint
die weit unterhalb der lichtoptischen AuflSsungsgrenze liegende Dicke der Einzelmembranen eine
detaillierte lichtoptische Lebendbeobachtung auszuschliel]en. Die bisherigen Berichte (3, 8, 9)
beschr~inken sich daher auf die phasenoptische
Abbildung jener Zellbereiche, in denen eine
gr61]ere Anzahl racist parallel verlaufender M e m branen vorhanden ist. Die Hauptschwierigkeit
ffir die Interpretation der erhaltenen Bilder liegt
in der Entscheidung, ob die sichtbar werdenden
Strukturen nur infolge Aggregationen von Einzelmembranen zustandekommen oder ob sie Realstrukturen der Zelle repr~isentieren.
I m R a h m e n der vorliegenden Arbeit soll der
Nachweis erbracht werden, dal] unter gfinstigen
Bedingungen flache Einzelcisternen mit einem
Durchmesser von 200 bis 300 A in der lebenden
und fixierten Zelle phasenoptisch abgebildet werden k6nnen.
MATERIAL
UND METHODE
Der verwendete Stamm des Basidiomyceten Polystivtus versicolor war der gleiche wie in den bisherigen
Arbeiten (4). Er wurde auf Malz-Pepton-Agar (4
Prozent ]Vfalzextrakt, 0,5 Prozent Pepton, 2 Prozent
Agar) bei +24 ° C kultiviert und nach der an anderer
Stelle ausfiihrlich beschriebenen Methode (7) zielprfipariert. Die Fixierung erfolgte mit 2 Prozent KMnO4
(gel6st in Leitungswasser) bei Zimmcrtemperatur.
Nach Aceton-Entw~isserung wurden die Kulturen in
Vestopal eingebettet, mit dem Porter-Blum oder
LKB Ultratome geschnitten und die Serienschnitte
auf Schlitzblenden (0,1 X 1 mm), die mit kohlestabilisicrtcn Zaponlackfilmen bezogen waren, aufgefangen. Als Phasenkontrastmikroskope standen die
des VEB Carl Zeiss, Jena, und fiir die Lebendaufnahmen eine selbst angefertigte Elektronenblitzeinrichtung zur Verfiigung. Die elektronenoptischen
Aufnahmcn wurden mit dem SEM 3 oder K E M I
(VEB Werk ffir Fernsehelektronik) bei 60 oder 50
K V gemacht.
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By means of a special selective preparation technique, it is possible to investigate in thin
sections, by electron microscopy, areas of a cell that have been observed in the living state,
by phase-contrast microscopy, up to the time of fixation. Structures recorded in the living
state can thus be compared to structures seen in electron micrographs. In cells of the fungus
Polystictus versicolor, aggregates of membrane systems as well as single cisternae with a diameter of approximately 200 to 300 A can be detected with phase optics. It can be shown, by
calculation, that these structures, which are far below the limit of resolution of the light optical system, give enough contrast to be discernible by phase optics. Thus a basis is provided
for observing the dynamics of membrane systems which perhaps may contribute to the
analysis of the functional significance of these cell components.
Published November 1, 1965
ERGEBNISSE
Bereits friiher ist beschreiben worden, dab sich
nach Fcrtigstcllung der Qucrw~indc (4) eigenartige
Ballungen phasenoptisch grauer Substanz ("Plasmaballcn") bilden. Diese sind besonders gut im
hochgradig hydratisicrtcn und organcllenarmen
basalen P o l d e r Terminal- oder Subtcrminalzelle
zu sehen (Abb. 1 a). Sie wandcrn meist kurzc Zeit
nach ihrer Entstchung apikalw~irts und crfahren
dabci zahlrciche morphologischc Wandlungen, die
filmisch rcgistriert wurdcn (6). 1 Die Ballungen sind
x Der Film (T-HF 552) kann vom DEFA-Auflenhandel, Berlin N 58, Milastral~e 2 (DDR) bezogen
werden.
auch nach der Fixierung (Abb. 1 b) sowie im polymerisierten B1Ockchen unmittelbar vor dem ersten
Sehnitt (Abb. 1 c)lichtoptisch zu identifizieren.
