下水試料中の女性ホルモン 測定法の課題 －LC/MS/MSとELISAの比較から－ 建設省土木研究所 ○高橋明宏、小森行也、矢古宇靖子、 岡安祐司、斉藤正義、東谷忠、田中宏明 背景・目的 • • • • 17βｴｽﾄﾗｼﾞｵｰﾙの内分泌攪乱作用大 下水の内分泌攪乱作用にしめる割合大 実態調査（下水道）はＥＬＩＳＡ法を使用 ＥＬＩＳＡ法は測定簡易 buｔ 正・負の誤差 ↓ • LC/MS/MSを用いた測定法の検討 • ＥＬＩＳＡ法の測定値を確認 LC/MS/MS法の検討 • GC/MS ： 誘導体化が必要 抱合体の分解必要 形態別の把握が困難 • LC/MS/MS： 誘導体化が不要 抱合体の分解不要 形態別の把握が可能 • 使用装置 ： FINNIGAN TSQ7000 条件検討① ｲｵﾝ化法と特定ｲｵﾝ MW 特定ｲｵﾝ AP-ESI AP-CI Posi Nega Posi Nega 17βE2 272 [M-H]－ × 271 × 271 EE2 296 [M-H]－ × 295 × 295 E2-Ac 314 [M-H]－ × 313 × 313 E2-3Sul(Na) 374 [M-Na]－ × 351 × × Estrone 270 [M-H]－ － 269 － － Estriol 288 [M-H]－ － 287 － － 条件検討② MS/MS測定条件 親ｲｵﾝ Collision Energy と Daughter Ions 20eV 30eV 40eV 50eV 17βE2 271 × × 145,183 145,183 EE2 295 × × 145 145,159 E2-Ac 313 × 253 253 145 E2-3Sul(Na) 351 × 271 271 271 Estrone 269 × (145) 145 145 Estriol 287 × × 145,171 145,171 ｲｵﾝ強度が減少、BGが低下、S/N比が10倍以上向上 測定条件 • • • • • LC/MS/MS法 装 置：TSQ7000、HP1100 ｶﾗﾑ：HP Zorbax Eclops XDB-C18、2.1×150mm 移動相：ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ/水（60:40）、0.2mL/min 注入量：10μL ｲｵﾝ化 ：AP-ESI Negative、Collision Energy 40eV、 Argon 2.2-2.3 mTorr • 測定質量数：271( Parent )、145( Daughter ) 供試試料 （下水試料） 下水処理方式 処理水量 Ａ 標準活性汚泥法 172 千ｍ３/日 Ｂ 標準活性汚泥法 152 千ｍ３/日 Ｃ 標準活性汚泥法 ＋砂ろ過＋礫間接触酸化 49 千ｍ３/日 Ｄ 循環式硝化脱窒法 92 千ｍ３/日 Ｅ 凝集剤添加循環変法 ＋砂ろ過 118 千ｍ３/日 １１年７，８，９月、スポット、流入と放流 試料調整 LC/MS/MS（抽出） 試料1000ml SS ろ液 ろ過 超音波抽出（アセトン） Ｃ１８固相抽出 溶出（EtOAc/MeOH＝1/5） 乾固 抽出物 未精製試料の測定 Standard 17βEstradiol Influent m/z=271 17βEstradiol-d3 m/z=273 Ethnyl Estradiol m/z=295 4.6×150mm、MeCN/H2O=6/4、0.4ml/min 精製方法 TLC法 • Silica Gel 60 (MERCK)、CHCl3/ｱｾﾄﾝ=9/1 • 回収率は60～70％ • 抱合体の精製は不十分 展開層 最下層 Ｒｆ値 0.0-0.2 1. 2. 下層 中間層 0.2-0.4 0.4-0.6 上層 最上層 0.6-0.8 0.8-1.0 17βE2 0 0 100 0 0 EE2 0 0 100 0 0 E2-Ac 0.4 0.6 0.2 98.8 0 E2-3Sul(Na) 85.8 7.2 4.1 1.6 1.3 3 精製した試料の測定 （TLC） 精製後 17βEstradiol m/z=271、145 17βEstradiol-d3 m/z=275、145 Ethnyl Estradiol m/z=295、145 精製前 精製方法 抽出法・ｶﾗﾑ法 • 抽出法 ： 親水性成分の除去 