Enzyme Specificities Determine Starch - ETH E

DISS. ETH NO. 23509
Enzyme Specificities Determine Starch Formation
in Arabidopsis Leaves
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
Kuan-Jen Lu
born on 16.11.1980
citizen of Taiwan
accepted on the recommendation of
Prof. Samuel C. Zeeman (examiner)
Prof. Wilhelm Gruissem (co-examiner)
Prof. Alison M. Smith (co-examiner)
2016
Summary
Starch is synthesized in plants and algae as semi-crystalline granules and is composed of
two types of glucose polymers - amylose and amylopectin. Amylose is a long, rarely
branched polysaccharide, whereas amylopectin is a relatively highly branched glucan, and
constitutes around 80% of mass of most starches. While some features of starch are highly
conserved, there is diversity in numerous factors, including structural features of the
polymers,
polymer
composition,
starch
granule
size,
and
granule
morphology.
Consequently, the physicochemical properties of starches vary between plant sources,
resulting in a wealth of applications for starch in the food- and non-food industries. To
advance the use of starches, it is essential to understand how plants synthesize it, and which
factors determine the form of native starch and relate this to its functional properties.
My aim was to investigate the specificities of enzymes in starch biosynthesis using the
model plant Arabidopsis thaliana. The first part of my work (Chapter 2) focused on
analyzing starch formation from a series of mutants deficient in different combinations of
the biosynthetic enzymes – starch synthases (SSs) and the isoamylase (ISA) type of
debranching enzyme (DBE). Two mutant plants - ss1ss2ss3 triple mutants and isa1isa2
double mutants were crossed and mutant combinations selected from the F2 progeny. SS1,
SS2, and SS3 are all starch synthases that produce certain lengths of glucan chains, while
ISA1 and ISA2 form a single heteromultimeric enzyme that removes some branches to
facilitate starch crystallization. Analysis of glucan amount, glucan structure and solubility,
and granule morphology in these mutants collectively demonstrate that both the chain
lengths and the branching patterns of amylopectin influence starch granule formation.
The second part of this work (Chapter 3) investigated the functions of different branching
enzyme (BE) types in starch biosynthesis. BEs transfer part of a linear, α-1,4-linked chain to
itself or to a neighboring chain creating an α-1,6-linkage (i.e. a branch point). Different BE
types involved in glycogen or amylopectin synthesis have distinct, albeit overlapping,
specificities in vitro. To compare their roles and ability to mediate starch biosynthesis in
vivo, (ach of WKH three types of BE (maize BE IIa [ZmBE2a], potato BE I [StBE1] and
Escherichia coli glycogen BE [EcGLGB]) ZDV LQGLYLGXDOO\ H[SUHVVHG in an Arabidopsis
mutant background (be2be3), which lacks its endogenous BEs and is therefore unable to
make starch. Analysis of glucan synthesis in these lines revealed different degrees of
complementation depending
1
on BE type. Full complementation was achieved by expression of ZmBE2a – the enzyme
most closely related to the Arabidopsis BEs. Partial complementation was observed in lines
expressing StBE1, while EcGLGB expression restored only minimal amounts of starch,
which was aberrant in its chain length distribution, branching pattern, and granule
morphology. These data add significantly to our understanding of how BE properties
influence starch production and amylopectin fine structure. Part three of my thesis (Chapter
4) investigated starch granule initiation. I expressed the reportedly self-priming glycogen
synthase (GS) from Agrobacterium tumefaciens in Arabidopsis ss3ss4 mutant plants, which
are deficient in granule initiation. This restored granule formation, although granule numbers
varied significantly between individual chloroplasts and granule morphology was abnormal.
I conclude that GS indeed promotes granule initiation, but is not capable of fulfilling all the
functions of SS3 and SS4. Finally, in Chapter 5, I extended the work on starch granule
initiation using the ss4 single mutant, which rarely produces more than a single starch
granule per chloroplast. I transformed ss4 with constructs encoding SS4 variants or fusion
proteins between A. tumefaciens GS and the non-catalytic N-terminal region of SS4
VHSDUDWHO\. Observing granule formation in each line revealed that the catalytic C-terminal
region of SS4 alone simply promotes the initiation of aberrant granules in a similar way to
the GS. However, my data also showV that WKH N-terminal region of SS4 is critical LQ
determining starch granule morphology as normal granules were produced when it was fused
to GS.
2
Summary in German (Zusammenfassung)
Stärke wird von Pflanzen und Algen in Form von semi-kristallinen Körnern synthetisiert.
Sie besteht aus zweierlei Glukosepolymeren - Amylose und Amlyopektin. Während
Amylose ein langkettiges, kaum verzweigtes Polysaccharid darstellt, ist Amylopektin
relativ stark verzweigt und bildet rund 80% der Masse der meisten Stärkesorten. Einige
Merkmale von Stärke treffen auf viele Sorten zu; andere hingegen variieren beträchtlich,
beispielsweise die Molekülstrukturen von Amylopektin, der Anteil an Amylose und die
Grösse und Morphologie der Körner. In Folge unterscheiden sich Stärkesorten je nach
pflanzlichem Ursprung in ihrem physikalisch-chemischem Verhalten und können in
zahlreichen industriellen Bereichen eingesetzt werden. Um die Nutzung von Stärke weiter
auszuweiten, ist es von entscheidender Bedeutung zu verstehen, wie sie genau in Pflanzen
synthetisiert wird, welche Faktoren die Stärkestruktur bedingen und wie sich diese letztlich
auf ihre Funktionalität auswirken.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin, die Spezifitäten von stärkeherstellenden
Enzymen mithilfe der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu studieren. Der erste Teil (2.