Elektronenoptisch bestehen sie aus einer Vielzahl yon M e m b r a n e n (Abb. 1 d), die meist unterschiedlich grol]e Vesikel
(fixierungsbedingte
Fragmentation?) teilweise jedoch auch grSl]ere
Cisternen bilden (Abb. 1 e). Nach KMnO4-Fixierung sind die konstituierenden M e m b r a n e n dreischichtig und 65 bis 75 A dick (Abb. 2). Sie unterscheiden sich dimensions- und aufbaumM~ig yon
der asymmetrischen, 90 bis 100 A dicken Cytoplasmamembran (Abb. 2). Der ganze Komplex
membran6ser Gebilde ist nicht durch eine geschlossene M e m b r a n gegen das fibrige Grundplas-
Zeichenerkl'arung
apikaler 1)ol der Subterminalzelle
basaler Polder Terminalzelle
Cisterne
Plasmalemma
vesikuliire Abschntirungen
Compartiment
MB,
Mi,
NH,
PK,
QW,
V,
Membranenballung
Mitochondrium
Nebenhyphe
Porenkappe
Querwand
Vakuole
ABBILDUNG 1 a Membranenballungen (MB), entstanden in der Querwandregion des
basalen Pols der Terminalzelle (BPT) 5 Sekunden vor der Fixicrung. Das Grtmdplasma
des apikalen Pols der Subterminalen (APS) mid der Nebenhyphe (NH) besitzt einen
haheren Brechungsindex, erscheint daher dunkler und ist weniger hydratisiert. Lebend,
X 1700.
ABBILDUNG1 b Die gleiche Stelle wie in Abb. 1 a naeh der Fixierung. Die Membranenballung hat ihre ituflere Form etwas gettndert, die iibrigen Komponenten sind mehr oder
weniger form- und lagetreu erhalten geblieben. )< 1700.
ABBILDUNG1 C Die gleiche Stelle wie in Abb. 1 a nach Entw~sserung und Einbettung im
Vestopal-Bl~ickchen, unmittelbr vor dem ersten Schnitt (die Aufnahme ist seitenverkehrt
kopiert, um den Vergleich zu erlcichtern). X 1700.
ABBILDUNO 1 d Die gleiche Stelle wie in Abb. 1 a i m medianen Li4ngsschnitt. X 1800.
ABBILDUNGI e Starker vergrSl~erter Ausschnitt von Abb. 1 d, auf dem dieEinzelelemente
(Cisternen) der Membranenballung zu sehen sind. Der Unterschied dcr Grundcytoplasmen
des basalen Pols der Terminalzelle (BPT) und des apikalen Pols der Subtermi~alzelle
(APS) ist elektronenoptisch als unterschicdlich dichte Packung der Koagulate erhalten geblieben. X 30,000.
ABBILDUNG ~ Starker vergri~erter Ausschnitt, der dem in Abb. 1 e eingezeichneten
entspricht, jedoeh yon einer anderen Zelle in der gleichen Entwicklungsphase stammt. Die
cisternalen Membranen sind dreischichtig (Pfeil) und konstant 65 bis 75 A dick, gleichgiiltig ob sie im BPT oder im APS liegen. Das Plasmalemma (CM) ist asymmetrisch gebaut
(90 bis 100 A dick), liegt beidscitig der Querwand (QW) an und kann vesikuliire Absclmiirungen (CMV) bUden. X 200,000.
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THs JovaNAL or C ~ L BmLOGY • VOLLEY.~7, 1965
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APS,
BPT,
Ci,
CM,
CMV,
Co,
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MANFRED GIRBARDT Einzeldementen des endoplasmatischen Rdikulums
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Published November 1, 1965
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T R E JOURNAL OF CELL BIOLOGY • VOLUME
meist durch einen etwas hSheren Brechungsindex
aus, mit Sicherheit aber vermag nur das Elektronenmikroskop zu entscheiden, zu welcher
Kategorie von F~den die beobachtete Struktur
z~ihlt.