EtOAc、EtOEt、n-Hxに溶解、食塩水で抽出 n-Hx／食塩水の組み合わせが良好 • ｶﾗﾑ法 ： 疎水性成分の除去 ｼﾘｶｹﾞﾙ、ｼﾘｶｹﾞﾙDEA、ﾌﾛﾘｼﾞﾙを比較 ﾌﾛﾘｼﾞﾙｶﾗﾑにより良好に精製 試料調整 LC/MS/MS（精製） 抽出物 Hex：塩水抽出（ボウ硝脱水） Hex/CH2Cl2＝1/1 ﾌﾛﾘｼﾞﾙｶｰﾄﾘｯｼﾞ EtOAc/ CH2Cl2＝1/19 ｼﾘｶｹﾞﾙTLC（CHCl3/ｱｾﾄﾝ＝9/1） Rf 0.35～0.55・MeOH 測定試料（MeOH・1000倍） 測定の精度 標準物質 • 2～18ng/Lの標準混合溶液 • IS：17βE2-d3 1. 2. ＊ng/L 定量性(検量線) 標準偏差(n=5) RRF R2 2ng/L 4ng/L 検出 下限* 17βE2 1.024 0.996 0.09 0.15 0.3 EE2 0.715 0.989 0.13 0.18 0.4 E2-Ac 3.944 0.999 0.16 0.17 0.5 E2-3Sul(Na) 22.346 0.995 0.24 0.22 0.7 3 標準偏差の３倍を検出下限とした、 添加回収試験 下水試料 試料 沈殿下水 放流水 添加濃度 測定値 回収率 μg/L μg/L ％ 無添加 0.03 0.05 0.05 0.08 無添加 0.03 0.0134 － 0.0565 0.0481 0.0659 (<0.001) 0.0229 － － 80.3 63.4 65.5 － 76.9 精製方法 Hx-FL TLC Hx-FL FL-TLC Hx-FL-TLC TLC TLC 実試料の測定結果 LC/MS/MS法 処理場 流入水 （μｇ/L） ７月 ８月 ９月 放流水 （μｇ/L） ７月 ８月 ９月 Ａ 0.011 0.010 0.009 <0.001 <0.001 <0.001 Ｂ 0.011 0.012 0.007 <0.001 <0.001 <0.001 Ｃ 0.014 0.008 0.011 <0.001 0.001 <0.001 Ｄ 0.015 0.007 0.013 <0.001 <0.001 <0.001 Ｅ 0.007 0.007 0.011 <0.001 <0.001 0.001 試料調整 ELISA法 試料1000ml ろ液 ろ過 SS Ｃ１８固相抽出（MeOH溶出） 超音波抽出（MeOH） 乾固 測定試料（10000倍・DMSO） 測定方法 ＥＬＩＳＡ法 ①希釈試料（20％ DMSO溶液） ②抗体結合マイクロプレート ↓←酵素標識E2、試料、E2抗体 ③抗原抗体反応（室温、2時間） ↓←洗浄、発色試薬 ④発色反応（室温、暗所、30分） ↓←反応停止薬 ⑤測定（プレートリーダー、450nm） 実試料の測定結果 ＥＬＩＳＡ 流入水 （μｇ/L） 放流水 （μｇ/L） 処理場 ７月 ８月 ９月 ７月 ８月 ９月 Ａ Ｂ 0.058 0.036 0.062 0.020 0.019 0.025 0.057 0.046 0.058 0.036 0.017 0.008 Ｃ 0.075 0.047 0.022 0.015 0.010 0.008 Ｄ 0.057 0.030 0.028 0.024 0.022 0.013 Ｅ 0.031 0.036 0.041 0.006 0.006 0.004 LC/MS/MS法（ng/L） ELISAとLC/MS/MSの比較（流 入） 20 15 10 5 0 0 20 40 ELISA法（ng/L） 60 80 LC/MS/MS法（ng/L） ELISAとLC/MS/MSの比較（流 入） 20 A B C D E 15 10 5 0 0 20 40 ＥＬＩＳＡ法(ng/L) 60 80 まとめ • • • • • LC/MS/MS法の測定方法を検討 17βE2の誘導体、抱合体も検出可 試料の精製が必要(検出下限0.3ng/L) ５処理場の流入と放流を３回測定 ＥＬＩＳＡ、LC/MS/MSを比較すると 流入は2.0～8.3倍（平均4.7倍） 放流は1ppt以下（LC/MS/MS） 今後の予定 • LC/MS/MS法の前処理法の検討 • 抱合体の測定検討 • ELISA法の測定値が高い要因の検討 • ELISA法の前処理法の検討 • 生物影響との関係把握
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