Kapitel) behandelte dies anhand einer Serie an Pflanzenlinien, in denen unterschiedliche
Kombinationen
von
Enzymen
mutiert
sind
-
Stärkesynthasen
(SS)
und
das
Entzweigungsenzym Isoamylase (ISA). Dafür wurden zunächst zwei mutierte Pflanzen der
Genotypen ss1ss2ss3 und isa1isa2 miteinander gekreuzt und die gewünschten multiplen
Mutanten aus der F2-Generation isoliert. Die Stärkesynthasen SS1, SS2 und SS3
produzieren Zuckerketten unterschiedlicher Längen, während ISA1 und ISA2 zusammen
ein Enzym bilden, das bestimmte Ketten entfernt, um die Kristallisation von Stärke zu
erleichtern. Durch die Analyse der Menge, Struktur, Form und Löslichkeit der in den Linien
produzierten Polysaccharide konnte ich dann zeigen, dass sowohl die Länge als auch das
Verzweigungsmuster
der
Amylopektinketten
die
Ausbildung
von
Stärkekörnern
massgeblich beeinflussen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit (3. Kapitel) wurden die Funktionen von verschiedenen
Verzweigungsenzymen (branching enzymes, BEs) untersucht. BEs übertragen Teile einer
Kette auf dieselbe oder eine andere Kette, wobei sie Verzweigungen bilden. Im Reagenzglas
weisen verschiedene BE-Klassen unterschiedliche, wenngleich teils überlappende
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Spezifitäten auf. Um die Wirkungsweisen der BE-Klassen auch in der Pflanzenzelle zu
vergleichen, habe ich von jeder Klasse ein Verzweigungsenzym in einer ArabidopsisMutante exprimiert - diese Mutante besitzt keine eigenen Verzweigungsenzyme (Genotyp
be2be3) und kann folglich keine Stärke mehr herstellen. Es zeigten sich drei verschiedene
Komplementierungsgrade: Expression von BE2a aus Mais (welches die grösste Ähnlichkeit
zu den entsprechenden Arabidopsis-Enzymen besitzt) konnte den Phänotyp vollständig
komplementieren, das heisst, es erlaubte die Synthese von normalen Stärkekörnen; BE1 aus
Kartoffel komplementierte teilweise, während das Enzym aus dem Bakterium Escherichia
coli (EcGLGB) nur zu geringfügiger Stärkesynthese führte. In letzterem Fall war die Stärke
war zudem hinsichtlich Molekülstruktur und Kornmorphologie stark verändert. Diese
Ergebnisse verbessern unser Verständnis über die Rolle von Verzweigungsenzymen
erheblich; insbesondere klären sie, wie die Spezifitäten dieser Enzyme die Stärkesynthese
und Amylopektinstruktur beeinflussen.
Der dritte Teil meiner Dissertation (4. Kapitel) behandelte die Initiierung der Stärkebildung.
Dazu wurde die Glykogensynthase (GS) aus Agrobakterium tumefaciens in einer
Arabidopsis-Mutante exprimiert, die selbst keine Körner mehr initiieren kann (Genotyp
ss3ss4). GS kann bekanntermassen die Polysaccharidsynthese selbst starten. In der Tat
ermöglichte die Präsenz dieses Enzymes auch die Stärkesynthese in der ArabidopsisMutante, obwohl die Anzahl von Stärkekörnern von Chloroplast zu Chloroplast schwankte
und die Kornmorphologie abnormal war. Daraus schliesse ich, dass GS zwar die Initiierung
von Stärkekörnern fördert, aber nicht alle Funktionen von SS3 und SS4 ersetzen kann.
Dieser Aspekt wurde im 5. Kapitel noch vertieft, hier unter Verwendung einer ArabidopsisLinie, die im SS4-Gen mutiert ist und deshalb nur in wenigen Chloroplasten mehr als ein
Stärkekorn produziert. In diesen Pflanzen habe ich verschiedene Variationen von SS4 und
Fusionsprodukte aus GS (aus Agrobacterium) und der nichtkatalysierenden N-terminalen
Region von SS4 exprimiert. Die Untersuchung der Stärkekornbildung in den verschiedenen
Pflanzenlinien zeigte, dass die katalysierende C-terminale Hälfte von SS4 ebenso wie GS
zur Ausbildung von abnormalen Körnern führt. Meine Daten deuten darauf hin, dass die Nterminale Region von SS4 die Morphologie von Stärkekörnern bestimmt, da diese Region
als Fusionsprodukt mit GS zur Synthese von normalen Körnern führte.
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