DISKUSSION
Das Aufl6sungsverm6gen und die Erkennung
kleincr isolierter Einzelheiten sind zwei wesentlich
verschicdene Dinge (1). Ersteres sagt nichts fiber
die Erkennbarkeitsgrenze solcher Einzelheiten aus,
sondcrn lediglich wie grol~ der Abstand zweier
Objektdetails mindestens sein muf, um sic noch
als zwei getrennte Bildelemente wahrnehmen zu
kSnnen. Man kann also nicht so argumentieren,
daf alle Objektdetails unsichtbar bleiben, die
kleiner als die AuflSsungsgrenze sind.
Unter gfinstigen Bedingungen k6nnen im
Mikroskop noch Objektdetails sichtbar gemacht
werden, die die Aufl6sungsgrenze um Gr61~enordnungen unterschreiten (Spaltultramikroskopie).
Im hier behandelten Fall ist erwiesen, dab im
Lichtmikroskop bei ausreichendem Kontrast
einzelne Compartimentationscisternen sichtbar
gemacht werden k6nnen. Dies ist allerdings nur
m6glich, wenn die Cisterne geniigend weit, also
mindestens 0,2 /z (bedingt durch die Aufl6sungsgrenze des Lichtmikroskops) yon einer benachbarten membran6sen Komponente entfernt ist und
in stark hydratisiertem Cytoplasma liegt. Zwei
enger als 0,2 /z beieinanderliegende Cisternen
erscheinen als ein Element. Ebenso ist lichtoptisch
nicht zu verifizieren, dal3 jede Cisterne oder Vesikel aus zwei Membranen besteht, die etwa 300 A
( = intracisternaler Raum) voneinander entfernt
sind.
Die mathematische Behandlung der Frage, wie
dick eine Struktur (im vorliegenden Falle die
Compartimentationscisterne) sein mul~, um phasenoptisch, im Hellfeld oder bei Schrfigbeleuchtung erkennbar zu sein, ist eingehend von Dr. H.
Beyer bearbeitet worden. Sie soll an anderer
Stelle (2) ver6ffentlicht werden. Im Zusammenhang mit dem hier gezeigten sind nur einige
Hauptergebnisse yon Interesse.
F/ir die Berechnungen lag der in Abb. 3 gezeigte
Fall zugrunde. Mit hoher Wahrscheinlichkeit ist
anzunehmen, d a f e s sich bei den beobachteten
Membranen um Phospholipoidmembranen handelt, deren Brechungsindex mit nD = 1,50 angenommen ist (nach neueren Befunden liegt der
Brechungsindex sogar bei nD = 1,66, Verweis-
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ma abgeschlossen, obwohl er phasenoptisch deutlich
vom Grundplasma abgegrenzt ist und zumindest
anf/inglich als physikalische Einheit agiert. Es
besteht daher die M6glichkeit, d a f die "Vesikel"
Teile eines kontinuierlichen Systems sind. Die
Frage war trotz Vorhandenseins langer, ununterbrochener Schnittserien in diesem Falle nicht
eindeutig zu beantworten.
Hfiufig bildet sich aus dem Membranenkomplex
oder ohne dal~ es zur Bildung eines solchen fiberhaupt kommt, bereits in N/ihe der Querwand eine
einzige Schicht. Im Schnitt (Abb. 3 c) erweckt sie
den Eindruck einer Vesikelfassade, stellt aber,
wie die Rekonstruktion ergab, ein cisternales,
perforiertes Kontinuum dar. Abb. 3 a zeigt eine
solche neugebildete Schicht zun~ichst im Lebendbild, das 5 Sekunden vor dem AbtSten fotografiert
wurde. Nach der Fixierung (Abb. 3 b) ist die
Form der Schicht fast unver~indert erhalten, und
die elektronenoptische Aufnahme der gleichen
Stelle (Abb. 3 c) belegt, dal~ die Schicht ein cisternales Einzelelement darstellt, dessen Cisternen
maximal 300 A dick sind. Die Rekonstruktion
(Abb. 3 d) aus 64 Serienschnitten l~ift deutllch
werden, daft ein intrazellul~irer "Schlauch" mit
perforierter Wandung gebildet worden ist.
Mit Hilfe des Phasenkontrastmikroskops ist es
nicht mSglich zu entscheiden, ob die Wandung des
Schlauches ohne L6cher oder perforiert ist, ob
also eine vollst~indige Compartimentation eintritt
oder nicht. Abb. 4 a zeigt die letzte Lebendaufnahme einer kugelf6rmigen Schicht in unmittelbarer Nfihe der Querwand. Die zugehSrige elektronenoptische Aufnahme der gleichen Stelle
(Abb. 4 b) macht deutlich, dal~ es sich in diesem
Falle (anders als bei dem in Abb. 3 beschriebenen)
um ein eehtes Compartiment handelt, dessen
Wandung eine einzige Cisterne ist.
Die dargestellten ER-Schichten erwecken in der
lebenden Zelle den Eindruck eines sich schl/ingelnd bewegenden "Fadens." Eine Vorstellung
hiervon sollen die im Abstand von 10 Sekunden
aufgenommenen beiden Lebendbilder (Abb. 5 a,
b) vermitteln. Die vor der Querwand liegende
Schicht ist, wie ein Vergleich der beiden Aufnahmen zeigt, in lebhafter Bewegung. Gleichzeitig
mahnen diese Aufnahmen zur Vorsicht bei der
Interpretation eines phasenoptischen Lebendbildes: Ein als Faden in Erscheinung tretendes
Gebilde kann ebensogut ein ffidiges Mitochondrium (Abb. 5 c, d) wie eine Einzelcisterne (Abb.
5 c, e) sein. Die Mitochondrien zeichnen sich zwar
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ABBILDUNG 3 a Eine durch Umbildung einer Membranenballung entstandene Schicht aus zusammenh~ingenden Cisternen (Ci). Daneben sind in Querwandn~ihe und apikalwiirts zwei relativ kleine Membranenballungen (MB) vorhanden. Unterschiede zwischen BPT und APS wie in Abb. 1. Lebend, X ~ 7 0 .
ABBILDUNG 3 b Gleiche Stelle wie Abb. 3 a nach erfolgter Fixierung. X ~ 7 0 .
ABBILDUNG 8 C Medianschnitt der gleichen Stelle wie Abb. 3 a. Die dort sichtbare Schicht (Ci) besteht
aus einem cisternalen, perforierten Kontinuum. X 9000.
ABBILDUNG 3 d Die Rekonstruktion aus 64 Serienschnitten zeigt, dab die Cisternen (Ci) elnen geschlossenen "Schlauch" bilden, dessen Wandung perforiert ist.
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Tr[~. JOURNAL OF CELL BIOLOaY - VOLUME ~7, 1965
Published November 1, 1965
t31
R2 -- Ra = ~ R < < R 1 ; R x = 1 , 5 # ;
nl = n3 = 1,35; n2 = 1,50.
aR
ABBILDUNG6 Schema des eisternalen Schlauches: nl
und n3, Brechzahlen des organellenfreien Cytoplasmas;
n2, Brechzahl der Lipoproteinmembranen; Rl und R2,
innerer und iiul~erer Radius des Schlauches.
Ohne die hingebungsvolle Mitarbeit mehrerer technischer Kr/ifte w/iren die Untersuchungen nieht
durchffihrbar gewesen. Mein Dank gilt allen Beteiligten, die in vorbildlicher Weise die Teilaufgaben 16sten.
Eingegangen am 5 Mai, 19 65.
LITERATUR
1. BEYER, H., Theorie und Praxis des Phasenkontrastverfahrens, Leipzig, Akademische Verlagsgesellschaff Geest und Portig, 1965.
2. BEYER, H., Zur Abbildung extrem dfinnwandiger
nichtabsorbierender R6hren im Lichtmikroskop, Jenaer Jahrb., 1966, im Druck.
3. FAWCETT, D. W., and ITO, S., Observations on
the cytoplasmic membranes of testicular cells,
examined by phase-contrast and electron
microscopy, J. Biophysic. and Biochem. Cytol.,
1958, 4, 135.
4. GmBAROT, M., Lebendbeobachtungen an Polystictus versicolor (L.), Flora, 1955, 142,540.
5. GIRBAROT, M., Licht- und elektronenoptische
ABBILDUNG4 a Bildung einer kugelf51maigen Schieht, die als "Ring" erscheint und dureh
Pfeil markiert ist. Lebend, X ~70.
ABmLDUNG 4 b Gleiche Stelle im Medianschnitt. Die Wandung der Schicht stellt eine
geschlossene Cisterne dar, es bildet sich daher ein echtes Compartiment (Cel). Weitere
mehr oder weniger vollstandig geschlossene Compartiments (Co) liegen beidseitig parallel
der Querwand. X 37,000.
ABBILDUNG5 a und b In starker Bewegung befindliches cisternales Kontinuum. Zwischen
5 a and b sind bei der Aufnahme 10 Sekunden verstrichen. In der Schnalle liegt ein f~diges
Mitochondrium (Mi), das im Breehungsindex nur wenig yon den cisternalen Membranen
(Ci) unterschieden ist. Lebend, X 1700.
ABBILDUNG5 C Gleiehe Stelle wie 5 a im Medianschnitt. Das eisternale Kontinuum (Ci)
ist bei der Fixierung fragmentiert, so dal3 nur noch Teile sichtbar werden. Die fiidigen Mitochondrien (Mi) sind dagegen gut erhalten. X 5600.
ABmLDUNG 5 d
Tell des fi~digen Mitochondriums (Mi). >( 13,000.
ABmLDUNG 5 e Teil des cisternalen Kontinuums (Ci).)< 13,000.
MANFRED GIRBARDT Einzddementen des endoplasmatischen Retikulums
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n u m m e r I0). D e r Brechungsindex des u m g e b e n den, stark hydratisierten Cytoplasmas betr~igt
etwa 1,35 (5). Der aus Cisternen gebildete
Sehlauch (siehe Abb. 3 d) ist a n n / i h e r n d cylindrisch u n d zeigt im Q u e r s c h n i t t die schematisch
in Abb. 6 dargestelhe F o r m (11).
Die Frage lautet: Wie gro[~ mul~ u n t e r d e n gegeb e n e n B e d i n g u n g e n /X R mindestens sein, d a m i t
d e r S c h l a u c h sichtbar wird?
Es zeigte sich:
1. /XR = 50 A i s t h i n r e i c h e n d , u m p h a s e n o p tisch e r k e n n b a r zu sein. Die 50 A dicke
M e m b r a n erscheint im Mikroskop allerdings als 0,2 # dicke S t r u k t u r u n d ist bei
/XR = 100 A i m Mikroskop 0,4 g dick.
2. D e r d u r c h die W i r k u n g der A p e r t u r b e g r e n z u n g im Hellfeld entstehende K o n t r a s t
reicht selbst b e i / X R = 100 A n i c h t aus, urn
die S t r u k t u r sichtbar werden zu lassen.
Published November 1, 1965
Untersuchungen an Polystictus versicolor (L.). I.
Der Wassergehalt des Hyaloplasmas vegetafiver Zellen, Bet. deutsch, bot. Ges., 1960, 73,
227.
6. GIRBARDT, M., Die Entstehung endoplasmatischer
Membranen in der Zelle des Pilzes Polystictus
versi¢olor (Film), in Abstracts of the 10th International Botanical Congress, 1964, (B. L.
Burtt, editor), Edinburgh, 1964, 217.
7. GIRBARDT, M., Eine Methode der Zielschnittpr/iparation, 1965, in Vorbereitung.
8. ITO, S., Light and electron microscopic study of
membranous cytoplasmic organelles, in The In-
terpretation of Ultrastructure, (R. J. C. Harris,
editor), New York, Academic Press, Inc., 1962,
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9.
ROSE, G E O R G E G., and POMERAT, C. M., Phase
contrast observations of the endoplasmic re-
ticulum in living tissue cultures, J. Biophysi¢.
and Biochem. Cytol., 1960, 8,423.
10. THOMPSON, T. E., in Cellular Membranes in Development, New York, Academic Press, Inc.,
1964, 83.
11. WOLTER, H., Zur Abbildung zylindrischer Phasenobjekte elliptischen Querschnitts, Ann.
Physik, 1950, 7, 147.
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440
THE JOURNAL OF CELL BIOLOGY •
VOLUME 27, 1965

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